專利名稱：一種具有免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞功能的組合物及其制備方法、用途和質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞功能的組合物，及其制備方法、用途和質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
一般人體在兩種狀態(tài)下容易得病，一是人體對外界環(huán)境適應(yīng)力下降，機(jī)體處于疲勞及虛弱狀態(tài)，一是受到外界環(huán)境如病原體的侵害，免疫機(jī)能下降。而傳統(tǒng)的預(yù)防疾病的方法只是單純服用滋補(bǔ)藥物以提高機(jī)體狀況，增強(qiáng)對環(huán)境的適應(yīng)能力，或提高機(jī)體的免疫能力，以提高人體抗病能力。
西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefolium L.的干燥根，被譽為“扶正固本”及“適應(yīng)原樣藥物”的代表，對一般機(jī)體可起滋補(bǔ)強(qiáng)壯作用，增強(qiáng)抗病能力，患病機(jī)體出現(xiàn)生理功能紊亂和失調(diào)時，它具有調(diào)整及治療作用。西洋參在我國自古被奉為保健上品，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對西洋參的研究表明西洋參具有明顯的抗疲勞和免疫增強(qiáng)作用。
松果菊為菊科植物紫花松果菊Echinacea purpurea的干燥全草，又名紫錐菊，是美洲和歐洲近年來銷量最大的藥用植物之一，具有明顯的免疫促進(jìn)和免疫調(diào)節(jié)作用。在歐美，歷史上將紫錐菊做為血液清潔劑及免疫增強(qiáng)劑而廣泛應(yīng)用，并用于治療蛇毒、免疫力低下、白細(xì)胞減少及各類炎癥，多用于預(yù)防感冒及流行性感冒?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，紫錐菊可對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生許多非特異性效應(yīng)，如可激活補(bǔ)體替代途徑，提高白細(xì)胞的數(shù)量并增強(qiáng)白細(xì)胞的活性，促進(jìn)非特異性T—細(xì)胞的活化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力等，因而具有明顯的提高機(jī)體免疫功能的作用。在歐美人們經(jīng)常服用紫錐菊以預(yù)防疾病和增強(qiáng)體質(zhì)。
但是，紫錐菊沒有抗疲勞和適應(yīng)原樣作用，所以它對體質(zhì)虛弱的人只能起到輔助而片面的作用。而加入西洋參就可以有效地提高人體對外界環(huán)境變化的應(yīng)激能力，增強(qiáng)對環(huán)境的適應(yīng)能力，有效地消除機(jī)體的虛弱狀態(tài)和提高人體素質(zhì)，所以兩種植物配合使用，可以在功能上有協(xié)調(diào)作用，而更好的發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞功能。

發(fā)明內(nèi)容
本申請就是將西洋參與紫錐菊配伍，提供一種能同時發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞功能的組合物。通過研究，還進(jìn)一步制定了本產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。
產(chǎn)品的原料組成及制備工藝西洋參總皂甙類粗提物1-2份，紫錐菊40-70％乙醇提取物3-5份，產(chǎn)品原料的優(yōu)選配比為西洋參總皂甙類粗提物1份，紫錐菊40-70％乙醇提取物3.5份，優(yōu)選使用紫錐菊50％乙醇提取物。
本產(chǎn)品可以制成藥劑學(xué)的任意劑型，如片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液，優(yōu)選劑型為軟膠囊。
對于軟膠囊，其原輔料配方如下西洋參總皂甙類粗提物 1-2份紫錐菊40-70％乙醇提取物 3-5份，聚乙二醇400 5-10份甘油 1-3份大豆色拉油 1-3份水1-3份其中聚乙二醇400、甘油、大豆色拉油可以用其他相應(yīng)的藥劑學(xué)可接受的輔料代替。
產(chǎn)品及原料的質(zhì)量控制方法本方法適用于以西洋參、紫錐菊或西洋參總皂甙類提取物、紫錐菊乙醇提取物為原料制成的組合物的質(zhì)量控制。
一、組合物中功效成分總皂甙、人參皂甙Rb1的含量測定1.分光光度法測定組合物中人參皂甙的含量西洋參中所含人參皂甙，經(jīng)大孔吸附樹脂預(yù)處理小柱凈化，在酸性條件下與香草醛發(fā)生反應(yīng)，用分光光度法進(jìn)行定量。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定取人參皂甙Re標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)溶液不同體積，分別用70％乙醇定容至1.0ml，精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，搖勻，置60℃±1℃水浴中加熱顯色至顏色相對穩(wěn)定時，取出立即放入冰浴中冷卻，比色，于544nm處測定吸收度，以吸收度對濃度回歸得回歸方程。
樣品的測定取組合物適量，精密稱取，以適量水提取，再定容至100ml備用，取此樣品溶液0.5-1ml，過大孔樹脂柱(該柱已用丙酮，水淋洗凈化)，用70％乙醇洗脫人參總皂甙，收集洗脫液，待用。
將上述洗脫液精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，搖勻，置60℃±1℃水浴中加熱，顯色穩(wěn)定后取出立即放入冰浴中冷卻，比色，于544nm處測定吸收度，以回歸方程計算以人參皂甙Re計的人參皂甙含量。
2.高效液相法測定產(chǎn)品中的人參皂甙Rb1的含量采用高效液相色譜法可將人參皂甙Rb1與其它成分分離而定量。人參皂甙Rb1在203nm處有吸收峰，可對Rb1進(jìn)行定量測定。
色譜條件色譜柱ODS柱(5m，4.6×250nm)；流動相乙腈-0.05％磷酸溶液(99∶400)，流速1ml/min，檢測波長203nm。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定精密稱取人參皂甙Rb1對照品10.0mg，用流動相溶解并定容至10ml容量瓶中，即為對照品溶液。分別吸取對照品溶液不同體積進(jìn)樣，測定得到峰面積的數(shù)據(jù)，以峰面積對濃度回歸得回歸方程。
樣品的測定精密稱取組合物適量，用水溶解，取水溶液過濾，濾液適量，用水飽和的正丁醇萃取，合并正丁醇相，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，濾過，濾液用甲醇定容，過0.35-0.50μm的微孔濾膜，精密吸取適量，注入液相色譜儀中，在203nm測定峰面積的數(shù)據(jù)，按回歸方程計算樣品中人參皂甙Rb1的含量。
二、對組合物中紫錐菊的定性鑒別對紫錐菊的化學(xué)成分及藥理研究表明，紫錐菊含有多糖、咖啡酸衍生物、揮發(fā)油、多聚乙炔、烷基酰胺等成分，但任何一種單一成分或組分的保健作用均不明顯，而各組分的協(xié)同作用卻很強(qiáng)，所以目前紫錐菊的功效成分還無法確定。在國外有些生產(chǎn)紫錐菊制劑的公司將菊苣酸作為紫錐菊的指標(biāo)成分，但菊苣酸很不穩(wěn)定，目前又沒有市售標(biāo)準(zhǔn)品，因此現(xiàn)在無法對紫錐菊進(jìn)行定量測定。但我們對紫錐菊進(jìn)行了定性鑒別，以監(jiān)控含有紫錐菊提取物產(chǎn)品的質(zhì)量。
