專利名稱：融合病毒樣顆粒疫苗制備及其疫苗生產(chǎn)方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用基因工程方法制備融合病毒樣顆粒疫苗及其生產(chǎn)方法和激活、提高、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的使用方法，是一種新型的蛋白亞單位疫苗制作方法及使用方法。
背景技術(shù)：
有多種方法可以預(yù)防各種病原體感染，提高機(jī)體免疫力是最主要的手段，一般是以接種疫苗而達(dá)到的。接種疫苗是預(yù)防各種病原體感染的有效措施。常見的病原體有病毒、微生物、真核細(xì)胞、寄生蟲和環(huán)境因子等有機(jī)體和分子。目前已有多種方法用來(lái)生產(chǎn)抗傳染性病原體的疫苗，如滅活疫苗，減毒活疫苗、重組疫苗，亞單位疫苗和核酸疫苗等。它們的基本作用原理是相同的，即借助與病原體結(jié)合的組織相容性蛋白激發(fā)免疫反應(yīng)，達(dá)到免疫個(gè)體不被傳染性病原體感染的目的。當(dāng)個(gè)體與傳染性病原體接觸時(shí)，其免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別病原體蛋白而產(chǎn)生有效的保護(hù)反應(yīng)抵抗傳染。目前所用的許多疫苗就是由從病原體中分離出來(lái)的非傳染性和低傳染性的蛋白或核酸物質(zhì)所組成。較為安全的疫苗有兩類，重組蛋白疫苗和核酸疫苗。
重組蛋白疫苗又稱重組亞單位苗，是指將保護(hù)性不致病的抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，再以這種生物合成的基因產(chǎn)物制成的疫苗。這種亞單位疫苗只含有產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答所必需的免疫原成分，不含免疫所不需要的成分，因此有很多優(yōu)點(diǎn)。首先是安全性好，疫苗中不含傳染性材料，接種后不會(huì)發(fā)生急性、持續(xù)或潛伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情況，如妊娠動(dòng)物。其次，這些疫苗減少或消除了常規(guī)疫苗或死疫苗難以避免的熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原和其它有害的反應(yīng)原。此外，這種疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相區(qū)別，因此更適合于疫病的控制和消滅計(jì)劃。但此類疫苗存在嚴(yán)重的不足之處，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白疫苗難以產(chǎn)生完整的免疫反應(yīng)，即不產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，包括毒性T-淋巴細(xì)胞。原因是多方面的。如1)基因片段體外表達(dá)不能提供與天然病毒一致的空間構(gòu)像，從而激活的免疫反應(yīng)效率低；2)基因重組蛋白的抗原提呈過程往往只是局限于與MHC-II型分子的結(jié)合，無(wú)法激活細(xì)胞免疫活性，從而使多數(shù)研制的基因重組疫苗達(dá)不到應(yīng)有的保護(hù)水平。目前世界上成功的基因重組疫苗是八十年代初研制的人乙肝疫苗。由于其特殊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的病毒樣顆粒，使其成為唯一上市的基因重組疫苗。另外DNA疫苗的出現(xiàn)，給疫苗的發(fā)展提供了一個(gè)新的希望。它不僅安全，方便，更重要的是，它可以激活體液和細(xì)胞雙重反應(yīng)。但是幾年的研究表明，DNA疫苗的免疫源性比減毒病毒疫苗低一些(Berzofsky，J.A.Nature Reviews，2001，1209)。所以探索更有效的方法成為今后方向。近年來(lái)，免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，空殼的病毒顆粒，即病毒樣顆粒作為免疫原，可以提高免疫效率，尤其是在重組蛋白疫苗達(dá)不到的激活毒性T-淋巴細(xì)胞活性方面，病毒樣顆粒可以通過交叉提呈方式激活毒性T-淋巴細(xì)胞活性，同時(shí)激活高強(qiáng)度的抗體水平。
