專利名稱：檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針。
(2)背景技術(shù)自1985年MuLlis等發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以來(lái)，PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于核酸研究的各個(gè)領(lǐng)域，在臨床診斷方面的應(yīng)用也日益增多。但是PCR產(chǎn)物容易造成交叉污染，從而可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，而且不能進(jìn)行基因定量檢測(cè)。1995年出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)很好地解決了PCR的定量問題，閉管操作簡(jiǎn)化了步驟，很好地避免了PCR產(chǎn)物的交叉污染，提高了檢測(cè)的特異性。
目前的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，可分為加入熒光染料嵌入DNA雙鏈和加入熒光標(biāo)記的探針兩種。前者無(wú)法區(qū)分特異和非特異PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增中引物二聚體的形成極大地降低了檢測(cè)的靈敏度，這些缺點(diǎn)限制了非探針型實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。目前常用的探針包括分子信標(biāo)、TaqMan探針、蝎子引物等。由于存在探針識(shí)別，因此增加了實(shí)驗(yàn)的可靠性，但是存在探針設(shè)計(jì)復(fù)雜，制造成本高等缺點(diǎn)。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便，能有效地保證實(shí)驗(yàn)特異性和靈敏度的檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針。
檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針包括兩條堿基數(shù)目相等且反向互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸鏈，其一端有2～6個(gè)堿基完全不匹配，兩條鏈中的一條鏈上標(biāo)記熒光劑，另一條鏈上標(biāo)記淬滅劑。
所說(shuō)的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針的兩條鏈等長(zhǎng)，一般設(shè)計(jì)為15～30個(gè)堿基，一般不超過30個(gè)堿基。標(biāo)記熒光劑的鏈與靶序列100％匹配。兩條鏈的一個(gè)末端存在堿基完全不配對(duì)，完全不匹配的堿基長(zhǎng)度最好在2～10堿基之間。探針的退火溫度一般在50～70℃之間。另外，熒光劑和淬滅劑可以標(biāo)記于探針的頂端，也可以標(biāo)記在探針的中間位置，但是最好標(biāo)記在同一對(duì)互補(bǔ)的堿基上，只有這樣才能達(dá)到最佳的淬滅效果。設(shè)計(jì)的探針內(nèi)盡量避免DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)。如果探針標(biāo)記在探針的頂端，要避免在5’端使用G，如果熒光劑和淬滅劑標(biāo)記于探針的頂端，則其另一端的堿基設(shè)計(jì)為完全不配對(duì)。
兩條寡核苷酸的反向互補(bǔ)使熒光劑和淬滅劑靠近，兩者發(fā)生能量傳遞，熒光被淬滅，此時(shí)探針不發(fā)熒光，在PCR反應(yīng)過程中，變性的高溫使探針兩條鏈分開而發(fā)出熒光；退火階段若沒有靶序列存在，探針重新形成雙鏈結(jié)構(gòu)而不發(fā)熒光。此時(shí)若有互補(bǔ)的靶序列擴(kuò)增時(shí)，由于探針的兩條鏈末端有部分堿基完全不匹配，而靶序列與熒光劑標(biāo)記鏈互補(bǔ)的堿基相對(duì)較多，形成的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，因而探針的兩條鏈分開，與靶序列形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，熒光劑發(fā)出熒光，沒有結(jié)合的多余探針仍然保持雙鏈結(jié)構(gòu)。在延伸階段由于溫度升高，探針從靶序列上解離，引物得以繼續(xù)延伸，PCR反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。
等長(zhǎng)雙鏈特異性探針存在以下優(yōu)點(diǎn)1.探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，幾乎與普通PCR引物設(shè)計(jì)相同，實(shí)驗(yàn)成功率高；2.探針制備簡(jiǎn)單，單條鏈上是單一熒光物質(zhì)的修飾，相對(duì)比較簡(jiǎn)單，為防止PCR過程中探針的延伸，必須在3’端進(jìn)行磷酸化封閉；3.特異性高，因?yàn)橹挥挟?dāng)靶序列與熒光劑標(biāo)記鏈互補(bǔ)的堿基數(shù)大于熒光劑、淬滅劑分別標(biāo)記的雙鏈的互補(bǔ)堿基數(shù)時(shí)，熒光劑標(biāo)記鏈與靶序列結(jié)合才較穩(wěn)定，從而提高核酸雜交分析的反應(yīng)特異性。如果靶序列發(fā)生突變或PCR產(chǎn)生了非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，等長(zhǎng)雙鏈特異性探針將恢復(fù)雙鏈狀態(tài)，因而不發(fā)熒光。