紫錐菊中含多糖類成分菊糖，菊糖是菊科植物的特征性成分之一，該成分與α-萘酚、濃硫酸反應(yīng)可以生成紫色化合物而顯色，用以檢驗菊科植物。
紫錐菊中含有多種咖啡酰類衍生物，其中咖啡酸、綠原酸是其成分組成。在天然植物中，絕大多數(shù)植物或只含有咖啡酸，或只含有綠原酸，同時含有這兩種成分的植物還未見報道，所以可同時用這兩種成分對紫錐菊進(jìn)行定性鑒別，以突出其特征性。紫錐菊中的咖啡酸、綠原酸，經(jīng)薄層色譜分離后，用碘顯色，在與對照品對應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
使用此兩種方法可對紫錐菊提取物進(jìn)行定性鑒別。
1.紫錐菊的顏色反應(yīng)取組合物適量，以水提取，吸取水溶液適量置于試管中。加α-萘酚乙醇溶液3滴，搖勻后沿管壁緩緩加入濃硫酸1ml，在硫酸層和供試液層之間界面處出現(xiàn)明顯的紫紅色環(huán)。
2.紫錐菊的薄層層析取組合物適量，以水提取，取水溶液適量，濾過，以氯仿萃取，棄去氯仿液，水層用稀鹽酸溶液調(diào)至pH3.0，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收乙酸乙酯至干，殘渣用甲醇適量溶解，即為供試品溶液。制備咖啡酸、綠原酸濃度為1.0-2.0mg/ml的甲醇溶液作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各適量，點于硅膠G的薄層上，以乙酸乙酯-甲酸-水(10∶1∶9)的下層溶液展開，取出，揮去展開劑，以碘顯色，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，為樣品中檢出的咖啡酸和綠原酸。
1、2兩種定性鑒別方法同樣適于對紫錐菊的醇提取物進(jìn)行定性鑒別。
三、紫錐菊原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，應(yīng)對原料質(zhì)量進(jìn)行控制。對原料西洋參的質(zhì)量控制采用已有的方法和標(biāo)準(zhǔn)即可，對原料紫錐菊可以采用以下定性方法進(jìn)行控制。
1、取紫錐菊粉末適量，加60-75％乙醇振搖后放置數(shù)小時，濾過，取濾液2ml，加1％試液1～2滴，即產(chǎn)生深藍(lán)色沉淀。
2、取上述濾液1ml，置于試管內(nèi)，加α-茶酚乙醇溶液3滴，搖勻后沿管壁緩緩加入濃硫酸1ml在硫酸層和供試液層之間界面處出現(xiàn)明顯的紫紅色環(huán)。
3、取紫錐菊粉末適量，加水提取，濾過，取濾液5ml，加乙醇使含醇量達(dá)70-80％，振搖，靜置，濾過，用70-80％乙醇適量洗滌沉淀，取適量沉淀物，用水溶解，加鹽酸少量，沸水浴加熱20-30分鐘后用氫氧化鈉試液調(diào)pH＞7，加Fehling溶液少量，沸水浴上加熱數(shù)分鐘，即產(chǎn)生磚紅色沉淀。
4、薄層色譜鑒別取紫錐菊粉末適量，用60-75％乙醇溶液提取，置75-85℃水浴上濃縮至小體積，用吸管取出，定容至1ml，即為樣品液，另取紫錐菊對照藥材1.0克，同法操作制備對照品溶液。取上述兩種溶液各適量，分別點于硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(5∶5∶1)混合液展開，待展開劑展至板前沿時取出，使展開劑自然揮干。在紫外光燈(365nm)下觀察層析板，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點。
方法1、4兩種定性鑒別方法同樣適于對紫錐菊的醇提取物及含紫錐菊醇提取物的組合物進(jìn)行定性鑒別。
在定性鑒別和含量測定中所述的提取可以是加熱回流、超聲波提取。
具體實施方案(一).制備該組合物軟膠囊取西洋參原料粉碎成粗粉，加入8倍量70％乙醇加熱回流提取三次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至無醇昧，加入20倍量去離子水稀釋，濾過，濾液上D101大孔吸附樹脂，先用去離子水洗脫至無多糖反應(yīng)，然后用70％乙醇洗脫至無皂甙反應(yīng)為止，將70％乙醇洗脫液減壓濃縮，濃縮液噴粉干燥，即為西洋參提取物，備用。
將紫錐菊全草置于粉碎機(jī)上粉碎成粗粉，加入8倍量的50％乙醇加熱回流提取2小時，濾過，濾液備用，殘渣繼續(xù)用6倍量50％的乙醇提取2次，每次2小時，濾過，合并濾液，濾液胃減壓濃縮罐中減壓濃縮，噴粉干燥，即得紫錐菊提取物原粉，備用。
按以下配方備料西洋參提取物 6.4g紫錐菊提取物 21.3g聚乙二醇400 42.6g
甘油8.5g大豆色拉油 10.6g水 10.6g原輔料總量為100g，制成100粒膠囊，每粒膠囊凈含量為1g。
按以上比例稱取紫錐菊提取物、西洋參提取物，混合均勻，置攪拌機(jī)器中，開動攪拌機(jī)，緩慢加入聚乙二醇400混合均勻，再逐步加入甘油和食用油，混合均勻后再加入去離子水，迅速攪拌混合均勻，用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)，即為軟膠囊內(nèi)容物。
以明膠、甘油和水制成軟膠囊囊皮，將軟膠囊內(nèi)容物置軟膠囊灌裝機(jī)中灌裝，每粒調(diào)整為含內(nèi)容物1.0g的軟膠囊，將軟膠囊置干燥箱中干燥后，壓入鋁塑包裝中，每板10粒。
產(chǎn)品的功效成份及含量每100g中含紫錐菊提取物21.3g，總皂甙4270mg人參皂甙Rb1 480mg保健功能免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞適宜人群免疫力低下者、易疲勞者不適宜人群少年兒童食用方法及食用量每日2-3次，每次2粒規(guī)格1g/粒(二).該組合物軟膠囊中某些成分或組分的定性鑒別及含量測定產(chǎn)品中功效成分總皂甙、人參皂甙Rb1的含量應(yīng)符合以下規(guī)定總皂甙(以人參皂Re計)≥40000mg/kg；人參皂甙Rb1≥4000mg/kg。
1.分光光度法測定產(chǎn)品中的人參皂甙含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定取人參皂甙Re標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、20、40、60、80、100μl(相當(dāng)于0、20、40、60、80、100g)，分別用70％乙醇定容至1.0ml，精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，搖勻，置60℃±1℃水浴中加熱10分鐘，取出立即放入冰浴中冷卻15分鐘，用1cm比色皿進(jìn)行比色，于544nm處測定吸收度，以吸收度對濃度回歸得回歸方程。
樣品的測定取樣品5粒，取出內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取內(nèi)容物0.5g，置100ml容量瓶中，加50ml水溶解，超聲波振蕩提取20min，再定容至100ml備用，此為待測樣品溶液。
取上述樣品溶液0.5ml，過大孔樹脂柱(該柱已用丙酮，水淋洗凈化)，樣液完全通過后，用2.5ml水，分4次淋洗柱子，用吸耳球吹去水份，用70％乙醇1.0ml洗脫人參總皂甙，收集洗脫液，待用。
將上述洗脫液精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，搖勻，置60℃±1℃水浴中加熱10分鐘，取出立即放入冰浴中冷卻15分鐘，用1cm比色皿進(jìn)行比色，于544nm處測定吸收度，以回歸方程計算含量。
含量范圍每克膠囊內(nèi)容物中，總皂甙的含量≥42.7mg。
2.高效液相法測定產(chǎn)品中的人參皂甙Rb1的含量色譜條件色譜柱ODS柱(5m，4.6×250nm)；流動相乙腈-0.05％磷酸溶液(99∶400)，流速1ml/min，檢測波長203nm。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定精密稱取人參皂甙Rb1對照品10.0mg，用流動相溶解并定容至10ml容量瓶中，即為對照品溶液。分別吸取對照品溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl進(jìn)樣，測定得到峰面積的數(shù)據(jù)，以峰面積對濃度回歸得回歸方程。
