專利名稱：具有免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)酵組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶并具有免疫調(diào)節(jié)作用的組合物，更具體地說，涉及具有免疫賦活作用的組合物及/或具有抗變態(tài)反應作用的組合物。此外，本發(fā)明還涉及含有經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶、經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的芝麻和經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的大豆并具有免疫調(diào)節(jié)作用的組合物。
背景技術：
近年來，與變態(tài)反應相關的問題正急劇地顯現(xiàn)出來。變態(tài)反應有各種各樣的疾病，眾所周知，以花粉癥為首，異位性皮炎、食物過敏癥、過敏性鼻炎、過敏性哮喘等的患者人數(shù)尤其多，并且有報道花粉癥患者的人數(shù)正飛躍地上升。面臨這樣的現(xiàn)狀，以醫(yī)藥品制造商為中心，人們進行了以克服變態(tài)反應為目的的研究，研制出了許多產(chǎn)品。其代表性的產(chǎn)品有抗變態(tài)反應制劑、抗組胺制劑等，但這些藥物制劑以作用于變態(tài)反應發(fā)生機制末端被稱作肥大細胞的粒細胞的炎癥性物質(zhì)的釋放和受體等為特征，暫時緩和癥狀，但對變態(tài)反應發(fā)生的根源沒有影響。此外，對于癥狀特別嚴重的患者有時給予類固醇制劑等，但此類藥物制劑的副作用成為問題。在這樣的情況下，人們熱切希望根本上治療及預防變態(tài)反應的方法。另一方面，日本正迎來老齡化社會，以年齡增加導致免疫力低下為起因的高齡者感染癥的死亡人數(shù)正在增加。此外，眾所周知，在忙碌的現(xiàn)代社會以及在緊張和充滿壓力的環(huán)境中生活，免疫力會下降，人們渴望有相應的對策。
為了解決上述問題，急需研制一種安全的經(jīng)口攝取組合物，該組合物作為通過提高免疫調(diào)節(jié)功能來增強免疫力從而可以防止感染癥或可以預防或治療變態(tài)反應的手段，其由身邊的食品材料制造得到，長期發(fā)揮平穩(wěn)的免疫調(diào)節(jié)作用，可以維持生活在緊張和充滿壓力環(huán)境中人們的健康。
在日本，自古以來就有食用海藻的習慣，特別是海帶，被認為是增強體質(zhì)和增進健康的食品、長壽食品，而且是素齋中也含有的傳統(tǒng)食物材料。海藻富含人們?nèi)菀兹狈Φ拟}、鈉、鎂、磷、鐵、碘等礦物質(zhì)、各種維生素、褐藻多糖(fucoidan)等食物纖維，而且證實海藻具有免疫調(diào)節(jié)作用。此外，關于乳酸發(fā)酵食品，隨著科學知識的積累，食用乳酸發(fā)酵食品有益健康的認識越來越高，多種乳酸菌及乳酸發(fā)酵食品的免疫調(diào)節(jié)作用也日趨明了。可是，無論是海藻還是乳酸發(fā)酵食品，單獨來說均不具備充分的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，同時具有上述兩個要素的海藻乳酸發(fā)酵材料被認為是一種能提高健康機能的富有魅力的材料。但是，在海帶等海藻中缺少發(fā)酵菌株植入、生長所必需的營養(yǎng)成分。而且，其培養(yǎng)需要花費許多時間、勞力和費用。因此，對海藻發(fā)酵食品及其生理活性的研究不是很充分。
關于海藻發(fā)酵物，專利文獻1公開了一種海藻發(fā)酵食品，該食品通過以下的方法得到為使海藻糖化即提供作為發(fā)酵底物的糖類，用纖維素酶等分解處理海藻類，單細胞化，然后用乳酸菌及/或酵母進行發(fā)酵。根據(jù)上述文獻的記載，用該方法發(fā)酵了真海帶及裙帶菜，而且用該方法制造的海藻發(fā)酵食品具體為在裙帶菜中加入纖維素酶及接種三種菌種(一種乳酸菌Lactobacillus brevis NRIFS B5201株和兩種酵母Debaryomyces hansenii NRIFSY5201株及Candida zeylanoides NRIFSY5206株)進行發(fā)酵后制得的食品具有降低血中中性脂肪的作用及降低肝臟脂肪的作用。
此外，專利文獻2公開了一種攝取簡便、營養(yǎng)好、吸收好、美味的食品，該食品是通過在大豆及海帶的混合物中加入根霉屬菌類進行發(fā)酵后再與未發(fā)酵芝麻混合而制得的發(fā)酵食品。
日本特開2003-201號公報 日本特許第2846547號發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于利用身邊的食品材料，通過賦予身邊的食品材料免疫調(diào)節(jié)功能或提高該材料的免疫調(diào)節(jié)功能，從而提供安全性高且具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用的組合物。
本發(fā)明人等利用植物性乳酸菌對通常被認為很難發(fā)酵的海帶進行發(fā)酵，并成功地獲得了海帶的乳酸菌發(fā)酵物。接著，本發(fā)明人等對該海帶乳酸菌發(fā)酵物經(jīng)口攝取后的生理活性進行了反復研究，結果發(fā)現(xiàn)與攝取海帶單體及/或乳酸菌單體相比，該發(fā)酵物的免疫調(diào)節(jié)作用(免疫賦活作用、調(diào)整免疫平衡的作用)顯著提高。此外，本發(fā)明人等在開發(fā)能更高效地發(fā)揮該海帶乳酸菌發(fā)酵物免疫調(diào)節(jié)功能的且營養(yǎng)價值高的食品材料上進行了潛心研究，結果驚奇地發(fā)現(xiàn)當含有經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶和經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的芝麻及經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的大豆的組合的組合物經(jīng)口攝取后，顯示出了預料之外的高免疫賦活作用、抗變態(tài)反應作用等免疫調(diào)節(jié)作用。還證實了與單獨攝取乳酸菌、單獨攝取未發(fā)酵的發(fā)酵原料時的作用相比，該免疫調(diào)節(jié)作用更顯著。而且，本發(fā)明的組合物加熱滅菌后，該免疫調(diào)節(jié)作用仍然維持。
基于這些另人驚奇的發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明為1.含有經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶并具有免疫調(diào)節(jié)作用的組合物；2.在1中所述的組合物，其中，免疫調(diào)節(jié)作用是免疫賦活作用及/或抗變態(tài)反應作用；3.在1或2中所述的組合物，其中，乳酸菌是植物性乳酸菌；4.在1～3任意一項中所述的組合物，作為一次攝取量，其含有5mg或5mg以上的經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶；5.含有經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶和經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的芝麻和經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的大豆的組合物；