病毒樣顆粒作為載體的研究近年來(lái)成為關(guān)注的方向之一，如利用VSV-G抗原(Marsac，D.，et al，2002)、HBV-S抗原(Chengalvala，M.V.et al.1999.Vaccine 171035；Netter，H.，et al.2001.J.Virol，752130)、parvovirus(Sedlik，C.，et al，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.947503)、酵母轉(zhuǎn)座子的Ty抗原等(Layton，G.，et al.，1993.J.of Immunol.1511097)。采用病毒樣顆粒有許多優(yōu)勢(shì)如1)更有效的使抗原提呈；2)非復(fù)制型，安全性好；3)不需佐劑；4)可產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是可以激活MHC-1限制性CTL反應(yīng)(Fehr，T.，et al，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.959477)。所以此技術(shù)將被看成有前景的技術(shù)。關(guān)于病毒樣顆粒如何使得抗原激活CTL活性，仍然有許多需要探討的問題。許多研究表明，納米至微米的小球結(jié)構(gòu)使得抗原提呈細(xì)胞提呈過程與可溶性蛋白不同，如內(nèi)吞(endocytic)或吞噬(phagocytic)，從而激活不同的MHC分子途徑(Lee，I.-H.et al，1996.J.Med.Virol.50145；Schirmbeck，R.1995，J.Immunology，1554676)。
雖然HBV-S抗原可以形成顆粒，并且加載在S抗原上的重組瘧疾疫苗已加入臨床試驗(yàn)(Bojang，et al.2001.Lancet 3581927)，但是S抗原顆粒所產(chǎn)生免疫反應(yīng)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于核心抗原。幾乎所有HBV感染的病人都會(huì)產(chǎn)生針對(duì)核心抗原C表位較強(qiáng)的免疫反應(yīng)(Salfeld，J.，et al，1989.J.Virol.63798)。所以將外源基因融合地表達(dá)在核心抗原中所形成的顆粒將有助于外源抗原的展示和免疫系統(tǒng)的激活(Milich，D.R.，and A.McLachlan.1986.Science 2341398)。另外的優(yōu)勢(shì)是，核心抗原分子小，只有22kd，有利于基因操作和表達(dá)(Koletzki，D.，et al，1997，J.Gen.Virol，782049)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述方向，我們有針對(duì)性的分析和篩選了可用于形成病毒樣顆粒蛋白的分子小的人乙肝病毒核心抗原為載體，使篩選的靶病毒保護(hù)性抗原基因片段融合于人乙肝病毒核心抗原C表位中使其與人乙肝病毒核心抗原共同形成病毒樣顆粒一融合型病毒樣顆粒。其靶抗原可以呈現(xiàn)其表面而提高免疫的提成，這樣不僅可以產(chǎn)生較強(qiáng)的B細(xì)胞活性，更重要的是激活T細(xì)胞和毒性T細(xì)胞活性，使其產(chǎn)生保護(hù)性免疫能力。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來(lái)達(dá)到的融合型病毒樣顆粒是通過分子克隆的方法連接入所需抗原基因序列，而得到融合產(chǎn)物。此融合產(chǎn)物經(jīng)亞克隆到大腸桿菌、酵母菌或CHO細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)載體后，表達(dá)純化而得到此病毒樣顆粒疫苗。經(jīng)有效配伍佐劑或無(wú)佐劑后，免疫動(dòng)物和人。本發(fā)明提供了該疫苗的生產(chǎn)方法和使用方法。
上述融合病毒樣顆粒疫苗是利用其中將含有抗原表位的所需抗原的基因序列連接到可形成病毒樣顆粒的基因序列中，在此融合處加入連接序列使其連接后而不影響其空間結(jié)構(gòu)和抗原表位的展示。
為了使抗原基因能在人乙肝病毒核心抗原中進(jìn)行有效地表達(dá)并且能夠展示在核心抗原之外，經(jīng)分析人乙肝病毒核心抗原結(jié)構(gòu)、序列和文獻(xiàn)得知，在氨基酸78和80位點(diǎn)暴露于顆粒的表面為主要抗原表位。所以將外來(lái)抗原克隆與此，將有利于抗原的展示和提呈。本構(gòu)建的關(guān)鍵在于利用引物設(shè)計(jì)將使讀框與多表位抗原一致，使基因在人乙肝病毒核心抗原中融合表達(dá)并展示在表面。
上述融合病毒樣顆粒疫苗利用基因工程的方法克隆已知的抗原基因，再與人乙肝病毒核心抗原進(jìn)行融合并亞克隆于T載體中后測(cè)序，序列正確后再亞克隆于表達(dá)載體中，并在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。
上述融合病毒樣顆粒疫苗是人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)而成的脫氧核糖核酸(DNA)。
上述人工合成為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法上述生物體為大腸桿菌或酵母菌或真核細(xì)胞。
上述融合病毒樣顆粒疫苗通過以下方法得到克隆于pichia p.酵母表達(dá)載體后，通過序列分析和酵母細(xì)胞中表達(dá)及抗原蛋白測(cè)定，將高表達(dá)水平的酵母克隆作為疫苗生產(chǎn)母種，經(jīng)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液和條件下，培養(yǎng)擴(kuò)增表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離和純化后，以10至2000微克/毫升ml溶于生理鹽水中或者純化后以10至2000微克/毫升ml溶于適當(dāng)佐劑溶液中，而得到所需要的疫苗免疫的組合物。