樣品的測定取樣品5粒，取出內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取內(nèi)容物0.5g，置10ml容量瓶中，用水溶解，并定容，吸取下層水相，過濾，取濾液5ml，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10ml，合并正丁醇相，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，濾過，濾液置10ml容量瓶中，用甲醇定容，過0.45μm的微孔濾膜，精密吸取20μl，注入液相色譜儀中，測定，按回歸方程計算樣品中人參皂甙Rb1的含量。
含量范圍每克膠囊內(nèi)容物中人參皂甙Rb1的含量≥54.8mg。
3.膠囊中紫錐菊提取物的定性鑒別(1).紫錐菊的顏色反應(yīng)取1粒膠囊的內(nèi)容物，置試管中，加水10ml，70℃加熱提取10分鐘，吸取下層溶液2ml置于試管中。加α-萘酚乙醇溶液3滴，搖勻后沿管壁緩緩加入濃硫酸1ml，在硫酸層和供試液層之間界面處出現(xiàn)明顯的紫紅色環(huán)。
(2).紫錐菊的薄層層析取樣品10粒，取出內(nèi)容物，稱取5.0g，用50ml去離子水加熱提取，取下層溶液40ml，濾過，置分液漏斗中，用氯仿萃取3次，每次20ml，棄去氯仿液，水層用稀鹽酸溶液(1-3ml)調(diào)pH3.0，再用乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，減壓回收乙酸乙酯至干，殘渣用甲醇2ml溶解，即為供試品溶液。分別制備咖啡酸、綠原酸濃度為2.0mg/ml的甲醇溶液作為對照品溶液。以樣品液20μl，對照品溶液各10μl，點于硅膠G的薄層上，以乙酸乙酯-甲酸-水(10∶1∶9)的下層溶液10ml展開，取出，揮去展開劑，以碘顯色，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，為樣品中檢出的咖啡酸和綠原酸。
(三)、紫錐菊的定性鑒別1、取紫錐菊粉末0.5g，置三角瓶中，加70％乙醇30ml，振搖后放置8小時，濾過，得供試濾液，取濾液2ml，置試管中，加1％二氯化鐵試液1～2滴，即產(chǎn)生深藍(lán)色沉淀。
2、取上述濾液1ml，置于試管內(nèi)，加α-茶酚乙醇溶液3滴，搖勻后沿管壁緩緩加入濃硫酸1ml在硫酸層和供試液層之間界面處出現(xiàn)明顯的紫紅色環(huán)。
3、取本品粉末1g，置圓底燒瓶中，加水50ml熱回流1小時，濾過，取濾液5ml，加乙醇使含醇量達(dá)80％，振搖，靜置20分鐘，濾過，用80％L醇洗滌沉淀，取適量沉淀物，用水溶解，加鹽酸少量，沸水浴加熱30分鐘后用氫氧化鈉試液調(diào)pH＞7，加Fehling溶液少量，沸水浴上加熱數(shù)分鐘，即產(chǎn)生磚紅色沉淀。
4、薄層色譜鑒別取本品粉末1.0克，用70％乙醇溶液回流提取，置75-85℃水浴上濃縮至約1ml，用吸管取出，定容至1ml，即為樣品液，另取對照藥材1.0克，同法操作制備對照品溶液。取上述兩種溶液各20μl，分別點于硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(5∶5∶1)混合液展開，待展開劑展至板前沿時取出，使展開劑自然揮干。在紫外光燈(365nm)下觀察層析板，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點。
組合物抗疲勞作用試驗報告1.材料和方法1.1樣品該組合物軟膠囊(按本申請所述方法制備)。
1.2實驗動物選用中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供的昆明種雄性小鼠(批準(zhǔn)號遼實動第007號)，體重18-22g。
1.3劑量選擇廠家推薦成人(體重以60kg計)攝入定型產(chǎn)品量為6.0g/60kg.bw.d，以廠家最低日推薦成人攝入量的10、20、和30倍設(shè)置灌胃劑量，即1.0、2.0、3.0s/kg.bw.d，各劑量組以蒸餾水稀釋，蒸餾水作空白對照，各劑量組小鼠灌胃量為0.2mL/10g.bw.d，連續(xù)灌胃30天。
1.4實驗方法1.4.1負(fù)重游泳試驗?zāi)┐谓o予受試物30min后，置小鼠在游泳箱中游泳，水深約30cm，水溫(25±0.5)℃，鼠尾根部負(fù)荷5％體重的鉛皮。記錄小鼠自游泳開始至死亡時間，作為小鼠游泳時間(min)。
1.4.2血清尿素氮測定末次給予受試物30min后，在溫度為(30±0.5)℃的水中游泳90min，摘眼球采血，進(jìn)行尿素氮含量測定(試劑盒北京中生生物工程高技術(shù)公司衛(wèi)藥準(zhǔn)字D-81-8號)。
1.4.3肝糖原測定末次給予受試物30min后處死小鼠取肝臟，經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟75mg，每管加入225μL試劑盒提供的堿溶液，用簿膜封住管口，扎一透氣孔，沸水浴20分，冷卻斤加入7.2mL蒸餾水，充分混勻，按試劑說明書操作，(試劑盒南京市建成生物工程研究所提供)，用722分光光度汁在620nm波長進(jìn)行比色測定，按說明書提供的公式換算肝糖原。
1.4.4血乳酸測定末次給予受試物30min后采血20μL，再在溫度為(30±0.5)℃的水中游泳10min，分別于游泳后立即(游泳后0min)和游泳后休息30min各采血20μL，采用山東省科學(xué)院生物研究所生產(chǎn)的生物傳感分析儀測定以上三個時間點的血乳酸值。(溶血劑及測定液均由該所提供)。
1.5實驗數(shù)據(jù)用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。
2.結(jié)果2.1該組合物對小鼠負(fù)重游泳時間及小鼠體重的影響表1.該組合物對小鼠負(fù)重游泳時間及小鼠體重的影響劑量組動物數(shù)始重 終重增重游泳時間Pp(g/kg.bw) (只) (g) (g) (g) (min)空白對照10 19.6±1.132.9±3.7 13.4±3.5---4.02±3.77---1.0 10 19.1±1.031.8±3.5 12.7±3.3 0.6110 5.27±2.17 0.54302.0 10 19.4±0.831.7±2.6 12.4±2.5 0.4660 10.66±6.36ΔΔ 0.00243.0 10 19.2±1.132.2±3.5 13.0±3.1 0.7380 6.34±4.80 0.2620p各實驗組與空白對照組比較ΔΔ與空白對照組比較P＜0.01由表1可見，經(jīng)口給予該組合物30天，各劑量組小鼠增重與空白對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)，中劑量組游泳時間長于空白對照組，且差異有極顯著性(P＜0.01)，說明該組合物能延長小鼠負(fù)重游泳時間而對小鼠增重?zé)o影響。
2.2該組合物對小鼠血清尿素氮及小鼠體重的影響表2.該組合物對小鼠游泳后血清尿素氮及小鼠體重的影響劑量組 動物數(shù) 始重 終重 增重 血清尿素氮Pp(g/kg.bw) (只) (g) (g) (g) (moL/L)空白對照 1019.2±1.2 32.2±1.6 13.1±2.3 ---9.35±1.22---1.01019.8±1.4 31.9±2.3 12.1±2.7 0.3830 7.07±0.86ΔΔ 0.00002.01019.8±1.3 32.9±1.7 13.0±2.5 0.9390 6.30±0.67ΔΔ 0.00003.01019.3±1.1 31.8±1.1 12.6±2.8 0.6640 5.99±0.69ΔΔ 0.0000p值各實驗組與空白對照組比較ΔΔ與空白對照組相比P＜0.01由表2可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，各劑量組小鼠增重與空白對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)，高、中、低劑量組小鼠游泳后血清尿素氮均低于空白對照組，且與空白對照組比較差異有高度顯著性差異(P＜0.01)，說明該組合物具有抑制小鼠游泳后血清尿素氮的升高的作用而對小鼠增重?zé)o影響。