6.在5中所述的組合物，其中，乳酸菌是植物性乳酸菌；7.在5或6中所述的組合物，其具有免疫調(diào)節(jié)作用；8.在7中所述的組合物，其中，免疫調(diào)節(jié)作用是免疫賦活作用及/或抗變態(tài)反應作用；9.在5～9任意一項中所述的組合物，作為一次攝取量，其含有的經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶和經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的芝麻和經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的大豆合計為1～10000mg，優(yōu)選10～10000mg；10.在1～9任意一項中所述的組合物，其是飲食物、食品添加物、健康食品或醫(yī)藥組合物；11.在1～10任意一項中所述的組合物，其形態(tài)為丸劑；12.標示了含有經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶作為有效成分且具有免疫調(diào)節(jié)作用的飲食物。
具體實施例方式
乳酸菌發(fā)酵海帶本發(fā)明中所述的海帶指的是褐藻類海帶科海帶屬(Laminaria spp.)及其近緣種的總稱，例如包括真海帶(L.japonica)、利尻海帶(L.japonica var.ochotensis)、狹葉海帶(L.angustata)、長海帶(L.angustata var.longissima)、皺海帶(L.religiosa)、雙裂海帶(Arthrothamnus bifidus)、圓切氏海帶(Kjellmaniella gyrata)、萱藻(Kjellmaniella crassifolia)，但不限于這些。
作為本發(fā)明經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶(乳酸菌發(fā)酵海帶)的海帶原料，采用的是上述海帶的原藻或其去除了沙子等異物后的干燥品。從容易發(fā)酵的角度出發(fā)，優(yōu)選使用切斷或粉末化后的海帶，也可以使用用鹽、糖、氨基酸、有機酸、核酸等調(diào)味的海帶。上述海帶一般在市場上有售，例如商品名“海帶粉”(日本燒津水產(chǎn)化學工業(yè)株式會社)、商品名“海帶粉”(日本有限會社惣萬水產(chǎn))等。
對用來發(fā)酵海帶原料的乳酸菌沒有特殊限制，只要是能使海帶發(fā)酵的乳酸菌即可，可以使用按照通常的方法冷凍干燥制備的乳酸菌或冷藏保存的乳酸菌。作為乳酸菌，可以列舉如乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptcoccus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、明串球菌屬(Leuconostoc)等，從中選擇一種或兩種或兩種以上的乳酸菌，可以同時使用或逐次使用。其中，優(yōu)選分離得到的利用植物成分生存的乳酸菌(植物性乳酸菌)，因為該乳酸菌在海帶等營養(yǎng)不豐富的植物性原料中也可以發(fā)酵，且耐酸、耐堿、在高濃度食鹽的存在下也可以生存繁殖因而易于在食品中利用，而且該乳酸菌在對人有用的腸道系統(tǒng)中有耐性等。作為上述植物性乳酸菌，可列舉植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、嗜鹽片球菌(Tetragenococcushalophilus)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等。另外，本申請人從紫蘇腌茄子中分離出具有免疫調(diào)節(jié)作用的多種植物性乳酸菌(參照日本特開2005-333919號公報)。在本發(fā)明中，也可以優(yōu)選使用這些乳酸菌。
此外，本發(fā)明的乳酸菌可以使用同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵中任何一種發(fā)酵類型的乳酸菌，還可以利用在異型乳酸發(fā)酵中產(chǎn)生的醋酸、二氧化碳、乙醇等來賦予香味，但當二氧化碳大量產(chǎn)生時，使用發(fā)酵罐等的制造工序的操作性有時會變差。另一方面，同型乳酸發(fā)酵因為生成大量乳酸，所以在發(fā)酵過程中因來自海帶的腐敗菌等的影響而腐敗的危險性小，適合在本發(fā)明中使用。
本發(fā)明的乳酸菌發(fā)酵海帶，通常在海帶原料中加水，接種上述乳酸菌進行發(fā)酵，然后加熱或照射(優(yōu)選加熱)，對發(fā)酵物進行殺菌。對上述殺菌后的發(fā)酵物進行過濾或離心分離(優(yōu)選過濾)，除去大部分已死滅的菌類，從而可以得到乳酸菌發(fā)酵海帶。
將要進行發(fā)酵時，優(yōu)選預先進行滅菌處理。只要設定適宜的滅菌處理溫度及時間即可，例如，保持在90℃下滅菌處理10分鐘。此外，海帶發(fā)酵時，有時海帶的多糖類會使發(fā)酵液粘度明顯增加，因此加入藻酸裂解酶等酶，可以提高操作性。
通過在上述滅菌處理物中加入包含乳酸菌的起子(starter)進行發(fā)酵處理。此時，作為發(fā)酵促進添加物，優(yōu)選添加葡萄糖之類的糖類、大豆蛋白之類的氮源等。根據(jù)所使用的乳酸菌的性質(zhì)，設定適宜的發(fā)酵處理溫度及時間即可。通過測定發(fā)酵處理物的pH值，可以判斷發(fā)酵程度，本發(fā)明的乳酸菌發(fā)酵海帶的發(fā)酵，最好進行到pH值變?yōu)?.0或5.0以下為止。
按上述方法得到的乳酸菌發(fā)酵海帶，可以是以液體狀原狀使用，但從操作性和保存性的角度出發(fā)，優(yōu)選通過噴霧干燥或冷凍干燥將其粉末化。
乳酸菌發(fā)酵芝麻大豆海帶(經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶、芝麻及大豆)本發(fā)明的特征在于通過在上述乳酸菌發(fā)酵海帶中再配合經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的芝麻和經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的大豆，從而增強免疫調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明中所述的芝麻指的是Sesamun indicum的植物的種子，例如包含白芝麻、黑芝麻、黃芝麻、茶色芝麻等，但不限于這些。此外，這些芝麻可以單獨使用，也可以多種混合使用。作為本發(fā)明的經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的芝麻(乳酸菌發(fā)酵芝麻)的芝麻原料，其形態(tài)不受限制，可以是粒狀、粉碎物、糊狀物(paste)等任何一種形態(tài)，但從容易發(fā)酵的角度出發(fā)，優(yōu)選使用芝麻的粉碎物或糊狀物。市場上銷售許多芝麻的糊狀物，例如商品名“純黑芝麻醬”(日本竹本油脂株式會社)等。另外，以得到脂肪含量少的乳酸菌發(fā)酵芝麻為目的時，可以使用脫脂芝麻作為原料，但從芝麻所具有的營養(yǎng)價值和功能上考慮，優(yōu)選使用未脫脂的含有油分的芝麻。
本發(fā)明中所述的大豆指的是Glycine max的植物的種子，其根據(jù)生長期、產(chǎn)地的不同，包含多種不同的品種。在本發(fā)明中沒有特殊限制，可以使用任何一種品種。作為本發(fā)明的經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的大豆(乳酸菌發(fā)酵大豆)的大豆原料，可以使用固形大豆、大豆粉、大豆餅(soybeanoil cake)、脫脂大豆、熟豆粉以及它們的水解產(chǎn)物等任何一種，沒有特殊限制，但從容易發(fā)酵的角度出發(fā)，優(yōu)選使用粉末化后的大豆。上述大豆粉在市場上有售，例如商品名“熟黑豆粉”(日本小林桂株式會社)、商品名“プロライフJ”(日本理研農(nóng)產(chǎn)化工株式會社)等。另外，以得到脂肪含量少的乳酸菌發(fā)酵大豆為目的時，可以使用脫脂大豆。