其生產(chǎn)方法，按以下步驟進(jìn)行通過序列分析和真核細(xì)胞中表達(dá)抗原及蛋白測(cè)定，將高表達(dá)水平的克隆作為疫苗生產(chǎn)母種，經(jīng)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液和條件下，培養(yǎng)擴(kuò)增表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離和純化后，以10至2000微克/毫升ml溶于生理鹽水中或者純化后以10至2000微克/毫升ml溶于適當(dāng)佐劑溶液中，而得到所需要的疫苗免疫的組合物。
其生產(chǎn)方法，按以下步驟進(jìn)行通過序列分析和原核細(xì)胞中表達(dá)抗原及蛋白測(cè)定，將高表達(dá)水平的克隆作為疫苗生產(chǎn)母種，經(jīng)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液和條件下，培養(yǎng)擴(kuò)增表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離和純化后，以10至2000微克/毫升ml溶于生理鹽水中或者純化后以10至2000微克/毫升ml溶于適當(dāng)佐劑溶液中，而得到所需要的疫苗免疫的組合物。
在上述生產(chǎn)方法中，上述生物體為大腸桿菌或或酵母菌或真核細(xì)胞。
上述人工合成為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法。
一種上述的融合型病毒樣顆粒免疫組合物的使用方法，該使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法使上述疫苗免疫的組合物進(jìn)入機(jī)體。
一種上述的融合型病毒樣顆粒疫苗免疫的組合物的使用方法，該使用方法是上述疫苗免疫的組合物是被其它物質(zhì)包裹或混合后進(jìn)入機(jī)體的。
本發(fā)明是利用融合型病毒樣顆粒接種激活機(jī)體完全免疫反應(yīng)，達(dá)到防治病原體感染、抗腫瘤、治療自主免疫疾病和清除蛋白性毒素引起的中毒癥狀等。按照本發(fā)明的融合型病毒樣顆粒可與佐劑或不與佐劑混合組成組合物進(jìn)入細(xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)而產(chǎn)生完全免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是提供融合型病毒樣顆?？梢酝ㄟ^間接提呈(crosspresentation)增強(qiáng)細(xì)胞免疫水平，同時(shí)可以激發(fā)高強(qiáng)度的抗體水平。由于在間接提呈作用下，融合型病毒樣顆粒疫苗可以激活更為強(qiáng)烈的完全免疫反應(yīng)。
本發(fā)明是通過含融合型病毒樣顆粒疫苗直接導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織來(lái)激活有效的系統(tǒng)免疫和粘膜免疫反應(yīng)抵抗外來(lái)病原體侵入。
本發(fā)明利用導(dǎo)入機(jī)體此融合型病毒樣顆粒疫苗激活機(jī)體完全免疫反應(yīng)，預(yù)防病原體傳染。抗原性物質(zhì)可以是病原體相關(guān)的蛋白，內(nèi)源性和外源性蛋白，這里所述的發(fā)明指此組合物來(lái)達(dá)到抵御攜帶抗原性物質(zhì)病原體的感染，而得到保護(hù)的目的。
本發(fā)明通過此融合型病毒樣顆粒疫苗誘發(fā)機(jī)體的免疫發(fā)反應(yīng)，識(shí)別快速增殖細(xì)胞的特異性抗原性物質(zhì)，產(chǎn)生專一性的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，清除攜帶有抗原性物質(zhì)的細(xì)胞，達(dá)到對(duì)抗細(xì)胞失調(diào)類疾病，如腫瘤、癌癥的目的。
本發(fā)明通過此融合型病毒樣顆粒疫苗誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，識(shí)別參與自主免疫反應(yīng)細(xì)胞上的特異性靶蛋白，產(chǎn)生專一性的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，清除攜帶有抗原性物質(zhì)的細(xì)胞，達(dá)到治療自主性免疫疾病的目的。
本發(fā)明通過此融合型病毒樣顆粒疫苗誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，中和具有抗原決定簇的有害蛋白，達(dá)到清除毒素作用的目的。