2.3該組合物對小鼠肝糖原含量及小鼠體重的影響表3.該組合物對小鼠肝糖原含量及小鼠體重的影響劑量組 動物數(shù) 始重 終重 增重 肝糖原P p(g/kg.bw) (只) (g) (g) (g) (mg/g肝組織)空白對照 10 20.0±1.332.7±3.412.7±2.8 ---45.31±11.33 ---1.010 18.9±0.831.7±3.212.8±3.1 0.9940 42.10±7.85 0.45302.010 19.8±1.132.7±2.813.0±2.8 0.7550 46.43±9.41 0.79103.010 19.5±1.132.3±2.612.8±2.8 0.9300 44.65±8.82 0.8770p值為實驗組與空白對照組比較由表3可見、經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，各劑量組小鼠增重與空白對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)，各劑量組肝糖原含量與空白對照組相比差異未見有顯著性(P＞0.05)，說明該組合物對肝糖原儲備的作用及小鼠體重均未見影響。
2.4該組合物對小鼠血乳酸值及小鼠體重的影響表4.該組合物對小鼠游泳后血乳酸升高值*及小鼠體重的影響劑量組 動物數(shù) 始重 終重 增重 游泳前 游泳后Omin 升高值P p(g/kg.bw)(只) (g)(g)(g) (mmoL/L)(mmoL/L)(mmoL/L)空白對照 1019.5±1.2 32.3±2.6 12.8±2.5 ---3.2±1.34.8±0.81.5±1.0 ---1.0 1019.6±1.1 31.9±3.2 12.3±3.6 0.7570 3.1±1.04.0±0.90.9±0.5Δ 0.03952.0 1019.6±1.2 32.4±3.9 12.8±3.1 0.9940 2.9±1.03.7±0.60.8±0.4Δ 0.01113.0 1019.0±1.0 31.5±3.4 12.4±3.3 0.817 3.2±1.14.2±0.71.0±0.50.0556*升高值游泳后立即(游泳后0min)采血的血乳酸測定值與游泳前血乳酸測定值的差值p值各實驗組與空白對照組比較Δ與空白對照組相比P＜0.05由表4可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，各劑量組小鼠增重與空白對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)，中、低劑量組小鼠游泳后血乳酸的升高值均低于空白對照組，且與空白對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，說明該組合物能減少游泳時血乳酸的產(chǎn)生而對小鼠增重?zé)o影響。
表5.該組合物對小鼠游泳后休息30min血乳酸降低值*的影響劑量組 動物數(shù) 游泳后0min 休息30min 降低值(差值)p(g/kg.bw)(只) (mmoL/L)(mmoL/L)(mmoL/L)空白對照 104.8±0.83.5±1.11.2±1.0 --1.0 104.0±0.93.0±1.01.0±0.30.29602.0 103.7±0.62.9±0.60.8±0.30.10803.0 104.2±0.73.4±0.40.9±0.40.1660*降低值游泳后立即(游泳后0min)采血測定血乳酸的值與游泳后休息30min采血測定血乳酸值的差。
p值各實驗組與空白對照組比較由表5可見，游泳后休息30min血乳酸的降低值，高、中、低劑量組與空白對照組相比無顯著性差異(p＞0.05)，說明該組合物對血乳酸降低值未見影響。
3小結(jié)經(jīng)口給予小鼠該組合物1.0、2.0、3.0g/kg.bw.d，連續(xù)灌胃30大，能延長小鼠負(fù)重游泳時間，減少小鼠游泳時血清尿素氮的產(chǎn)生，減少游泳時血乳酸的產(chǎn)生。由此判定該組合物具有抗疲勞作用。
該組合物免疫調(diào)節(jié)作用實驗報告1.材料與方法1.1樣品該組合物膠囊。
1.2實驗動物選用白求恩醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物部提供的昆明種小鼠(批準(zhǔn)號醫(yī)動字第10-5107)。選健康雄性小鼠48只，體重18-22g，分為4組，每組12只，作為免疫一組，進(jìn)行臟器/體重比值測定、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗、半數(shù)溶血值(HC50)的測定和抗體生成細(xì)胞檢測昆明種健康雌性小鼠48只，體重18-22g，分為4組，每組12只，作為免疫二組，進(jìn)行碳廓清實驗昆明種健康雄性小鼠48只，體重18-22g，分為4組，每組12只，作為免疫三組，進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗和NK細(xì)胞活性測定。
1.3劑量選擇該組合物廠家推薦量為每人(成人)每日6.0g，成人體重按60kg計，則每人(成人)每日6.0g/60kg體重，即0.10g/kg體重。以人體推薦量的10倍，即每日1.0g/kg體重作為小鼠的中劑量，上、下各設(shè)一個劑量組3.0g/kg體重作為高劑量，為人體推薦量的30倍，0.10g/kg體重作為低劑量，為人體推薦量。各劑量組受試物以蒸餾水配制，空白對照約以蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃30天后測各項免疫指標(biāo)。
1.4實驗方法1.4.1臟器/體重比值測定小鼠稱正后脫臼處死，取脾臟和胸腺，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計算脾臟/體重比值和胸腺/體重比值。
1.4.2遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法DTH)取羊血，生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射2％(V/V，用生理鹽水配制)壓積SRBC(2000tr/min，10min)0.2mL，致敏后4天，測量左后足跖部厚度，同一部位測量三次取平均值。然后在測量部位皮下注射20％(V/V，用生理鹽水配制)壓積SRBC 20μL，于注射后24h測量左后足跖部厚度，以攻擊前后足跖厚度的差值(足跖腫脹度)來表示DTH的程度。
1.4.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗(MTT法)無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，制成細(xì)胞懸液。用Hank’s液洗3次，每次離心10min(1000r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/mL。再將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，在其中一孔加50μL ConA液(相當(dāng)于5μg/mL)，另一孔作為對照，置5％CO2 37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPM1640培養(yǎng)液，同時加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后將此液體移入比色杯中，在722分光光度計上比色測定，波長570nm。淋巴細(xì)胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值表示。