本發(fā)明涉及含有乳酸菌發(fā)酵海帶和乳酸菌發(fā)酵芝麻和乳酸菌發(fā)酵大豆的組合物(在本說明書中，也稱為“乳酸菌發(fā)酵芝麻大豆海帶”、“發(fā)酵芝麻大豆海帶”)。該組合物可以通過先對海帶、芝麻及大豆原料分別進行乳酸菌發(fā)酵再混合制得，也可以通過先混合原料海帶、芝麻及大豆再接種乳酸菌來制備。
另行發(fā)酵后再混合來制備時，即混合乳酸菌發(fā)酵海帶、乳酸菌發(fā)酵芝麻及乳酸菌發(fā)酵大豆時，作為乳酸菌發(fā)酵海帶，可以優(yōu)選使用通過上述制造方法等制備的乳酸菌發(fā)酵海帶。作為乳酸菌發(fā)酵芝麻，可以使用與上述乳酸菌發(fā)酵海帶同樣制備的乳酸菌發(fā)酵芝麻、日本特開2004-173692號公報中記載的乳酸菌發(fā)酵芝麻等。作為乳酸菌發(fā)酵大豆，可以使用與上述乳酸菌發(fā)酵海帶同樣制備的乳酸菌發(fā)酵大豆、日本特開2003-335695號公報中記載的乳酸菌發(fā)酵大豆等。
以下述方法為例，可以說明原料海帶、芝麻及大豆混合后再接種乳酸菌來制備的方法，但不限于此。
首先，準備作為發(fā)酵原料的海帶、大豆、芝麻。根據(jù)情況將這些原料加工成粉末或糊狀。或者，也可以購買市售的粉末或糊狀材料作為發(fā)酵原料使用。接著，將原料海帶(例如，海帶粉)、大豆(例如，大豆粉)、芝麻(例如芝麻醬)按規(guī)定的比例混合，加水，進行滅菌處理。設定適宜的滅菌處理溫度及時間即可，例如，在90℃下滅菌處理10分鐘。然后，在得到的滅菌處理物中加入乳酸菌(例如，加入包含乳酸菌的起子等)，進行發(fā)酵處理。進行發(fā)酵處理時，作為發(fā)酵促進添加物，優(yōu)選添加葡萄糖之類的糖類、大豆蛋白之類的氮源等。根據(jù)所使用的乳酸菌的性質(zhì)，設定適宜的發(fā)酵處理溫度及時間即可。通過測定發(fā)酵處理物的pH值，可以判斷發(fā)酵程度。本發(fā)明的組合物的發(fā)酵，最好進行到pH值變?yōu)?.0或5.0以下為止。另外，在滅菌處理工序及/或發(fā)酵處理工序中，當原料混合加水物或滅菌處理物的粘度很高時，通過添加藻酸裂解酶等酶，可以降低混合物的粘度和提高操作性。
發(fā)酵結束后，進行加熱殺菌，冷卻，必要時進行過濾。加熱殺菌的溫度只要適宜地設定即可。按上述方法得到的液體狀發(fā)酵組合物可以直接使用，但從操作性和保存性上考慮，優(yōu)選將上述液體狀發(fā)酵組合物進行噴霧干燥，制成粉末體。該粉末為茶褐色極細的粉體，其具有原料的芳香和乳酸菌的酸味。
另外，在任何一種制造方法中，所使用的乳酸菌的選擇可以與乳酸菌發(fā)酵海帶時一樣，優(yōu)選使用植物性乳酸菌。本發(fā)明人等通過采用了從紫蘇腌茄子中分離的乳酸菌的預備試驗發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)及植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)可以很好地對海帶、大豆及芝麻中的任何一種進行發(fā)酵。因此，即使在植物性乳酸菌中也可以優(yōu)選使用這些乳酸菌(戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)及植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum))。在先混合海帶、芝麻及大豆再接種乳酸菌的制造方法中，作為乳酸菌，可以使用上述戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)及植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)之類可以對海帶、芝麻和大豆中的任何一種進行發(fā)酵的乳酸菌，或者，同時使用多種可以對各原料進行發(fā)酵的乳酸菌。
免疫調(diào)節(jié)作用本發(fā)明的組合物即乳酸菌發(fā)酵海帶或乳酸菌發(fā)酵芝麻大豆海帶的特征在于具有免疫調(diào)節(jié)作用。
免疫是指通過抵抗無數(shù)病原體、各種有害物質(zhì)等來保護機體從而預防各種疾病的功能，即保持生物體穩(wěn)定性的功能，當免疫功能過盛或破壞時，會引起變態(tài)反應性疾病、自身免疫性疾病等。本發(fā)明中所述的免疫調(diào)節(jié)作用指的是，當因年齡增加、緊張和壓力、疲勞、睡眠不足等引起部分免疫功能破壞或免疫功能低下時激活免疫應答的作用(免疫賦活作用)，或，當免疫功能過盛時抑制免疫應答的作用(免疫抑制作用)。本發(fā)明組合物通過適宜地發(fā)揮上述免疫賦活作用和免疫抑制作用來謀求達到免疫平衡的最佳狀態(tài)。
在生物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)中，存在識別抗原的淋巴細胞T細胞，根據(jù)所產(chǎn)生的細胞因子可分為Th1細胞和Th2細胞。該Th1和Th2的平衡(Th1/Th2平衡)對生物體內(nèi)的免疫應答產(chǎn)生影響，例如，眾所周知在變態(tài)反應中，當Th1占優(yōu)勢時，引起遲發(fā)型過敏癥(如臟器移植時發(fā)生的排斥反應等IV型變態(tài)反應)，當Th2占優(yōu)勢時，產(chǎn)生抗原特異性IgE抗體，引起速發(fā)型過敏癥(如哮喘、過敏性鼻炎、花粉癥、異位性皮炎等I型變態(tài)反應)。因為Th1細胞產(chǎn)生IFN-γ，Th2細胞產(chǎn)生IL-4，所以可以用上述IL-4和IFN-γ的比(IFN-γ/IL-4)作為免疫平衡的指標。
本發(fā)明的組合物(乳酸菌發(fā)酵海帶以及乳酸菌發(fā)酵芝麻大豆海帶)的特征在于，其將生物體的Th1/Th2平衡引向Th1占優(yōu)勢的狀態(tài)。如上所述，已知在哮喘、花粉癥、異位性皮炎等I型變態(tài)反應中，Th2占優(yōu)勢。而且有報道在HIV感染中也是Th2占優(yōu)勢。還已知當Th1占優(yōu)勢時，促進巨噬細胞、NK細胞、細胞毒性T細胞(CTL)的活性，提高抗癌能力。因此，直接攝取本發(fā)明的組合物或以食品、醫(yī)藥品等形態(tài)攝取，使Th1占優(yōu)勢，不單可以治療和預防I型變態(tài)反應，還可以提高對HIV、癌、細菌感染等的抵抗能力，從而進行預防和治療。
本發(fā)明組合物的特征還在于，其提高腸道免疫力。所謂的腸道免疫指的是存在于腸道黏膜面的防御系統(tǒng)，該防御系統(tǒng)將侵入腸道的病原因子從鼻子、咽喉等排除或與飲食物等一起排除。已知分布在小腸黏膜的派伊爾結發(fā)揮指揮中心的作用，派伊爾結產(chǎn)生的抗體(IgA)攻擊以病原菌、病毒等為代表的異物。
如上所述，本發(fā)明的組合物(乳酸菌發(fā)酵海帶或乳酸菌發(fā)酵芝麻大豆海帶)可作為免疫調(diào)節(jié)用、免疫賦活用、免疫抑制用、或抗變態(tài)反應用的組合物，非常有用。
飲食物·醫(yī)藥品等本發(fā)明涉及的組合物可以作為飲食物、醫(yī)藥品等來使用，該組合物是通過賦予身邊的營養(yǎng)價值高的食品材料免疫調(diào)節(jié)功能或提高其免疫調(diào)節(jié)功能而制得的組合物，其安全性高，因此優(yōu)選作為可日常攝取的飲食物。用作飲食物時，適合作為具有免疫調(diào)節(jié)作用的健康食品。這里所述的健康食品包括在容器、說明書等中標示了具有免疫功能調(diào)節(jié)作用、免疫賦活作用及/或抗變態(tài)反應作用的飲食物(例如，特定保健用食品、一定條件下的特定保健用食品等功能性食品)。對于標示位置(容器或其附有的說明書等)、容器形態(tài)(瓶、罐、聚乙烯塑料瓶、塑料瓶、紙包裝等)以及標示方法(印刷、刻印、封印等)沒有任何限制。另外，作為食品使用的形態(tài)，還包括將本發(fā)明的組合物作為食品添加劑使用的形態(tài)。