通過本融合型病毒樣顆粒疫苗激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生完全免疫反應(yīng)，包括體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)起重要的作用。研究已經(jīng)證實(shí)了通過此免疫方法細(xì)胞所產(chǎn)生的靶抗原在體內(nèi)的被清除。當(dāng)抗原性物質(zhì)降解成小肽，被MHC-1分子結(jié)合，遞呈到細(xì)胞表面，這種MHC-I抗原組合物能夠有效地刺激CD8T細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)(即殺傷T細(xì)胞反應(yīng))，該反應(yīng)是機(jī)體抵御病原體和清除有害細(xì)胞的關(guān)鍵。此免疫方法比單獨(dú)使用蛋白質(zhì)抗原或蛋白質(zhì)抗原加佐劑接種更能有效地產(chǎn)生特異性抗體，能有效地激發(fā)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。
因此，本融合型病毒樣顆粒疫苗比滅活的或失活的病毒疫苗、蛋白疫苗、肽類亞單位疫苗和核酸疫苗等接種方法，更為安全有效的保護(hù)機(jī)體抵御病原體感染、抗腫瘤和治療自主免疫疾病。
本融合型病毒樣顆粒疫苗能夠有效的激發(fā)完全免疫反應(yīng)，又避免使用感染性的制劑，載體和不安全的遺傳物質(zhì)。其它常規(guī)免疫接種技術(shù)(除了核酸疫苗以外)，如果不使用感染性制劑就不會(huì)激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，因此滅活或失活疫苗，亞單位疫苗接種均不產(chǎn)生完全的免疫反應(yīng)。本融合型病毒樣顆粒疫苗能有效地克服常規(guī)免疫接種技術(shù)的這些不足。
本發(fā)明針對(duì)性的致病病原體有病毒、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞。真核細(xì)胞病原體包括單細(xì)胞致病病原體和多細(xì)胞寄生蟲類。
本發(fā)明為保護(hù)機(jī)體抵抗病毒性病原體感染提供了一種有效的方法。病毒性病原體包括呼吸道病毒(冠狀病毒、流感和輪狀病毒)、瘡疹病毒(德國(guó)麻疹、水痘、牛痘、天花、帶狀瘡疹等)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒(沅病毒)、免疫系統(tǒng)病毒(艾滋病毒)、生殖系統(tǒng)病毒(尖銳濕疣)、畜牧病毒(口蹄疫病毒、豬瘟)、和一切可能的致病性病毒。
本發(fā)明的技術(shù)效果利用本發(fā)明提供的融合型病毒樣顆粒疫苗及生產(chǎn)和使用方法不僅使其疫苗能夠有效的提高激發(fā)完全免疫反應(yīng)能力保護(hù)機(jī)體抵抗病原體侵染，而且制備簡(jiǎn)單無(wú)需復(fù)雜設(shè)備和操作簡(jiǎn)單，并且易于實(shí)施，其免疫效果超過未使用本發(fā)明的疫苗。


圖1，融合型病毒樣顆?？寺》桨?。A，圖中代表了人乙肝病毒核心抗原經(jīng)連接序列與口蹄疫VP1抗原融合示意圖。其中人乙肝病毒核心抗原氨基酸1-78為a片段，VP1為b片段，人乙肝病毒核心抗原氨基酸80-144為c片段；B，是3段PCR反應(yīng)引物的位置示意圖。其中引物2、3、4和5含有連接序列序列。引物1和6含有用于克隆到載體的內(nèi)切酶位點(diǎn)。
圖2融合型病毒樣顆粒PCR擴(kuò)增。使用圖1中提到的引物對(duì)a、b和c片段分別在高溫聚合酶作用下在人乙肝病毒核心抗原和口蹄疫VP1基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行觀察拍照從圖中可看出a＝250bp、b＝600bp和c＝250bp大小三條條帶。將三條帶從凝膠中取出后混合一起，再利用引物1和6進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行觀察有1100bp和500bp的兩條帶。其中1100bp＝abc產(chǎn)物，500bp＝ac產(chǎn)物。
圖3融合型病毒樣顆粒PCR產(chǎn)物的克隆構(gòu)建。將上述PCR abc和ac產(chǎn)物分別構(gòu)建的于pMD18-T質(zhì)粒中，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和XbaI雙酶切后，得到約為2.4kb和1100bp的兩條條帶(1)，或2.4kb和500bp的兩條條帶(2)。分別代表是pMD18-T和abc產(chǎn)物及pMD18-T和ac產(chǎn)物。說明重組質(zhì)粒為已連接有融合型病毒樣顆粒。
圖4酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。為使鑒定正確的abc和ac產(chǎn)物可以在酵母中表達(dá)，將abc和ac產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和XbaI雙酶切出所需片段，再分別構(gòu)建于酵母表達(dá)質(zhì)粒superY中的EcoR I和XbaI位點(diǎn)上。重組質(zhì)粒再經(jīng)EcoR I和XbaI雙酶切，得到約為7.5kb和1100bp的兩條條帶(1)或7.5kb和500bp的兩條條帶(3)。說明重組質(zhì)粒為已連接有abc和ac產(chǎn)物的酵母表達(dá)質(zhì)粒。