1.4.4抗體生成細(xì)胞檢測(Jerne改良玻片法)取羊血，生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射2％(V/V，用生理鹽水配制)壓積SRBC0.2mL。將SRBC免疫5天后的小鼠處死，取脾，制成細(xì)胞懸液。將瓊脂糖加熱溶解后，與等量雙倍Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內(nèi)加10％(V/V，用SA液配制)壓積SRBC 50L、脾細(xì)胞懸液201。迅速混勻后，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，交玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1.5h，然后用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1∶10)加入到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。
1.4.5半數(shù)溶血值(HC50)的測定取羊血，生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射2％(V/V，用生理鹽水配制)壓積SRBC 0.2mL進(jìn)行免疫。5天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋400倍，取1mL直試管內(nèi)，依次加入10％(V/V，用SA緩沖液配制)壓積SRBC 0.5mL，補(bǔ)體1ml(用SA緩沖液按1∶10稀釋)。另設(shè)不加血清的對照管(以SA緩沖液代替)。置37℃恒溫水浴中保溫30min后，冰浴終止反應(yīng)。2000r/min離心10min，取上清1ml，加都氏試劑3ml。同時取10％(V/V，用SA緩沖液配制)的壓積SRBC 0.25mL，加都氏試劑至4mL于另一試管中，充分混勻，放置10min后，于540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。溶血素的量以數(shù)溶血值(HC50)表示，按下式計算。
樣品HC50＝樣品光密度值/SRBC半數(shù)溶血時的光密度值×稀釋倍數(shù)1.4.6小鼠碳廓清實驗小鼠尾靜脈注射1∶3.5稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即汁時。注入墨汁后2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，并將其加到2mLNaCO3溶液中。用722分光光度計在600nm波長處測光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟稱重。按下式計算吞噬指數(shù)aκ＝(1gOD1-1God2)/(t2-t1) 1.4.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗(半體內(nèi)法)
小鼠腹腔注射20％(V/V用生理鹽水配制)壓積雞紅細(xì)胞(2000r/min，10min)懸液1mL，間隔30min，頸椎脫臼處死，取腹腔巨噬細(xì)胞洗液1mL，滴于載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵箱溫育30min。孵畢，于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞。晾干，以甲醇固定，4％(V/V)Giemsa。孵畢，于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞。晾干，以甲醇固定，4％(V/V)Giemsa-磷酸緩沖液染色，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數(shù)，每片計數(shù)100巨噬細(xì)胞，按下式計算吞噬和吞噬指數(shù)吞噬率％＝吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100吞噬指數(shù)＝被吞噬雞紅細(xì)胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)1.4.8NK細(xì)胞活性測定(乳酸脫氫酶LDH測定法)實驗前半小時將靶細(xì)胞YAC-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以Hank’s液洗3次，用含10％小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/mL。受試小鼠拉頸處死，無菌取脾，制成脾細(xì)胞懸液，用Hank’s液洗3次，1500r/min離心10min，再用2mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用臺酚蘭染色計數(shù)(活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95％以上)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個/mL，使效靶比為50∶1。取靶細(xì)胞利效應(yīng)細(xì)胞各100μL，加入U形96孔培養(yǎng)板中靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1％NP40各100μL；上述各項均設(shè)二個平行孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，將96孔板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100L置酶標(biāo)板中，加入LDH基質(zhì)液100μL，反應(yīng)10min，然后每孔加入1mol的HCL溶液30μL終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀490nm處測OD值，NK活性按下式計算NK細(xì)胞活性％＝(反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)×100LDH基質(zhì)液的配制乳酸鈉5×10-2mol/L，硝基氯化四氮唑6.6×10-4mol/L，吩嗪二甲酯硫酸鹽2.8×10-4mol/L，氧化型輔酶I1.3×10-3mol/L，將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl沖液中(pH8.2)。
1.5實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計。
2結(jié)果2.1該組合物對小鼠體重的影響表6.該組合物對免疫一組小鼠體重影響動物數(shù)始重終重 增重組別(只) (g)(g)(g) P空白對照組1220.2±1.3 36.2±3.8 16.0±4.7 ---低劑量組 1220.1±1.1 38.1±4.2 18.1±4.3 0.333中劑量組 1220.5±1.1 36.2±5.5 15.6±5.9 0.841高劑量組 1220.0±0.9 36.1±4.9 16.1±5.2 0.978p值各實驗組與空白對照組比較由表6可見，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，小鼠的初始體重在低、中、高劑量組和空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)，即小鼠的初始體重在各組間較為均衡。經(jīng)口給予該組合物30天，各劑量組小鼠增重在低、中、高劑量組和空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)。即該組合物對小鼠體重增重?zé)o影響。