本發(fā)明的組合物作為飲食物使用時可以直接使用，也可以與公知的主劑、輔助劑、甜味調(diào)料、酸味調(diào)料、維生素等各種成分混合后制成符合消費者口味的產(chǎn)品，例如，本發(fā)明的組合物可以以片劑、膠囊劑、丸劑、粉末劑、顆粒劑、糖衣劑(candy)、滴劑(drop)、錠劑(troch)、口香糖、果汁粉、保健營養(yǎng)液、調(diào)味料、加工食品、甜點類或點心類等形態(tài)提供。此外，本發(fā)明的乳酸菌發(fā)酵海帶或乳酸菌發(fā)酵芝麻大豆海帶具有淡淡的味道，因此可以咀嚼品嘗飲食物的形態(tài)成為優(yōu)選形態(tài)之一。具體來說，例如丸劑、餅干這樣的形態(tài)。丸劑的油分通常調(diào)節(jié)到1％或1％以下。這是為了防止因保存中產(chǎn)生的油分的滲出而引起丸劑氧化劣化、丸劑間粘著等。在本發(fā)明的乳酸菌發(fā)酵芝麻大豆海帶中，若使用脫脂大豆、脫脂芝麻，則丸劑的油分可以調(diào)節(jié)到1％或1％以下，但考慮到材料(特別是芝麻)的營養(yǎng)價值，使用脫脂材料不一定合適。不使用脫脂材料時，組合物含有4～15％左右的油分，可能會發(fā)生上述油分的滲出。本發(fā)明人等研究了可以防止該油分滲出的丸劑的制造方法，結果發(fā)現(xiàn)在以外形美觀為目的而通常實施的素丸拋光工序中(素丸表面的拋光處理)，油分明顯滲出；不進行上述素丸拋光工序，而用蟲膠或糖對素丸進行包衣，可以防止油分的滲出。
本發(fā)明的飲食物以免疫功能的調(diào)節(jié)(免疫賦活、抗變態(tài)反應等)為目的也可以在人以外的動物身上使用。作為使用對象的動物，可列舉狗、貓等寵物類、豬、牛等家畜類、雞等家禽類、小鼠、豚鼠等實驗動物之外，還可以是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物等。作為飲食物的形態(tài)，可以使用其原形，也可以添加到動物或魚貝類用的飼料(寵物食品)中來供給，或以補充料(supplement)這樣的形態(tài)供給。
用作醫(yī)藥品時，可列舉如免疫賦活制劑、抗變態(tài)反應制劑等免疫調(diào)節(jié)制劑。此外，本發(fā)明的組合物可以在主藥中使用賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味矯臭劑、助溶劑、懸浮劑、包衣劑等醫(yī)藥制劑技術領域中通常使用的公知輔助劑，制成制劑。劑型可以是丸劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑、坐劑、注射劑等，但并不限于這些。對給予期間沒有特殊限制，可以1周～10天以上連續(xù)給予，優(yōu)選長期穩(wěn)定地連續(xù)給予。
本發(fā)明的組合物(乳酸菌發(fā)酵海帶或乳酸菌發(fā)酵芝麻大豆海帶)在本發(fā)明的飲食物或醫(yī)藥品中的含量沒有特殊限制，一般為0.1～100重量％，優(yōu)選1～90重量％，更優(yōu)選1～50重量％。
由本發(fā)明的組合物形成的或者是含有本發(fā)明的組合物的食品或醫(yī)藥品，其一次給予量中乳酸菌發(fā)酵海帶或乳酸菌發(fā)酵芝麻大豆海帶的含量以干燥重量換算一般為1～10000mg，優(yōu)選10～10000mg，但本發(fā)明組合物的安全性高，因此其含量實際上不存在上限。
本發(fā)明的組合物由食品材料制造，因此安全性高，可以短期或長期地日常攝取或間隔適當天數(shù)后繼續(xù)攝取。因此，作為飲食物或健康食品攝取時，通過長期調(diào)節(jié)免疫功能，可以防止各種原因引起的免疫功能低下。而且，通過調(diào)節(jié)免疫功能的平衡，還可以防止對生物體產(chǎn)生不良影響的免疫功能的過度亢進。
此外，本發(fā)明的組合物作為醫(yī)藥品投與后，能夠以溫和的效力緩和或治愈因免疫功能低下或免疫功能過度亢進引起的各種癥狀。
進而，本發(fā)明的組合物還可以高效地利用海帶、大豆及芝麻所具有的良好的營養(yǎng)價值和功能。


圖1表示用S-PT84株、未發(fā)酵海帶、發(fā)酵海帶、發(fā)酵芝麻大豆海帶處理后的小鼠的巨噬細胞IL-12產(chǎn)生量的測定結果。
圖2表示攝取未發(fā)酵海帶、發(fā)酵海帶、未發(fā)酵芝麻大豆海帶、發(fā)酵芝麻大豆海帶后的小鼠的巨噬細胞IL-12產(chǎn)生量。
圖3表示攝取S-PT84、未發(fā)酵海帶、發(fā)酵海帶后的小鼠的脾淋巴細胞NK活性。
圖4表示攝取S-PT84、未發(fā)酵海帶、發(fā)酵海帶后的小鼠的脾淋巴細胞IFN-γ、IL-4產(chǎn)生量。
圖5表示攝取S-PT84、未發(fā)酵海帶、發(fā)酵海帶后的小鼠的脾淋巴細胞Th1/Th2平衡。
圖6表示分別經(jīng)口攝取S-PT84、發(fā)酵組合物后的小鼠的脾淋巴細胞NK活性的測定結果。
圖7表示分別經(jīng)口攝取S-PT84、發(fā)酵組合物后的小鼠的脾細胞IL-4產(chǎn)生情況的測定結果。
圖8表示分別經(jīng)口攝取S-PT84、發(fā)酵組合物后的小鼠的脾細胞IFN-γ產(chǎn)生情況的測定結果。
圖9表示在應激下分別經(jīng)口攝取S-PT84、發(fā)酵組合物后的小鼠的脾細胞NK活性的測定結果。
圖10表示在應激下分別經(jīng)口攝取S-PT84、發(fā)酵組合物后的小鼠的脾細胞IL-4產(chǎn)生情況的測定結果。
圖11表示在應激下分別經(jīng)口攝取S-PT84、發(fā)酵組合物后的小鼠的脾細胞IFN-γ產(chǎn)生情況的測定結果。
圖12表示分別經(jīng)口攝取S-PT84、未發(fā)酵組合物、S-PT84+未發(fā)酵組合物、發(fā)酵組合物后的OVA致敏小鼠的總IgE濃度的測定結果。
圖13表示分別經(jīng)口攝取S-PT84+未發(fā)酵組合物、發(fā)酵組合物后的OVA致敏小鼠的脾細胞IL-4產(chǎn)生情況的測定結果。
圖14表示分別經(jīng)口攝取S-PT84+未發(fā)酵組合物、發(fā)酵組合物后的OVA致敏小鼠的脾細胞IFN-γ產(chǎn)生情況的測定結果。
圖15表示分別經(jīng)口攝取S-PT84、發(fā)酵組合物后的小鼠的腸道腔中總IgA量的測定結果。
圖16表示分別經(jīng)口攝取S-PT84、發(fā)酵組合物后的小鼠的派伊爾結細胞IL-4產(chǎn)生情況的測定結果。
圖17表示分別經(jīng)口攝取S-PT84、發(fā)酵組合物后的小鼠的派伊爾結細胞IFN-γ產(chǎn)生情況的測定結果。
圖18表示分別經(jīng)口攝取未發(fā)酵海帶或發(fā)酵海帶后的小鼠的Salcoma180腫瘤大小的測定結果。
圖19表示攝取發(fā)酵粒后的人的NK活性的測定結果。
圖20表示攝取發(fā)酵粒后的人的NK活性變化量。
圖21表示攝取發(fā)酵粒后的人的Th1/Th2比的變化量。
實施例下面，通過列舉實施例，詳細地說明本發(fā)明的組合物。但是，本發(fā)明不限于實施例。
