專利名稱：豬解耦聯(lián)蛋白基因2核苷酸序列及其多態(tài)性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬解耦聯(lián)蛋白基因2核苷酸序列及其多態(tài)性的檢測方法。
背景技術(shù)：
早在七十年代，人們就發(fā)現(xiàn)冬眠哺乳動物(如熊和耐寒冷的嚙齒動物)能利用體內(nèi)褐色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT，也稱紅脂)，產(chǎn)生熱量維持體溫的現(xiàn)象。法國巴黎國家科學(xué)研究中心的科學(xué)家RICQUIER通過比較冷熱環(huán)境下小鼠體內(nèi)的變化，發(fā)現(xiàn)了一類分子量為32kD的功能未知的蛋白質(zhì)。NICHOLLS和他的同事們通過標記細胞混合物注入BAT內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BAT的線粒體內(nèi)膜存在一質(zhì)子通透性很強的滲透孔，可解離呼吸鏈氧化磷酸化耦聯(lián)作用產(chǎn)生熱量。稍后的研究證實這個滲透孔是位于線粒體內(nèi)膜的一種蛋白質(zhì)，也就是RICQUIER發(fā)現(xiàn)的功能未知的蛋白質(zhì)。由于該蛋白質(zhì)具有解離呼吸鏈氧化磷酸化耦聯(lián)的功能，使BAT中的能量以鈉泵的形式消耗產(chǎn)生熱量，所以將這個未知蛋白稱為解耦聯(lián)蛋白(uncoupling protein，UCP)。由于人類及大多數(shù)哺乳動物的脂肪組織為白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT，也稱白脂)，BAT僅在6月齡前嬰兒體內(nèi)有少量存在，因此BAT中的UCP產(chǎn)熱作用對人類及大多數(shù)動物意義并不大。
1997年，CALIFORNIA大學(xué)DAVIS分校WARDEN的研究小組在BAT以外的其他組織中發(fā)現(xiàn)了一種具有UCP功能的蛋白質(zhì)，因此將已發(fā)現(xiàn)的BAT中存在的UCP稱為UCP1，將新發(fā)現(xiàn)的UCP稱為UCP2；在同一年內(nèi)，瑞士GENVA大學(xué)GIACOBINo的研究小組、波士頓哈佛醫(yī)學(xué)院LOWELL的研究小組和馬里蘭NIDDK實驗室REITMAN的研究小組分別獨立發(fā)現(xiàn)了UCP家族的另一成員——UCP3。最近在人腦組織中還發(fā)現(xiàn)了特異表達的UCP4，基因定位于人6p11.2-q12位置，但結(jié)構(gòu)和功能有待深入研究。目前，UCPs家族包括UCP1、UCP2、UCP3和UCP44個成員。UCP2廣泛存在于動物腦、肌肉、白脂等組織中；UCP3在骨骼肌、脂肪組織(包括白脂和紅脂)中表達最為顯著。研究發(fā)現(xiàn)，UCP2和UCP3基因緊密連鎖以基因簇的形式存在于染色體上，因此研究者們推測這兩個基因可能是起源于同一祖先基因或是同一基因的重復(fù)擴增。人UCP2基因為8.7kb，共有8個外顯子，與UCP1有59％的相似性；UCP3存在兩種轉(zhuǎn)錄形式，UCP3S和UCP3L，UCP3L為312氨基酸組成的34kD的蛋白質(zhì)，UCP3S在C端較UCP3L缺失了37個氨基酸殘基，UCP3L與UCP1有57％的相似性[8]，人UCP2和UCP3基因相距約6000bp，氨基酸相似性為71％，UCP2/3基因簇定位在人染色體11q13位置。小鼠的UCP2/3定位于7號染色體距著絲點50cM的位點，大鼠的定位于1號染色體，豬定位在9p21-p24位置，牛的UCP2/3基因定位于BTA15。
幾乎與UCP1發(fā)現(xiàn)的同時，英國丹地大學(xué)(DUNDEE)的生化學(xué)家NICHOLLS的研究小組發(fā)現(xiàn)了線粒體作為體內(nèi)能量“動力站”(powerhouse)的功能。線粒體內(nèi)膜呼吸鏈(或稱電子傳遞鏈)的氧化作用產(chǎn)生質(zhì)子流，通過與磷酸化的耦聯(lián)作用生產(chǎn)體內(nèi)能量物質(zhì)ATP為細胞活動提供能量。正常情況下，從NADH的氧化磷酸化耦聯(lián)途徑可生成3個ATP分子，即P/O比率為3，當(dāng)存在解耦聯(lián)劑時，由于解耦聯(lián)劑(UCP即為體內(nèi)的解耦聯(lián)劑)可使正常緊密聯(lián)系的氧化過程與磷酸化過程發(fā)生松解甚至完全拆離，相應(yīng)地使P/O比率下降或變?yōu)?，結(jié)果這部分能量轉(zhuǎn)化為熱量的形式消耗。