表7該組合物對免疫二組小鼠體重影響動物數(shù)始重 終重 增重組別(只) (g)(g)(g)P空白對照組1220.5±1.1 34.6±5.8 14.1±5.7---低劑量組 1219.6±0.9 33.4±4.7 13.9±4.8 0.901中劑量組 1220.0±1.1 34.0±4.4 14.0±4.3 0.965高劑量組 1219.8±1.1 34.2±4.6 14.4±5.3 0.885p值各實驗組與空白對照組比較由表7可見，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，小鼠的初始體重在低、中、高劑量組和空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)，即小鼠的初始體重在各組間較為均衡。經(jīng)口給予該組合物30天，各劑量組小鼠增重在低、中、高劑量組和空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)。即該組合物對小鼠體重增重?zé)o影響。
表8該組合物對免疫三組小鼠體重影響動物數(shù) 始重 終重 增重組別(只) (g) (g) (g) P空白對照組1220.5±0.8 35.8±4.4 15.3±4.2 ---低劑量組 1220.5±1.2 37.8±4.9 17.3±5.4 0.287中劑量組 1220.7±0.7 34.5±4.7 13.8±4.7 0.419高劑量組 1219.8±1.0 36.1±3.6 16.4±3.6 0.579p值各實驗組與空白對照組比較由表8可見，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，小鼠的初始體重在低、中、高劑量組和空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)，即小鼠的初始體重在各組間較為均衡。經(jīng)口給予該組合物30天，各劑量組小鼠增重在低、中、高劑量組和空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)。即該組合物對小鼠體重增重?zé)o影響。
2.2該組合物對小鼠臟器/體重比值的影響表9. 該組合物對小鼠臟器/體重比值的影響動物數(shù) 脾臟/體重比值 胸腺/體重比值組別 P1P2(只) (mg/g) (mg/g)空白對照組125.56±1.19 3.22±0.32---低劑量組 125.65±0.95 0.830 3.02±0.40 0.288中劑量組 125.07±0.79 0.250 3.24±0.60 0.900高劑量組 125.89±1.11 0.436 3.11±0.42 0.546脾臟/體重比值P1值各實驗組與空白對照組比較胸腺/體重比值P2值各實驗組與空白對照組比較同表9可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其脾臟/體重比值和胸腺/體重比值在低、中、高劑量組與空白對照組間比較無顯著性差異(P＞0.05)，即該組合物對小鼠的臟器體重比值無影響。
2.3該組合物對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響2.3.1該組合物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響表10該組合物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響組別 動物數(shù)(只) 足跖腫脹度(mm) P空白對照組120.78±0.18---低劑量組 120.74±0.16 0.617中劑量組 120.75±0.17 0.675高劑量組 120.78±0.21 0.976P值各實驗組與空白對照組比較由表10可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其足跖腫脹度在低、中、高劑量組與空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)，即該組合物對小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)無影響。
2.3.2該組合物對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗的影響表11.該組合物對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗的影響組別 動物數(shù)(只) 淋巴細(xì)胞增殖能力(OD差值) P空白對照組 12 0.144±0.026---低劑量組 12 0.150±0.028 0.602中劑量組 12 0.148±0.027 0.711高劑量組 12 0.170±0.031* 0.025p值務(wù)實驗組與空白對照組比較*p＜0.05由表11可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其淋巴細(xì)胞的增殖能力在高劑量組與空白對照組間比較有顯著性差異(P＜0.05)，在低、中劑量組與空白對照組間比較無顯著性差異(P＞0.05)，即高劑量的該組合物能提高ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。
2.4該組合物對體液免疫的影響表12.該組合物對小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響組別 動物數(shù)(只) 溶血空斑數(shù)(×103全脾) P空白對照組12222.3±58.8 ---低劑量組 12251.8±69.5 0.289中劑量組 12282.8±58.4*0.033高劑量組 12269.3±80.6 0.094p值各實驗組與空白對照組比較p＜0.05由表12可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其抗體生成細(xì)胞數(shù)在中劑量組與空白對照組間比較有顯著性差異(p＜0.05)，在低、高劑量糾與空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)，即中劑量的該組合物能提高小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)。
表13.該組合物對小鼠半數(shù)溶血值HC50的影響組別 動物數(shù)(只) 樣品HC50P空白對照組12172±50 ---低劑量組 12187±48 0.428中劑量組 12185±44 0.478高劑量組 12169±33 0.859p值各實驗組與空白對照組比較由表13可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其半數(shù)溶血值在低、中、高劑量組與空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)，即該組合物對小鼠的半數(shù)溶血值無影響。
2.5.1該組合物對小鼠單核—巨噬細(xì)胞碳廓清功能的影響表14.該組合物對小鼠單核—巨噬細(xì)胞碳廓清功能的影響組別 動物數(shù)(只) 吞噬指數(shù)(a) P空白對照組 12 6.35±1.19---低劑量組 12 5.69±1.46 0.226中劑量組 12 6.35±1.12 0.989高劑量組 12 6.69±1.43 0.519P值各實驗組與空白劉照組比較由表14可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其碳廓清功能在低、中、高劑量組與空白對照紐間比較無顯著性差異(P＞0.05)，即該組合物對小鼠單核—巨噬細(xì)胞的碳廓清功能無影響。