圖5產(chǎn)物鑒定。收集經(jīng)酵母發(fā)酵后的上清液，在10％SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳后，經(jīng)考馬氏亮藍(lán)染色后進(jìn)行觀察，abc產(chǎn)物有56kd(3，4)和ac產(chǎn)物有42kd大小的條帶(5，6)。而對(duì)照中無(wú)任何條帶(1和2)。說明融合型病毒樣顆粒abc和病毒樣顆粒ac在酵母中表達(dá)。
圖6Western blot對(duì)產(chǎn)物鑒定。利用抗口蹄疫VP1的抗體或抗人乙肝病毒核心抗原抗體分別于轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜上反應(yīng)，在有HRP標(biāo)記的第二抗體下，使其顯色。在與抗口蹄疫VP1的抗體反應(yīng)后，56kd的abc產(chǎn)物呈現(xiàn)陽(yáng)性而42kd的ac為陰性(A)；在與抗人乙肝病毒核心抗原的抗體反應(yīng)后，abc和ac產(chǎn)物都顯陽(yáng)性(B)。從而證明酵母表達(dá)abc和ac產(chǎn)物都正確。
圖7電鏡對(duì)產(chǎn)物鑒定。圖A顯示，酵母表達(dá)ac為病毒樣顆粒，其大小為30-40nm；圖B顯示，酵母表達(dá)abc為融合型病毒樣顆粒，其大小為50-60nm，其中帶有外圈小泡結(jié)構(gòu)，而在ac中沒有。從而證明酵母表達(dá)abc為融合型病毒樣顆粒。
具體實(shí)施例方式
借助以下實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述下面這些實(shí)施實(shí)例是示范性的，而不是限制性的，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術(shù)方案和實(shí)際情況，來(lái)確定具體的實(shí)施方式。實(shí)施列1.引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)人乙肝病毒核心抗原和口蹄疫VP1的序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)出擴(kuò)增融合型病毒樣顆粒序列的6個(gè)引物。所設(shè)計(jì)的引物為引物P1序列為aagaattc ggc atg gac att gac ccg tat aaa引物P2序列為ACC TCC ACC TCC GGA ACC gtc ttc caa att act tcc c引物P3序列為GGT TCC GGA GGT GGA GGT acc acc tct gcg ggt gag引物P4序列為ACC TCC ACC TCC GGA ACC cag aag ctg ttt tgc ggg引物P5序列為GGT TCC GGA GGT GGA GGT tcc agg gaa tta gta gtc ag引物P6序列為ttgaattc tta aac aac agt agt ttc cgg aag以上引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。實(shí)施列2.融合型病毒樣顆粒序列PCR擴(kuò)增依照TaKaRa exTaq Kit操作指南進(jìn)行，PCR反應(yīng)用引物P1和P2，P5和P6對(duì)人乙肝病毒核心抗原基因擴(kuò)增，而P3和P4對(duì)口蹄疫VP1的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)為94℃5分鐘；94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，35個(gè)循環(huán)；72℃7分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2A)。將三條帶從凝膠中取出后混合一起，再利用引物P1和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)為94℃5分鐘；94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒，35個(gè)循環(huán)；72℃7分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2B)實(shí)施列3.融合型病毒樣顆粒PCR產(chǎn)物的克隆構(gòu)建將回收的abc和ac片段與pMD18T載體經(jīng)EcoRI和XbaI酶切后，在T4 DNA連接酶作用下16℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化菌落，進(jìn)行增菌培養(yǎng)，小提質(zhì)粒后用EcoRI、XbaI酶切鑒定為構(gòu)建正確的pMD18T-abc和pMD18T-ac(圖3)。