人與小鼠的一些實驗證明，UCP家族具有解離氧化磷酸化耦聯(lián)而產(chǎn)生熱量的功能。由于白喉毒素是真核生物蛋白質(zhì)合成的抑制劑，白喉毒素A鏈的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)UCP含量低，小鼠表現(xiàn)肥胖。1997年，ENERBACK等制備了UCP1基因敲除的小鼠，小鼠表現(xiàn)為易受寒冷刺激，證實了UCP的解離氧化磷酸化耦聯(lián)的功能，由于實驗小鼠并不表現(xiàn)為肥胖，研究者認為這是由于小鼠體內(nèi)UCP2和UCP3還在發(fā)揮作用的緣故。在人UCP研究中，基因連鎖分析表明，UCP2/3所定位的11q13區(qū)域的微衛(wèi)星標記與機體靜止代謝率緊密連鎖。UCP2基因5’端側(cè)翼序列缺少TATA盒和CAAT盒的啟動序列，但在5’端75bp上游存在一很強的順式調(diào)控增強子，基因突變研究發(fā)現(xiàn)UCP2基因堿基序列的改變與體重指數(shù)(body mass index，BMI)、靜止代謝率(resting metabolic rates，RMR)、脂肪百分含量(percentage of fat，PF)連鎖。NIDDK實驗室的WALDER發(fā)現(xiàn)Pima印度人群UCP2基因的外顯子4存在Ala/Val的錯義突變和外顯子83’端不翻譯區(qū)45bp的插入或缺失以及UCP3基因外顯子3的C/T同義突變。UCP2基因和UCP3基因突變?nèi)巳壕哂休^高的靜止代謝率，在老年人群中發(fā)現(xiàn)與肥胖相關(guān)。通過調(diào)節(jié)瘦蛋白(leptin)的活性控制體重[33]，在缺乏食物的情況下，機體往往動用UCP甚至動用儲存脂肪維持體溫，在正常情況下，機體關(guān)閉UCP活性以節(jié)約能量利用。通常情況下UCP與嘌呤核苷酸結(jié)合(親和力依次為GTP＞ATP＞GDP＞TDP)以非活性態(tài)存在不發(fā)揮功能作用[24]，當(dāng)體內(nèi)需要額外熱量時，刺激神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素，引發(fā)一系列反應(yīng)釋放抑制因子，激活UCP活性。研究表明，甲狀腺素、去甲腎上腺素興奮劑、糖皮質(zhì)激素、肥胖基因產(chǎn)物(leptin)和絕食狀態(tài)均可調(diào)節(jié)UCP2和UCP3活性解離線粒體內(nèi)膜呼吸鏈氧化磷酸化耦聯(lián)作用，減少ATP生成的數(shù)量，降低P/O比率，加快體內(nèi)代謝速度，產(chǎn)生熱量。據(jù)估測，機體約有25％的能量通過氧化磷酸化解耦聯(lián)作用從合成ATP轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生熱量。UCP的能量轉(zhuǎn)化機制見圖1所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬解耦聯(lián)蛋白基因2核苷酸序列，序列中的一個多態(tài)位點及其多態(tài)位點的檢測方法。
一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有豬UCP2蛋白活性的核苷酸序列，SEQ ID No.3，所述的核苷酸序列為豬UCP2外顯子3-4區(qū)段和內(nèi)含子3區(qū)段序列；所述的核苷酸序列與人的相應(yīng)序列從核苷酸3～377位的核苷酸序列有至少89％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與人的相應(yīng)序列從核苷酸3～377位的核苷酸雜交。
豬解聯(lián)蛋白基因2多態(tài)性的檢測方法步驟如下1).取700μl抗凝血中加入35～40μl10％的SDS，室溫下劇烈振蕩后用等體積飽和苯酚抽提兩次，水相加入0.6～0.7倍體積的異丙醇，混勻后室溫下放置。然后離心，倒去上清，沉淀以70～75％的乙醇洗滌，離心后真空或空氣中干燥，沉淀溶于滅菌雙蒸水中。