表15.該組合物對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞纖細(xì)胞的能力的影響組別 動物數(shù)(只) 吞噬率(％) P1吞噬指數(shù)P2空白對照組12 38±10 0.46±0.09 ---低劑量組 12 37±10 0.7080.44±0.10 0.576中劑量組 12 40±8 0.5980.48±0.07 0.576高劑量組 12 38±10 0.8430.45±0.10 0.771吞噬率(％)p1值各實驗組與空白對照組比較吞噬指數(shù)P2值各實驗組與空白對照組比較由表15可見，經(jīng)口給予小鼠該組合物30天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其吞噬率在低、中、高劑量組與空白對照組間比較均無顯著性差異(P＞0.05)，其吞噬指數(shù)在低、中、高劑量組與空白對照組間比較均無顯著性差異(p＞0.05)，即該組合物對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力無影響。
2.6該組合物對小鼠NK細(xì)胞活性的影響表16該組合物對小鼠NK細(xì)胞活性的影響組別 動物數(shù)(只)NK細(xì)胞活性(％)P2空白對照組 1216.5±2.9 ---低劑量組1216.5±3.2 0.974中劑量組1216.1±2.1 0.760高劑量組1216.7±3.0 0.875p值各實驗組與空白對照組比較由表16可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其NK細(xì)胞活性在低、中，高劑量組與空白對照組間比較無顯著性差異(p＞0.05)，即該組合物對小鼠的NK細(xì)胞活性無影響。
3小結(jié)經(jīng)口給予小鼠不同劑量的該組合物30天，能增強(qiáng)conA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，增加小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)；對小鼠的體重增長、臟器/體重比值、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、半數(shù)溶血值、單核—巨噬細(xì)胞碳廓清的功能、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力和NK細(xì)胞的活性無影響。由此判定，該組合物具有免疫調(diào)節(jié)作用。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于由西洋參總皂甙類提取物與紫錐菊40-70％乙醇提取物制成，二者的重量配比為西洋參總皂甙類提取物1-2份，紫錐菊40-70％乙醇提取物3-5份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于二種組分的重量配比為西洋參總皂甙類粗提物1份，紫錐菊40-70％乙醇提取物3.5份。
3.一種組合物，其特征在于由以下重量配比的原料制成軟膠囊西洋參總皂甙類粗提物 1-2份；紫錐菊40-70％乙醇提取物 3-5份；聚乙二醇400 5-10份；甘油 1-3份；大豆色拉油 1-3份；水 1-3份。
4.一種組合物，其特征在于由以下重量配比的原料制成軟膠囊西洋參總皂甙類提取物 6.4g，紫錐菊50％乙醇提取物 21.3g，聚乙二醇400 42.6g，甘油 8.5g，大豆色拉油10.6g，水10.6g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的組合物在制備具有免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞功能的藥物或食品中的用途。
6.測定根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的組合物中人參總皂甙、人參皂甙Rb1的含量的方法，其特征在于分別按以下方法進(jìn)行a.分光光度法測定組合物中人參皂甙的含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定以人參皂甙Re標(biāo)準(zhǔn)品的70％乙醇溶液，精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，搖勻，置60℃±1℃水浴中加熱顯色至顯色穩(wěn)定時，取出立即放入冰浴中冷卻，比色，于544nm處測定吸收度，以吸收度對濃度回歸得回歸方程；樣品的測定組合物以水提取，得到的樣品溶液適量，通過大孔樹脂柱，用70％乙醇洗脫人參總皂甙，收集洗脫液，將洗脫液精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，搖勻，置60℃±1℃水浴中加熱，顯色穩(wěn)定后取出立即放入冰浴中冷卻，比色，于544nm處測定吸收度，以回歸方程計算以人參皂甙Re計的人參皂甙含量；b.高效液相法測定產(chǎn)品中的人參皂甙Rb1的含量色譜條件色譜柱ODS柱5m，4.6×250nm；流動相乙腈-0.05％磷酸溶液以99∶400的體積配比的混合溶劑，流速1ml/min，檢測波長203nm；標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定以人參皂甙Rb1對照品適量，用流動相溶解并定容，即為對照品溶液；分別吸取對照品溶液不同體積進(jìn)樣，測定得到峰面積的數(shù)據(jù)，以峰面積對濃度回歸得回歸方程；樣品的測定精密稱取組合物適量，用水溶解，取水溶液過濾，濾液適量，用水飽和的正丁醇萃取，合并正丁醇相，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，濾過，濾液用甲醇定容，過0.35-0.50μm的微孔濾膜，精密吸取適量，注入液相色譜儀中，在203nm測定峰面積的數(shù)據(jù)，按回歸方程計算樣品中人參皂甙Rb1的含量。
7.定性鑒別根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的組合物中紫錐菊，或?qū)ψ襄F菊40-70％乙醇提取物定性鑒別的方法，其特征在于分別按以下方法進(jìn)行a.取樣品適量，以水提取，吸取水溶液適量置于試管中，加α-萘酚乙醇溶液3滴，搖勻后沿管壁緩緩加入濃硫酸1ml，在硫酸層和供試液層之間界面處出現(xiàn)明顯的紫紅色環(huán)；b.取樣品適量，以水提取，取水溶液適量，濾過，以氯仿萃取，棄去氯仿液，水層用稀鹽酸溶液調(diào)至pH3.0，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收乙酸乙酯至干，殘渣用甲醇適量溶解，即為供試品溶液；制備咖啡酸、綠原酸濃度為1.0-2.0mg/ml的甲醇溶液作為對照品溶液；取供試品溶液和對照品溶液各適量，點于硅膠G的薄層上，以乙酸乙酯-甲酸-水按10∶1∶9體積比的混合溶劑的下層溶液展開，取出，揮去展開劑，以碘顯色，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；c.取樣品適量，加60-75％乙醇振搖后放置數(shù)小時，濾過，取濾液2ml，加1％三氯化鐵試液1～2滴，即產(chǎn)生深藍(lán)色沉淀；d.取樣品適量，用60-75％乙醇溶液提取，置75-85℃水浴上濃縮至小體積，用吸管取出，定容至1ml，即為樣品液，另取紫錐菊對照藥材1.0克，同法操作制備對照品溶液，取上述兩種溶液各適量，分別點于硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水按5∶5∶1體積比的混合液展開后，在紫外光燈365nm下觀察層析板，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點。