實(shí)施列4.序列測(cè)定及序列分析將鑒定正確的pMD18T-abc和pMD18T-ac重組質(zhì)粒精制提純，在377全自動(dòng)測(cè)序儀上用BcaBEST primer RV-M和BcaBEST primer M13-47對(duì)abc和ac產(chǎn)物進(jìn)行雙向DNA序列測(cè)定。用PE公司SeqEdv1.0.3軟件對(duì)序列進(jìn)行分析。實(shí)施列5.酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將粒精制提純的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI切出，在瓊脂糖凝膠電泳中分離后并用試劑盒回收的含有abc和ac基因片段，將其克隆于酵母表達(dá)質(zhì)粒superY中同樣的EcoRI和NotI位點(diǎn)上，并用T4 DNA連接酶連接得到superY-abc和superY-ac。實(shí)施列6.酵母SMD1168菌轉(zhuǎn)化根據(jù)以公知的鋰鹽法(LiCl)，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。取50μl的Pichia pastorisSMD1168菌，接種于50ml YPD中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜，至OD600≈0.8-1.0(大約108細(xì)胞/ml)；收獲細(xì)胞，取1.5ml過夜培養(yǎng)物，4000xg離心5分鐘，1ml滅菌水洗，于室溫，1500xg離心10分鐘，棄上清；用1ml 100mM LiCl重懸，5000xg離心5分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清；用400μl 100mM LiCl重懸細(xì)胞。將LiCl-細(xì)胞溶液，5000xg離心5分鐘，棄上清。對(duì)于每一次轉(zhuǎn)化樣品，依次加入以下試劑240μl 50％ PEG、36μl 1M LiCl、25μl 2mg/ml單鏈DNA、10μg連接DNA用AvrII切線性化后，溶于50μl無(wú)菌水，振蕩，使沉淀完全混勻；于30℃，無(wú)搖振，孵育30分鐘，在42℃水浴休克20-25分鐘，6000-8000rpm離心1分鐘，棄上清；用1mlYPD重懸沉淀，30℃振蕩(約200rpm)培養(yǎng)3小時(shí)后，取25-100μl培養(yǎng)物涂布在YPD平板上，30℃孵育2-3天。實(shí)施列7.重組克隆的篩選質(zhì)粒線性化轉(zhuǎn)化SMD1168菌后，經(jīng)平板篩選得到相應(yīng)的重組克隆pMD18T-abc或pMD18T-ac(圖5)。實(shí)施列7.重組克隆的表達(dá)將篩選出來(lái)的重組克隆接種到10ml YPD，30℃振蕩培養(yǎng)過夜；取0.1ml的過夜培養(yǎng)液接種到含有50ml YPD的250ml的錐型瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)；第三天，取1ml表達(dá)培養(yǎng)液到1.5ml EP管中，室溫，12000rpm離心3分鐘。轉(zhuǎn)移上清到離心管，保存上清于-80℃。實(shí)施列7.SDS-PAGE檢測(cè)abc和ac產(chǎn)物在上述表達(dá)發(fā)酵后，取20μl上清在樣品變性液中100℃處理后，置于10％SDS-PAGE膠電泳，電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，并用凝膠成像系統(tǒng)照相(圖6)。實(shí)施列8.Western Blot法檢測(cè)abc和ac產(chǎn)物的正確性為進(jìn)一步鑒定上述電泳中的條帶是否是abc和ac產(chǎn)物，利用抗口蹄疫VP1的抗體或抗人乙肝病毒核心抗原的抗體與其作用將可以知道。將上述10％SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳轉(zhuǎn)分別移到兩張硝酸纖維素膜上后，利用抗口蹄疫VP1的抗體或抗人乙肝病毒核心抗原抗體分別于轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜上反應(yīng)，在有HRP標(biāo)記的第二抗體下，使其顯色。圖中可以看到在與抗口蹄疫VP1的抗體反應(yīng)后，56kd的abc產(chǎn)物呈現(xiàn)陽(yáng)性而42kd的ac為陰性(A)；在與抗人乙肝病毒核心抗原的抗體反應(yīng)后，abc和ac產(chǎn)物都顯陽(yáng)性(B)。從而證明酵母表達(dá)abc和ac產(chǎn)物都正確。實(shí)施列9.電鏡對(duì)產(chǎn)物鑒定。