(4)


圖1為等長(zhǎng)雙鏈特異性探針在不同溫度條件下熒光信號(hào)的變化。在圖1中，橫坐標(biāo)為溫度T/℃，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度F。
圖2為O型口蹄疫等長(zhǎng)雙鏈熒光特異性探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。在圖2中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)Cycle，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度F。曲線1O型口蹄役陽(yáng)性；曲線2陰性對(duì)照。
圖3為兩條探針結(jié)合時(shí)熒光信號(hào)的變化。在圖3中，橫坐標(biāo)為時(shí)間t/min，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度F。曲線1加與Fam標(biāo)記探針不互補(bǔ)的3’端經(jīng)淬滅劑Dabcyl標(biāo)記的探針；曲線2加3’端經(jīng)淬滅劑Dabcyl標(biāo)記的與Fam標(biāo)記探針反向互補(bǔ)的探針。
(5)具體實(shí)施方式
1.等長(zhǎng)雙鏈特異性探針在不同溫度條件下的熒光信號(hào)的變化室溫下，等長(zhǎng)雙鏈特異性探針形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，不發(fā)熒光，在50℃之前，熒光強(qiáng)度基本保持不變，兩條鏈沒有變性，當(dāng)溫度高于50℃，熒光逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明兩條鏈逐漸解鏈，在60～70℃，熒光值迅速上升，說(shuō)明解鏈加速，達(dá)到最大值后熒光趨于平緩，之后溫度過高會(huì)使熒光強(qiáng)度下降(參見圖1)。
2.用等長(zhǎng)雙鏈特異性探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)監(jiān)測(cè)等長(zhǎng)雙鏈特異性探針用于監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)，兩條鏈的3’端都必須用磷酸基團(tuán)進(jìn)行封閉，使其不能作為引物延伸。如果PCR反應(yīng)過程中沒有擴(kuò)增序列，探針保持雙鏈結(jié)構(gòu)，不發(fā)熒光；如果有擴(kuò)增序列，由于熒光劑標(biāo)記鏈與靶序列是100％匹配，PCR退火階段探針的兩條鏈分開，熒光劑遠(yuǎn)離淬滅劑，探針發(fā)出熒光。隨著延伸階段溫度的升高，探針從擴(kuò)增片段上解離出來(lái)，引物得以延伸，保證了PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行。通過在PCR反應(yīng)過程的復(fù)性階段檢測(cè)熒光的變化，可以在PCR的每個(gè)循環(huán)動(dòng)態(tài)地檢測(cè)目的片段的有無(wú)，并進(jìn)行定量(參見圖2)。
以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例1兩條探針結(jié)合時(shí)熒光信號(hào)的變化在20μL的反應(yīng)體系中，加入2.5mM MgCl2，10×PCR緩沖液和5’端經(jīng)Fam標(biāo)記的探針0.8μM，在室溫下測(cè)定熒光強(qiáng)度2min，加3’端經(jīng)淬滅劑Dabcyl標(biāo)記的與上述Fam標(biāo)記探針反向互補(bǔ)的探針，另一管中加與Fam標(biāo)記探針不互補(bǔ)的3’端經(jīng)淬滅劑Dabcyl標(biāo)記的探針各1.0μM，每10s測(cè)定一次熒光強(qiáng)度(參見圖3)。兩探針由上海博亞公司合成，序列為Fam-5’CCCTTCTCAGATCCCGAGTGTC3’；5’CTGTGTCGGGATCTGAGAAGGGG3’-Dabcyl；5’AACGCTGAAGGGCATCCTTAG 3’-Dubcyl。結(jié)果表明在含標(biāo)記熒光劑的體系中，只有加入了堿基序列互補(bǔ)的標(biāo)記淬滅劑的寡核苷酸鏈時(shí)，兩條鏈才會(huì)發(fā)生復(fù)性反應(yīng)，熒光被淬滅，而末端有2～6個(gè)堿基完全不匹配不影響復(fù)性反應(yīng)。加入無(wú)關(guān)序列，由于兩條鏈不能結(jié)合發(fā)生復(fù)性反應(yīng)，因而熒光無(wú)法被淬滅。
實(shí)施例2等長(zhǎng)雙鏈熒光特異性探針在不同溫度下熒光強(qiáng)度的變化在20μL的反應(yīng)體系中，加入2.5mM MgCl2，10×PCR緩沖液和5‘端經(jīng)Fam標(biāo)記的探針0.2μM，3’端經(jīng)淬滅劑Dabcyl標(biāo)記的與上述Fam標(biāo)記探針反向互補(bǔ)的探針0.25μM，兩探針由上海博亞公司合成，序列為Fam-5’CCCTTCTCAGATCCCGAGTGT C3’；5’CTGTGTCGGGATCTGAGAAGGGG 3’-Dabcyl；混合均勻后室溫放置5min，待兩條鏈充分復(fù)性后置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀上，從40℃開始，每隔5s升高1℃，每度均采集熒光信號(hào)。如圖1所示，室溫下，等長(zhǎng)雙鏈特異性探針形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，不發(fā)熒光，在50℃之前，熒光強(qiáng)度基本保持不變，兩條鏈沒有變性，當(dāng)溫度高于50℃，熒光逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明兩條鏈逐漸解鏈，在60～70℃，熒光值迅速上升，說(shuō)明解鏈加速，達(dá)到最大值后熒光趨于平緩，之后溫度過高使熒光強(qiáng)度下降。