8.定性鑒別紫錐菊原藥材的方法，其特征在于分別按以下方法進(jìn)行a.取紫錐菊粉末適量，加60-75％乙醇振搖后放置數(shù)小時，濾過，取濾液2ml，加1％三氯化鐵試液1～2滴，即產(chǎn)生深藍(lán)色沉淀；b.取方法1得到的濾液適量，置于試管內(nèi)，加α-茶酚乙醇溶液3滴，搖勻后沿管壁緩緩加入濃硫酸1ml在硫酸層和供試液層之間界面處出現(xiàn)明顯的紫紅色環(huán)；c.取紫錐菊粉末適量，加水提取，濾過，取濾液適量，加乙醇使含醇量達(dá)70-80％，振搖，靜置，濾過，用70-80％乙醇適量洗滌沉淀，取適量沉淀物，用水溶解，加鹽酸少量，沸水浴加熱20-30分鐘后用氫氧化鈉試液調(diào)pH＞7，加Fehling溶液少量，沸水浴上加熱數(shù)分鐘，即產(chǎn)生磚紅色沉淀；d.取紫錐菊粉末適量，用60-75％乙醇溶液提取，置75-85℃水浴上濃縮至小體積，用吸管取出，定容至1ml，即為樣品液，另取紫錐菊對照藥材1.0克，同法操作制備對照品溶液，取上述兩種溶液各適量，分別點于硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水按5∶5∶1體積比的混合液展開后，在紫外光燈365nm下觀察層析板，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點。
9.測定根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的組合物中人參總皂甙、人參皂甙Rb1的含量的方法，其特征在于分別按以下方法進(jìn)行a.分光光度法測定產(chǎn)品中的人參皂甙含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定取人參皂甙Re標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、20、40、60、80、100μl，分別用70％乙醇定容至1.0ml，精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，搖勻，置60℃±1℃水浴中加熱10分鐘，取出立即放入冰浴中冷卻15分鐘，用1cm比色皿進(jìn)行比色，于544nm處測定吸收度，以吸收度對濃度回歸得回歸方程；樣品的測定取樣品5粒，取出內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取內(nèi)容物0.5g，置100ml容量瓶中，加50ml水溶解，超聲波振蕩提取20min，再定容至100ml備用，此為待測樣品溶液；取上述樣品溶液0.5ml，過大孔樹脂柱，樣液完全通過后，用2.5ml水，分4次淋洗柱子，用吸耳球吹去水份，用70％乙醇1.0ml洗脫人參總皂甙，收集洗脫液，待用；將上述洗脫液精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，搖勻，置60℃±1℃水浴中加熱10分鐘，取出立即放入冰浴中冷卻15分鐘，比色，于544nm處測定吸收度，以回歸方程計算含量；b.高效液相法測定產(chǎn)品中的人參皂甙Rb1的含量色譜條件色譜柱ODS柱5m，4.6×250nm；流動相乙腈-0.05％磷酸溶液99∶400體積比的混合溶液，流速1ml/min，檢測波長203nm；標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定精密稱取人參皂甙Rb1對照品10.0mg，用流動相溶解并定容至10ml容量瓶中，即為對照品溶液。分別吸取對照品溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl進(jìn)樣，測定得到峰面積的數(shù)據(jù)，以峰面積對濃度回歸得回歸方程；樣品的測定取樣品5粒，取出內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取內(nèi)容物0.5g，置10ml容量瓶中，用水溶解，并定容，吸取下層水相，過濾，取濾液5ml，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10ml，合并正丁醇相，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，濾過，濾液置10ml容量瓶中，用甲醇定容，過0.45μm的微孔濾膜，精密吸取20μl，注入液相色譜儀中，測定，按回歸方程計算樣品中人參皂甙Rb1的含量。
10.鑒別根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的組合物中紫錐菊的方法，其特征在于分別按以下方法進(jìn)行a.紫錐菊的顏色反應(yīng)取1粒膠囊的內(nèi)容物，置試管中，加水10ml，70℃加熱提取10分鐘，吸取下層溶液2ml置于試管中。加α-萘酚乙醇溶液3滴，搖勻后沿管壁緩緩加入濃硫酸1ml，在硫酸層和供試液層之間界面處出現(xiàn)明顯的紫紅色環(huán)；b.紫錐菊的薄層層析取樣品10粒，取出內(nèi)容物，稱取5.0g，用50ml去離子水加熱提取，取下層溶液40ml，濾過，置分液漏斗中，用氯仿萃取3次，每次20ml，棄去氯仿液，水層用稀鹽酸溶液調(diào)pH3.0，再用乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，減壓回收乙酸乙酯至干，殘渣用甲醇2ml溶解，即為供試品溶液。分別制備咖啡酸、綠原酸濃度為2.0mg/ml的甲醇溶液作為對照品溶液。以樣品液20μl，對照品溶液各10μl，點于硅膠G的薄層上，以乙酸乙酯-甲酸-水按體積比10∶1∶9的混合液的下層溶液展開，取出，揮去展開劑，以碘顯色，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，為樣品中檢出的咖啡酸和綠原酸。
11.鑒別紫錐菊的方法，其特征在于分別按以下方法進(jìn)行a.取紫錐菊粉末0.5g，置三角瓶中，加70％乙醇30ml，振搖后放置8小時，濾過，得供試濾液，取濾液2ml，置試管中，加1％二氯化鐵試液1～2滴，即產(chǎn)生深藍(lán)色沉淀；b.取上述濾液1ml，置于試管內(nèi)，加α-茶酚乙醇溶液3滴，搖勻后沿管壁緩緩加入濃硫酸1ml在硫酸層和供試液層之間界面處出現(xiàn)明顯的紫紅色環(huán)；c.取本品粉末1g，置圓底燒瓶中，加水50ml熱回流1小時，濾過，取濾液5ml，加乙醇使含醇量達(dá)80％，振搖，靜置20分鐘，濾過，用80％L醇洗滌沉淀，取適量沉淀物，用水溶解，加鹽酸少量，沸水浴加熱30分鐘后用氫氧化鈉試液調(diào)pH＞7，加Fehling溶液少量，沸水浴上加熱數(shù)分鐘，即產(chǎn)生磚紅色沉淀；d.薄層色譜鑒別取本品粉末1.0克，用70％乙醇溶液回流提取，置75-85℃水浴上濃縮至約1ml，用吸管取出，定容至1ml，即為樣品液，另取對照藥材1.0克，同法操作制備對照品溶液。取上述兩種溶液各20μl，分別點于硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水按體積比5∶5∶1的混合液展開，待展開劑展至板前沿時取出，使展開劑自然揮干。在紫外光燈365nm下觀察層析板，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點。
全文摘要
本申請涉及一種由將西洋參皂甙提取物與紫雛菊乙醇提取物制成的軟膠囊，能同時發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞功能。通過研究，還進(jìn)一步制定了本產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。
文檔編號A23L1/30GK1526422SQ0311922
公開日2004年9月8日 申請日期2003年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月5日
發(fā)明者楊冬華, 夏連珍 申請人:吉林天藥科技股份有限公司