為進(jìn)一步鑒定上述酵母表達(dá)abc和ac產(chǎn)物是病毒樣顆粒，利用電鏡對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行觀察是最為直接的手段。圖A顯示，酵母表達(dá)ac為病毒樣顆粒，其大小為30-40nm；圖B顯示，酵母表達(dá)abc為融合型病毒樣顆粒，其大小為50-60nm，其中帶有外圈小泡結(jié)構(gòu)，而在ac中沒有。從而證明酵母表達(dá)abc為融合型病毒樣顆粒。
權(quán)利要求
1.一種利用基因工程方法制備融合病毒樣顆粒疫苗及其生產(chǎn)方法和激活、提高、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的使用方法，是一種新型的蛋白亞單位疫苗制作方法及使用方法。
2.如權(quán)利要求1所述的融合病毒樣顆粒疫苗，其特征在于上述疫苗是人工合成融合基因再通過生物體生產(chǎn)而成的具有三維構(gòu)像的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的融合病毒樣顆粒疫苗，其特征在于上述人工合成為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。
4.如權(quán)利要求2所述的融合病毒樣顆粒疫苗，其特征在于上述生物體為大腸桿菌或酵母菌或真核細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求2所述的融合病毒樣顆粒疫苗，其特征在于上述三維構(gòu)像的蛋白質(zhì)是類似于病毒顆粒為主要特征的。
6.如權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的融合病毒樣顆粒疫苗，其特征在于該疫苗通過以下方法得到通過人工合成融合基因、分子克隆、序列分析，經(jīng)大腸桿菌或芽孢桿菌或酵母菌或真核細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增和表達(dá)后，對(duì)表達(dá)融合融合病毒樣顆粒蛋白測(cè)定，將高表達(dá)水平的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，分離純化表達(dá)產(chǎn)物。
7.一種融合病毒樣顆粒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于該生產(chǎn)方法是通過人工合成融合基因、分子克隆、序列分析，經(jīng)大腸桿菌或芽孢桿菌或酵母菌或真核細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增和表達(dá)后，對(duì)表達(dá)融合融合病毒樣顆粒蛋白測(cè)定，將高表達(dá)水平的細(xì)胞株放大培養(yǎng)，分離純化表達(dá)產(chǎn)物。制備疫苗方法為將20至2000微克/毫升ml溶于佐劑中混合，或溶于生理鹽水中，得到所需要的疫苗。
8.如權(quán)利要求6所述的融合病毒樣顆粒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于上述疫苗是人工合成的或者體外克隆的再通過生物體生產(chǎn)而成的脫氧核糖核酸重組子，再克隆于表達(dá)載體上。
9.如權(quán)利要求7所述的融合病毒樣顆粒疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于上述表達(dá)載體具有在大腸桿菌或酵母菌或真核細(xì)胞在進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)特征。
10.一種如權(quán)利要求1或2或4或5或6所述的融合病毒樣顆粒疫苗的使用方法，其特征在于該使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法使上述融合病毒樣顆粒疫苗進(jìn)入機(jī)體；或者是上述融合病毒樣顆粒疫苗是被其它物質(zhì)包裹或混合后進(jìn)入機(jī)體的。
全文摘要
一種利用基因工程方法制備融合型病毒樣顆粒和利用其制備疫苗的生產(chǎn)方法及其激活和提高機(jī)體免疫反應(yīng)的使用方法。其融合型病毒樣顆粒含有可形成病毒樣顆粒的蛋白作為載體與靶病毒保護(hù)性抗原融合而成。具體為利用形成病毒樣顆粒的人乙肝病毒核心抗原為載體，使靶病毒保護(hù)性抗原基因片段融合其中使其與人乙肝病毒核心抗原共同形成融合型病毒樣顆粒，通過與佐劑和無(wú)佐劑混合后成為疫苗。其靶抗原可以呈現(xiàn)其表面而提高免疫的提成，這樣不僅可以產(chǎn)生較強(qiáng)的B細(xì)胞活性，也可激活T細(xì)胞，使其產(chǎn)生保護(hù)性免疫力。其使用方法是注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理及化學(xué)介導(dǎo)的方法使上述疫苗進(jìn)入機(jī)體。
文檔編號(hào)C12N15/33GK1481898SQ0313725
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日
發(fā)明者王賓, 俞慶齡, 王 賓 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)