試驗例1 乳酸菌發(fā)酵試驗(1)研究了利用乳酸菌發(fā)酵海帶的可能性。海帶采用的是粉末狀海帶(日本燒津水產(chǎn)化學工業(yè)株式會社生產(chǎn)、商品名“海帶粉”)。在粉末狀海帶中添加蒸餾水混合成海帶∶水＝5∶95(重量比)的混合液，將該混合液在110℃下滅菌1分鐘，然后用表1所示的八種乳酸菌(A～F)(參照日本特開2005-333919號公報)中的一種作為起子(starter)，以0.5％植菌。得到的混合物在37℃下發(fā)酵48小時，測定發(fā)酵前的pH值和發(fā)酵后的pH值，并測定了乳酸菌A～D發(fā)酵后的菌數(shù)。另外，表中的乳酸菌A(S-PT84)作為FERM ABP-10028被寄存在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物寄存中心。


發(fā)酵后的菌數(shù)以及發(fā)酵前的pH值和發(fā)酵后的pH值的結果見表2。利用八種乳酸菌中的任何一種，均可發(fā)現(xiàn)乳酸菌數(shù)增加及/或pH值的下降，表明乳酸菌能發(fā)酵海帶。


實驗例2乳酸菌發(fā)酵試驗(2)研究了利用試驗例1中使用的乳酸菌來發(fā)酵芝麻及大豆的可能性。芝麻采用的是竹本油脂株式會社生產(chǎn)的糊狀芝麻(商品名“純芝麻醬·黑”)，大豆采用的是小林桂株式會社生產(chǎn)的粉末狀大豆(商品名“熟黑大豆粉”)。添加蒸餾水混合制成芝麻∶水＝25∶75(重量比)、大豆∶水＝15∶85(重量比)，與試驗例1同樣，進行滅菌、發(fā)酵處理，測定發(fā)酵前的pH值和發(fā)酵后的pH值，測定發(fā)酵后的菌數(shù)。另外，在測定發(fā)酵后的菌數(shù)時，芝麻測定了八種乳酸菌發(fā)酵后的菌數(shù)，而大豆測定了乳酸菌A～D發(fā)酵后的菌數(shù)。
發(fā)酵后的菌數(shù)以及發(fā)酵前的pH值和發(fā)酵后的pH值的結果見表3。使用八種乳酸菌中的任何一種，均可發(fā)現(xiàn)乳酸菌數(shù)增加及/或pH值的下降，表明乳酸菌能發(fā)酵芝麻及大豆。


實施例1海帶的乳酸菌發(fā)酵物的制備海帶采用的是燒津水產(chǎn)化學工業(yè)株式會社生產(chǎn)的粉末狀海帶(商品名“海帶粉”)(以下稱為“未發(fā)酵海帶”)。在未發(fā)酵海帶中添加分散了藻酸裂解酶(Nagasechemtex公司生產(chǎn))的滅菌水，在90℃下加熱滅菌20分鐘。作為起子(starter)，采用的是將乳酸菌(Lactobacillus.Pentosus S-PT84株)在2％葡萄糖、1％酵母提取物(日本三菱化學食品株式會社)、1％大豆蛋白(日本不二制油株式會社生產(chǎn))的營養(yǎng)條件下培養(yǎng)20小時而得到的生產(chǎn)用起子(bulk starter)。將該起子添加到進行了滅菌處理的海帶混合液中，在溫度約為37℃下，進行了約14小時的發(fā)酵。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵液在90℃下加熱殺菌10分鐘，冷卻，用20目過濾網(wǎng)過濾，得到的濾液用噴霧干燥機(日本Buchi株式會社制造，Minispray Dryer B-290型)進行干燥，得到海帶的乳酸菌發(fā)酵組合物(以下將其稱為“發(fā)酵海帶”)。
實施例2芝麻·大豆·海帶混合物(芝麻大豆海帶)的乳酸菌發(fā)酵物的制備芝麻采用的是竹本油脂株式會社生產(chǎn)的“純芝麻醬·黑”，大豆采用的是小林桂株式會社的“熟黑大豆粉”，海帶采用的是與實施例1同樣的經(jīng)藻酸裂解酶(Nagasechemtex公司生產(chǎn))處理的燒津水產(chǎn)化學工業(yè)株式會社生產(chǎn)的“海帶粉”。將芝麻、大豆及海帶混合成芝麻∶大豆∶海帶為1∶3∶1(重量比)的混合物(以下稱為“未發(fā)酵芝麻大豆海帶”或“未發(fā)酵組合物”)，作為發(fā)酵促進添加物，在該混合物中添加黑砂糖(與芝麻的重量比為1/3)、大豆蛋白(與芝麻的重量比為1/15)。該芝麻·大豆·海帶混合物與實施例1同樣地發(fā)酵后，將發(fā)酵物在90℃下加熱殺菌10分鐘，冷卻，用20目過濾網(wǎng)過濾，得到的濾液用噴霧干燥機(日本Buchi株式會社制造，Minispray Dryer B-290型)進行干燥，制得芝麻·大豆·海帶混合物的乳酸菌發(fā)酵組合物(以下稱為“發(fā)酵芝麻大豆海帶”或“發(fā)酵組合物”)。
實施例3對巨噬細胞產(chǎn)生IL-12的促進作用(In vitro試驗)給C57BL/6小鼠(7周齡、雄性、10只、清水實驗材料)的腹腔內(nèi)以每只5mL給予PBS(Phosphate-Buffer Salines)，無菌回收腹腔內(nèi)細胞。將回收的細胞用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基洗滌(含有10％FBS(胎牛血清)的RPMI1640培養(yǎng)基(日本日水制藥株式會社))，用溶血緩沖液溶血除去紅細胞。即，在回收的細胞中加入1mL溶血緩沖液(155mM NH4Cl、10mMKHCO3、0.1mM EDTA)，在室溫下，靜置2～3分鐘，加入9mL細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。攪拌后，離心分離(20℃、1500rpm、3分鐘)，沉淀物用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基洗滌一次。用血細胞計算板計測細胞數(shù)，用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基將濃度調(diào)制成1×106cells/mL，以每孔500μL種入48孔培養(yǎng)板內(nèi)(組織培養(yǎng)板)。將其在5％CO2、37℃下培養(yǎng)3小時后，通過除去培養(yǎng)基除去非貼壁細胞，再次添加細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。
稱取一定量實施例1及2中得到的未發(fā)酵海帶、發(fā)酵海帶以及發(fā)酵芝麻大豆海帶，在乳缽中粉碎，懸浮在細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中(未發(fā)酵海帶懸浮液、發(fā)酵海帶懸浮液、發(fā)酵芝麻大豆海帶懸浮液)，作為樣品。將這些樣品以最終濃度分別為1μg/mL及10μg/mL添加到上述細胞板上，在5％CO2、37℃下培養(yǎng)18小時。作為比較，將S-PT84(干燥死菌)懸浮在細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中制成的懸浮液，以最終濃度為1.5ng/mL及15ng/mL添加，在5％CO2、37℃下培養(yǎng)18小時。另外，S-PT84株的最終濃度是與1μg/mL及10μg/mL發(fā)酵芝麻大豆海帶懸浮液中S-PT84株的量相當?shù)臐舛?。培養(yǎng)上清中含有的細胞因子的量(白細胞介素12；IL-12)用ELISA試劑盒(OptEIA、BD Pharmingen公司)測定。此外，以沒有添加任何物質(zhì)的培養(yǎng)液作為對照(Cont)，按同樣的方法進行測定。
培養(yǎng)上清中IL-12濃度的試驗結果(N＝2的平均值)見圖1。結果發(fā)現(xiàn)未發(fā)酵海帶、發(fā)酵海帶、發(fā)酵芝麻大豆海帶的高濃度添加使培養(yǎng)液中IL-12濃度上升。還提示添加發(fā)酵海帶比添加未發(fā)酵海帶時，IL-12濃度增加，而且添加發(fā)酵芝麻大豆海帶比添加發(fā)酵海帶時，IL-12濃度增加。以上的結果表明，發(fā)酵海帶的免疫賦活作用比未發(fā)酵海帶強，而發(fā)酵芝麻大豆海帶的免疫賦活作用比發(fā)酵海帶強。