實(shí)施例3等長(zhǎng)雙鏈熒光特異性探針用于O型口蹄疫實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)
采用Trizol法提取口蹄疫病毒的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)所用引物和探針均由上海博亞公司合成。引物序列為5’ACCAATCCAACGGCGTACCACAA3’；5’GTGGCTTTGATGGCACCGTAGTT3’所用探針為等長(zhǎng)雙鏈熒光特異性探針，序列為FAM-5’ACTGTTTACAACGGGAACTGCAA 3’；5’AACGTGTTCCCGTTGTAAACAGT 3’-DABCYL。
PCR反應(yīng)總體積為20μL，內(nèi)含2.5mM MgCl2，10×PCR緩沖液，1.8U Taq酶，250μMdNTP，引物總濃度均為0.4μM，F(xiàn)am標(biāo)記探針0.2μM，Dabcyl標(biāo)記探針0.25μM，經(jīng)94℃預(yù)變性10min，再94℃變性30s，50℃ 30s，72℃ 30s，45個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)強(qiáng)度在退火階段采集。結(jié)果如圖2所示。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，其特征在于包括兩條堿基數(shù)目相等且反向互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸鏈，所說(shuō)的兩條鏈等長(zhǎng)，末端有2～6個(gè)堿基完全不匹配，在其中的一條鏈上標(biāo)記熒光劑，另一條鏈上標(biāo)記淬滅劑。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，其特征在于所說(shuō)的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針的兩條鏈設(shè)計(jì)應(yīng)超過15個(gè)堿基。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，其特征在于標(biāo)記熒光劑的鏈與靶序列100％匹配。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，其特征在于兩條鏈在末端存在堿基完全不配對(duì)，完全不匹配的堿基長(zhǎng)度為2～10個(gè)堿基。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，其特征在于熒光劑和淬滅劑標(biāo)記于探針的頂端，或標(biāo)記在探針的中間位置。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，其特征在于熒光劑和淬滅劑標(biāo)記于兩條鏈互補(bǔ)堿基附近的幾個(gè)堿基上。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，其特征在于熒光劑和淬滅劑標(biāo)記在同一對(duì)互補(bǔ)的堿基上。
8.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針，其特征在于探針的兩條鏈3’端用化學(xué)基團(tuán)封閉，使其不能作為引物延伸。
全文摘要
涉及一種檢測(cè)核酸的等長(zhǎng)雙鏈特異性探針。包括兩條堿基數(shù)目相等且反向互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸鏈，兩條鏈等長(zhǎng)，末端有2～6個(gè)堿基完全不匹配，兩條鏈上分別標(biāo)記熒光劑和淬滅劑。其優(yōu)點(diǎn)是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，幾乎與普通PCR引物設(shè)計(jì)相同，實(shí)驗(yàn)成功率高；制備簡(jiǎn)單，單條鏈上是單一熒光物質(zhì)的修飾，為防止PCR過程中探針的延伸，必須在3’端進(jìn)行磷酸化封閉；特異性高，因?yàn)橹挥挟?dāng)靶序列與熒光劑標(biāo)記鏈互補(bǔ)的堿基數(shù)大于熒光劑、淬滅劑分別標(biāo)記的雙鏈的互補(bǔ)堿基數(shù)時(shí)，熒光劑標(biāo)記鏈與靶序列結(jié)合才較穩(wěn)定，提高核酸雜交分析的反應(yīng)特異性。如果靶序列發(fā)生突變或PCR產(chǎn)生了非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，探針將恢復(fù)雙鏈狀態(tài)，不發(fā)熒光。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1570137SQ0313293
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月22日
發(fā)明者陳亮, 邵寒娟, 王宇, 林濤, 郭小玲 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)