實施例4對巨噬細胞產(chǎn)生IL-12的促進作用(Ex vivo試驗)將C57BL/6小鼠(7周齡、雄性、15只)分成平均體重大致相同的5組，每組3只。組的構成為無處置組(Control)、未發(fā)酵海帶給予組(10mg/小鼠)、發(fā)酵海帶給予組(10mg/小鼠)、未發(fā)酵芝麻大豆海帶給予組(10mg/小鼠)、發(fā)酵芝麻大豆海帶給予組(10mg/小鼠)。除Control外，各給予組分別以0.5mL每只的量腹腔內(nèi)給予懸浮液，上述懸浮液為在實施例1及2中得到的未發(fā)酵海帶、發(fā)酵海帶、未發(fā)酵芝麻大豆海帶及發(fā)酵芝麻大豆海帶中添加PBS而制成的濃度為20mg/mL的懸浮液。給予18小時后，腹腔內(nèi)給予5mL的PBS，無菌回收腹腔內(nèi)細胞?；厥盏募毎眉毎囵B(yǎng)用培養(yǎng)基洗滌，按照實施例3的方法，用溶血緩沖液除去紅細胞。用血細胞計算板計測細胞數(shù)，用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基將濃度調(diào)制成2×106cells/mL，以每孔500μL種入48孔培養(yǎng)板(組織培養(yǎng)板)內(nèi)。將其在5％CO2、37℃下培養(yǎng)3小時后，除去非貼壁細胞，添加LPS(Lipopolysaccharide)使最終濃度成為100ng/mL，在5％CO2、37℃下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)上清中含有的IL-12量用ELISA試劑盒(OptEIA、BDPharmingen公司)測定。
培養(yǎng)上清中IL-12濃度的測定結果(N＝2～3的平均值)見圖2。此結果表明，在未發(fā)酵海帶給予組及未發(fā)酵芝麻大豆海帶給予組中沒有發(fā)現(xiàn)IL-12濃度增加，而在發(fā)酵海帶給予組及發(fā)酵芝麻大豆海帶給予組中IL-12的產(chǎn)生大大增加，尤其在發(fā)酵芝麻大豆海帶給予組中IL-12的產(chǎn)生量顯著上升。以上的結果表明，未發(fā)酵海帶、未發(fā)酵芝麻大豆海帶沒有增強LPS刺激引起的巨嗜細胞活化的效應，而發(fā)酵海帶、發(fā)酵芝麻大豆海帶具有上述效應，而且發(fā)酵芝麻大豆海帶的該效應比發(fā)酵海帶更強。
實施例3及4的結果顯示，本發(fā)明的組合物具有從其發(fā)酵原料中預測不到的良好的免疫調(diào)節(jié)作用。
實施例5海帶發(fā)酵物對NK活性及Th1細胞和Th2細胞的平衡(Th1/Th2比)的影響將12只C57BL/6小鼠(6周齡、雄性)分成平均體重大致相同的4組，每組3只。組的構成為無添加組(Control)、S-PT84給予組、未發(fā)酵海帶給予組及發(fā)酵海帶給予組。除無添加組外，在各給予組中，以每只0.75mg/kg給予S-PT84(干燥死菌)(S-PT84給予組)、以每只500mg/kg給予實施例1的未發(fā)酵海帶(未發(fā)酵海帶給予組)及發(fā)酵海帶(發(fā)酵海帶給予組)，連日強制經(jīng)口投與。另外，S-PT84給予組中S-PT84的量相當與發(fā)酵芝麻大豆海帶中S-PT84的量。在投與開始第七天，無菌取出脾臟，在細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中(含10％胎牛血清、0.2％抗生素-抗真菌制劑混合溶液(Nacalai Tesque公司生產(chǎn))的RPMI 1640培養(yǎng)基)通過在細胞過濾器(70μm、BD Falcon公司生產(chǎn))上輕輕壓迫取得細胞。用pipetting分散細胞后，離心分離(1500rpm、3分鐘、4℃)。按照實施例3的方法，溶血除去紅細胞后，制備脾淋巴細胞。該脾淋巴細胞的NK活性通過PINK法測定(所謂PINK法，即用疏水性膜系熒光色素3，3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)標記靶細胞Yac-1，再用膜不透過性核酸嵌入型熒光色素propidium iodide(PI)對死細胞的核進行雙重染色，沒受傷害的Yac-1為Dio單染色，受到傷害的Yac-1為雙重染色，通過流式細胞儀檢出，從而算出小鼠脾細胞的細胞毒活性)。此外，在刀豆素A(2.5μg/mL)的刺激下培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)上清中產(chǎn)生的IFN-γ及IL-4的量通過使用了OptEIA(BD Pharmingen公司)的ELISA法測定。
NK活性的結果見圖3。在圖3中，NK activity(％)表示對小鼠脾淋巴細胞Yac-1(是小鼠淋巴瘤細胞，標準上用作小鼠NK細胞的敏感細胞。結果顯示小鼠脾淋巴細胞∶Yac-1＝20∶1以及10∶1的數(shù)據(jù)。)的細胞毒性。圖3表明，與對照組比較，NK活性以S-PT84給予組、未發(fā)酵海帶給予組、海帶發(fā)酵物給予組的順序依次增加。
IFN-γ濃度及IL-4濃度、平衡指標Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)的結果分別見圖4、5。圖4、5表明，與對照組比較，IFN-γ濃度在S-PT84給予組中沒有變化，而在未發(fā)酵海帶給予組中增加，在發(fā)酵海帶給予組中顯著增加。另一方面，與對照組比較，IL-4濃度在任何一組給予組中均有少許增加，但增加停留在40～70％。Th1/Th2在S-PT84給予組、未發(fā)酵海帶給予組中沒有變化，只有在發(fā)酵海帶給予組中Th1占優(yōu)勢。以上的結果表明，發(fā)酵海帶具有增強穩(wěn)定狀態(tài)時的免疫功能的作用，還具有將Th1/Th2平衡向Th1調(diào)節(jié)的作用。
該實施例的結果表明，發(fā)酵海帶具有免疫賦活作用，還具有很強的將Th1/Th2平衡向Th1占優(yōu)勢的狀態(tài)調(diào)節(jié)的作用。
實施例6發(fā)酵芝麻大豆海帶對NK活性及Th1細胞和Th2細胞的平衡(Th1/Th2比)的影響將18只C57BL/6小鼠(6周齡、雄性)分成平均體重大致相同的3組，每組6只。組的構成為無添加組(Control)、S-PT84攝入組(S-PT84)以及實施例2中得到的發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組(發(fā)酵組合物)。讓各攝入組分別攝取添加了S-PT84(干燥死菌)并使其占0.0075重量％的固體飼料、添加了發(fā)酵芝麻大豆海帶并使其占5重量％的固體飼料，自由攝食一周。另外，S-PT84攝入組中S-PT84的量相當于發(fā)酵芝麻大豆海帶中S-PT84的量。在攝取開始第八天，取出脾臟，按照與實施例5相同的方法制備脾淋巴細胞。按照與實施例5相同的方法，測定得到的脾淋巴細胞的NK活性(PINK法)及刀豆素A(2.5μg/mL、24小時)刺激后的IL-4及IFN-γ濃度。
NK活性的結果見圖6。在圖6中，NK activity(％)表示對小鼠脾淋巴細胞的Yac-1(是小鼠淋巴瘤細胞，標準上用作小鼠NK細胞的敏感細胞。結果顯示小鼠脾淋巴細胞∶Yac-1＝80∶1的數(shù)據(jù)。)的細胞毒性。圖6表明，與無添加組比較，在S-PT84攝入組中NK活性提高，在發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中NK活性的提高更加顯著。因此提示本發(fā)明組合物具有免疫賦活作用。
IL-4濃度、IFN-γ濃度的結果分別見圖7、8。圖7表明，IL-4濃度沒有因攝取S-PT84及攝取發(fā)酵芝麻大豆海帶而發(fā)生變化。另一方面，由圖8可知，與無添加組比較，IFN-γ濃度在S-PT84攝入組中上升，在發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中顯著上升。
即，該實施例表明本發(fā)明組合物將Th1/Th2平衡向Th1占優(yōu)勢的狀態(tài)調(diào)節(jié)。
實施例7發(fā)酵芝麻大豆海帶對應激所致的免疫低下以及Th1細胞和Th2細胞的平衡(Th1/Th2比)的影響將24只C57BL/6小鼠(6周齡、雄性)分成平均體重大致相同的4組，每組6只。組的構成為無處置組(Control)、應激組(Stress)、應激+S-PT84攝入組(S-PT84)以及應激+實施例2中得到的發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組(發(fā)酵組合物)。讓各攝入組攝取添加了S-PT84(干燥死菌)并使其占0.0075重量％的固體飼料、添加了發(fā)酵芝麻大豆海帶并使其占5重量％的固體飼料，自由攝食一周。另外，S-PT84攝入組中S-PT84的量相當于發(fā)酵芝麻大豆海帶中S-PT84的量。在攝取開始第八天，將應激組的18只小鼠水浸(submerge)一次后，放入頂端開有空氣孔的50mL聚乙烯管中，束縛24小時。無處置組進行24小時絕水絕食。然后，按照與實施例5同樣的方法，取出脾臟，制備脾淋巴細胞，測定NK活性(PINK法)。還測定了刀豆素A(2.5μg/mL、24小時)刺激后的IL-4及IFN-γ濃度。
NK活性的結果見圖9。在圖9中，NK activity(％)表示對小鼠脾淋巴細胞的Yac-1的細胞毒性。圖9表明，與無處置組比較，NK活性在應激組(Stress)中下降。在S-PT84攝入組中，由應激所致的NK活性下降得到了抑制，在發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中，NK活性維持在無處置組的水平。IL-4濃度及IFN-γ濃度的結果見圖10、11。圖10、11表明，應激使IL-4及IFN-γ濃度均顯著下降(Stress)。該組中IFN-γ濃度的下降比IL-4濃度的下降更加顯著，因此認為Th1/Th2平衡中Th2占優(yōu)勢。應激下的IL-4濃度沒有因攝取S-PT84及攝取發(fā)酵芝麻大豆海帶而發(fā)生變化。但另一方面，與應激組比較，IFN-γ濃度在S-PT84攝入組中上升，在發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中顯著上升。
以上的結果表明，芝麻·大豆·海帶的乳酸菌發(fā)酵物(發(fā)酵芝麻大豆海帶)不僅能增強穩(wěn)定狀態(tài)時的免疫功能，還能抑制由應激所致的免疫低下。還發(fā)現(xiàn)不是在單獨攝取乳酸菌時而是在發(fā)酵芝麻大豆海帶中，該效果顯著。
實施例8發(fā)酵芝麻大豆海帶的抗變態(tài)反應作用將BALB/C小鼠(7周齡、雄性)分成6組。組的構成為i)無處置組(Normal)(3只)、ii)對照組(Control)(9只)、iii)S-PT84(干燥死菌0.0075％混餌)攝入組(12只)、iv)實施例2得到的未發(fā)酵芝麻大豆海帶(5％混餌)攝入組(未發(fā)酵組合物)(9只)、v)S-PT84(0.0075％混餌)+未發(fā)酵芝麻大豆海帶(5％混餌)攝入組(10只)、vi)實施例2得到的發(fā)酵芝麻大豆海帶(5％混餌)攝入組(發(fā)酵組合物)(8只)。另外，在S-PT84組和S-PT84+未發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中，飼料中添加了與發(fā)酵芝麻大豆海帶中含有的菌數(shù)相當菌數(shù)的S-PT84。分別讓無處置組、對照組自由攝食AIN-93M(日本Oriental Bio-service株式會社生產(chǎn))普通飼料，讓其余組自由攝食AIN-93M中混合了上述特定成分而制成的特殊飼料。在攝取開始的一周后及兩周后，混合20μg卵白蛋白(OVA)和2mg氫氧化鋁凝膠，給無處置組外的其余五組的小鼠腹腔內(nèi)投與。攝取開始4周后，進行心臟采血，制備血清飼料，測定血清中總IgE濃度。此時還分離、培養(yǎng)脾細胞，在刀豆素A(2.5μg/mL)刺激下培養(yǎng)24小時，測定培養(yǎng)上清中產(chǎn)生的IFN-γ及IL-4的量。通過使用了OptEIA(BDPharmingen公司生產(chǎn))的ELISA法測定總IgE、IFN-γ、IL-4。另外，各組的飼料總攝取量均約為3.0g。
總IgE濃度的試驗結果見圖12。圖12表明，只有發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組顯著地抑制了IgE的上升。
各組脾細胞經(jīng)刀豆素A刺激后的IL-4產(chǎn)生量見圖13。與無處置組比較，投與OVA使IL-4的產(chǎn)生量降低(對照組)。在S-PT84+未發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中，IL-4的產(chǎn)生量更低。但是，與對照組比較，在發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中，IL-4的產(chǎn)生量上升。
各組脾細胞經(jīng)刀豆素A刺激后的IFN-γ產(chǎn)生量見圖14。與無處置組比較，投與OVA使IFN-γ的產(chǎn)生量降低(對照組)。但是，與對照組比較，在S-PT84+未發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組、發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中，IFN-γ的產(chǎn)生量上升。該效應在發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中尤其顯著。
此實施例的結果表明，本發(fā)明的發(fā)酵芝麻大豆海帶具有抗變態(tài)反應作用。此外，攝取未發(fā)酵芝麻大豆海帶、未發(fā)酵芝麻大豆海帶+乳酸菌沒有抗變態(tài)反應作用。因此表明為了發(fā)揮抗變態(tài)反應作用，對芝麻·大豆·海帶進行乳酸菌發(fā)酵是很重要的。
實施例9由發(fā)酵芝麻大豆海帶經(jīng)口攝取引起的IgA分泌增強作用將C57BL/6小鼠(7周齡、雄性)分成平均體重大致相同的3組。組的構成為對照組(Control)(7只)、S-PT84(干燥死菌0.0075％混餌)攝入組(9只)以及實施例2得到的發(fā)酵芝麻大豆海帶(5％混餌)攝入組(發(fā)酵組合物)(9只)。另外，S-PT84組使用與發(fā)酵芝麻大豆海帶中含有的菌數(shù)相當?shù)木鷶?shù)的S-PT84。分別讓對照組自由攝食AIN-93M普通飼料，讓其余組自由攝食AIN-93M普通飼料中混合了上述特定成分而制成的特殊飼料。在攝取開始1周后，取出小腸，用PBS將內(nèi)部洗凈后，添加4倍量含有0.05％Tween20的PBS，用POLYTRON勻漿器勻質(zhì)化。離心分離后，回收上清，得到小腸壁提取物。小腸壁提取物中IgA的量用ELISA法測定(Purified IgA Antibody作為一抗，Biotin Conjugate IgAAntibody作為二抗(均由Southern Biotech公司生產(chǎn))，用Avidin-Horseradish peroxidase Conjugate顯色)。
IgA的量見圖15。圖15表明，與對照組比較，在發(fā)酵芝麻大豆海帶攝入組中，小腸壁提取物中IgA的量顯著上升。本發(fā)明發(fā)酵芝麻大豆海帶的該作用比單獨攝取S-PT84時更強。
實施例10經(jīng)口攝取發(fā)酵芝麻大豆海帶對腸道免疫活性細胞產(chǎn)生細胞因子的促進作用將C57BL/6小鼠(7周齡、雄性)分成平均體重大致相同的3組。組的構成為對照組(7只)、S-PT84攝入組(干燥死菌0.0075％混餌)(9只)以及實施例2得到的發(fā)酵芝麻大豆海帶(5％混餌)攝入組(9只發(fā)酵組合物)。分別讓對照組自由攝食AIN-93M普通飼料，讓其余組自由攝食AIN-93M普通飼料中混合了上述特定成分而制成的特殊飼料。一周后，取出派伊爾結，在細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中(含10％胎牛血清、0.2％抗生素-抗真菌制劑混合溶液(Nacalai Tesque公司生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基)通過在細胞過濾器(70μm、BD Falcon公司生產(chǎn))上輕輕壓迫從而取得細胞，制備派伊爾結細胞樣品。在添加了10％FBS的RPMI培養(yǎng)基中，用刀豆素A 2.5μg/mL對5×106個細胞作用24小時，上清中產(chǎn)生的IL-4以及IFN-γ的量通過使用了OptEIA(BD Pharmingen公司)的ELISA法測定。IL-4產(chǎn)生量的試驗結果見圖16，IFN-γ產(chǎn)生量的試驗結果見圖17。
圖16及圖17表明，與對照組比較，來自攝取發(fā)酵芝麻大豆海帶小鼠的派伊爾結細胞的IFN-γ以及IL-4的產(chǎn)生量顯著上升。而另一方面，在乳酸菌攝入組(S-PT84)中沒有發(fā)現(xiàn)上述作用。
實施例9以及實施例10的結果表明，不是單獨攝取乳酸菌而是只有當經(jīng)口攝取發(fā)酵芝麻大豆海帶時才有腸道免疫賦活作用。本發(fā)明的發(fā)酵組合物的上述效應是無法從發(fā)酵原料的作用中預測得到的。
實施例11海帶發(fā)酵物的抗腫瘤作用將ddy小鼠(日本SLC(株))分成3組(每組10只)，連日強制經(jīng)口給予水(0.6mL)、50mg/kg未發(fā)酵海帶(500mg/kg)、發(fā)酵海帶(500mg/kg)。強制經(jīng)口投與開始的第二天，于小鼠胸部以每只1×106cells皮下接種Sarcoma180肉瘤細胞，制備Sarcoma180致癌小鼠。對Sarcoma180致癌小鼠繼續(xù)經(jīng)口投與18天。試驗期間，測量腫瘤徑，按照(I)式求得腫瘤大小(圖18)。其結果為，未發(fā)酵海帶給予組和發(fā)酵海帶給予組的腫瘤大小分別與給予水的對照組比較，腫瘤變小，在發(fā)酵海帶給予組中，腫瘤接種11天、15天以及19天后的腫瘤大小顯著變小。由此可知，發(fā)酵海帶具有更好的抗腫瘤作用。
(I)腫瘤大小(mm2)＝最大徑(mm)×最小徑×3.14實施例12采用實施例2中制備的芝麻、大豆以及海帶的乳酸菌發(fā)酵組合物(發(fā)酵芝麻大豆海帶)，按表4所示的配方，制造含有發(fā)酵芝麻大豆海帶的丸劑(以下稱發(fā)酵粒)(1粒的重量350mg)。具體為，在發(fā)酵芝麻大豆海帶中混合賦形劑、用于調(diào)味的甜味劑等原料，在捏合機中捏合后，于制丸機中成型，制成丸劑。適度干燥后，用蟲膠對顆粒表面進行包衣。另外，對發(fā)酵芝麻大豆海帶沒有實施在丸劑制造中通常進行的素丸表面拋光工序。同時還制造了不含發(fā)酵芝麻大豆海帶的丸劑(形狀與發(fā)酵粒相同)，作為安慰劑。各配方見表4。


將上述丸劑給公司內(nèi)部40名健康志愿者服用，每天30粒(發(fā)酵芝麻大豆海帶為4.7g/天)，對免疫調(diào)節(jié)作用進行了研究。攝取試驗采用交叉試驗來進行。即，將受試者分成以NK活性、年齡、性別為基準且在統(tǒng)計學上沒有差異的兩組，作為攝取樣品，讓各組攝取發(fā)酵粒或形狀相同的安慰劑，攝取4周(攝取期間I)，洗脫期設為6周。然后，更換各組的攝取樣品，再攝取1個月的安慰劑或發(fā)酵粒(攝取期間II)。在攝取期間的前后進行采血，用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法(Nycomed Pharma公司)制備白細胞，測定NK活性。關于NK活性，以白細胞∶K562＝20∶1，用PINK法測定以K562為靶細胞的細胞毒活性。此外，白細胞在PHA(phytohemagglutinin)存在下培養(yǎng)22小時，測定培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4的產(chǎn)生量，分析了Th1/Th2平衡。
NK活性的試驗結果見圖19。攝取發(fā)酵粒使攝取期間I、II的NK活性顯著提高。求出圖19中攝取期間I、II的NK活性變化量(攝取前后的差ΔNK活性)，算出其平均值。結果見圖20。與安慰劑攝入組比較，發(fā)酵粒攝入組的NK活性變化量顯著。
接著，測定PHA刺激后白細胞產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4的量，求出攝取期間I、II中Th1/Th2比(IFN-γ的產(chǎn)生量/IL-4的產(chǎn)生量)的變化量(攝取前后的差ΔTh1/Th2)，算出其平均值。結果見圖21。與安慰劑攝入組比較，發(fā)酵粒攝入組中Th1/Th2比的變化量顯著，提示了通過攝取發(fā)酵粒使Th1占優(yōu)勢。
本發(fā)明不限于上述各實施方式，可以在權利要求范圍內(nèi)進行種種變形，且通過適宜地組合不同實施方式中公開的各種技術手段而形成的實施方式也包括在本發(fā)明的技術范圍內(nèi)。
權利要求
1.組合物，其含有經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶并具有免疫調(diào)節(jié)作用。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，免疫調(diào)節(jié)作用是免疫賦活作用及/或抗變態(tài)反應作用。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其中，乳酸菌是植物性乳酸菌。
4.組合物，其含有經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶、經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的芝麻和經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的大豆。
5.根據(jù)權利要求4所述的組合物，其中，乳酸菌是植物性乳酸菌。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的組合物，其具有免疫調(diào)節(jié)作用。
7.根據(jù)權利要求6所述的組合物，其中，免疫調(diào)節(jié)作用是免疫賦活作用及/或抗變態(tài)反應作用。
8.根據(jù)權利要求1～7任意一項所述的組合物，其是飲食物、食品添加物、健康食品或醫(yī)藥組合物。
9.根據(jù)權利要求1～8任意一項所述的組合物，其形態(tài)是丸劑。
全文摘要
本發(fā)明提供發(fā)揮免疫賦活作用、抗變態(tài)反應作用等免疫調(diào)節(jié)作用的新型組合物。本發(fā)明提供單獨含有經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的海帶的組合物或含有該海帶與經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的芝麻、大豆的組合的組合物。該組合物能使營養(yǎng)成分均衡地被吸收，安全性高，且具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。
文檔編號A61P37/00GK1853656SQ20061005878
公開日2006年11月1日 申請日期2006年3月3日 優(yōu)先權日2005年3月4日
發(fā)明者野中裕司, 泉扶實, 出云貴幸 申請人:三得利株式會社