2)擴增豬UCP2基因序列的引物，擴增片段為UCP2外顯子3、4和內(nèi)含子3，大小為380bp；擴增條件為94℃ 5min，30個循環(huán)的94℃30s、60℃30s、72℃30s，之后，反應(yīng)于72℃延伸7min。
3).取1μL PCR產(chǎn)物，加入5～6μL的上樣緩沖液，98℃變性10min，然后冰浴5min，變性后PCR產(chǎn)物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE，10％)電泳。10V/cm電泳10～12h后，銀染顯色。
解耦聯(lián)蛋白基因家族(UCPs)參與機體能量代謝，對維持機體能量平衡所涉及的體重(肥胖)、靜止代謝率和食物轉(zhuǎn)化效率等性狀具有顯著的影響，已成為近年來眾多遺傳學(xué)家和營養(yǎng)學(xué)家研究的熱點。目前，解耦聯(lián)蛋白基因在豬的生長和能量轉(zhuǎn)化效率性狀上發(fā)現(xiàn)具有顯著的基因效應(yīng)。本發(fā)明通過測定UCP2基因的部分基因組序列(包括第3外顯子、第3內(nèi)含子和第4外顯子)的序列以及采用PCR-SSCP方法分析UCP2基因在生長和能量轉(zhuǎn)化效率存在顯著差異的5個品種豬(長白豬、大白豬、二花臉豬、內(nèi)江豬和五指山豬)上的表現(xiàn)形式及其遺傳特征，并建立用于分析不同肉質(zhì)類型豬解耦聯(lián)蛋白基因2的遺傳與檢測方法。


圖1是UCP的功能及線粒體內(nèi)膜能量轉(zhuǎn)化示意圖；圖2是圖2聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖3是序列分析圖。
具體實施例方式
分離出的DNA分子包括編碼具有豬UCP2蛋白活性的核苷酸序列，SEQ IDNo.3，所述的核苷酸序列為豬UCP2外顯子3-4區(qū)段和內(nèi)含子3區(qū)段序列；所述的核苷酸序列與人的相應(yīng)序列從核苷酸3～377位的核苷酸序列有至少89％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與人的相應(yīng)序列從核苷酸3～377位的核苷酸雜交。在這種分離出的DNA分子內(nèi)含子3區(qū)段序列內(nèi)存在由第272位的T/G堿基替換導(dǎo)致的一個多態(tài)位點。建立了分析該多態(tài)位點的檢測方法多態(tài)性的檢測方法的步驟如下1)取700μl抗凝血中加入35～40μl 10％的SDS，室溫下劇烈振蕩后用等體積飽和苯酚抽提兩次，水相加入0.6～0.7倍體積的異丙醇，混勻后室溫下放置。然后離心，倒去上清，沉淀以70～75％的乙醇洗滌，離心后真空或空氣中干燥，沉淀溶于滅菌雙蒸水中。
2)設(shè)計擴增UCP2基因序列引物，擴增片段為人UCP2外顯子3、4和內(nèi)含子3，大小為380bp；引物序列為UCP2-34F 5′-AGATGCCAGCATTGGGAGCCGC-3′UCP2-34R 5′-ACCTGTCATGAGGTTGGCTTTC-3′擴增條件為94℃5min，30個循環(huán)的94℃30s、60℃30s、72℃30s，之后，反應(yīng)于72℃延伸7min。
3)取1μL PCR產(chǎn)物，加入5～6μL的上樣緩沖液，98℃變性10min，然后冰浴5min，變性后PCR產(chǎn)物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE，10％)電泳。10V/cm電泳10～12h后，銀染顯色。
通過測定編碼豬解耦聯(lián)蛋白(UCP2)的外顯子3-4區(qū)段和內(nèi)含子3區(qū)段的核苷酸序列并進一步用PCR-SSCP方法分析UCP2基因在生長和能量轉(zhuǎn)化效率具有顯著差異的5個品種豬中的表現(xiàn)形式及其遺傳特征，建立檢測豬UCP2的多態(tài)性方法。
①提供一種新的編碼豬解耦聯(lián)蛋白(UCP2)的核苷酸序列(見SEQ ID No.3所示)；該序列由豬UCP2外顯子3-4區(qū)段和內(nèi)含子3區(qū)段構(gòu)成。該核苷酸序列與人的相應(yīng)序列至少有89％的同源性。
②通過PCR-SSCP技術(shù)，對5個不同品種豬的如權(quán)利要求1所述的DNA分子分析發(fā)現(xiàn)，豬群內(nèi)存在一個多態(tài)位點(見圖2)，豬群內(nèi)存在兩種基因型。
③通過對兩種基因型的測序分析，突變型(BB)為第272位的T/G堿基替換(圖3)。導(dǎo)致DNA單鏈構(gòu)像多態(tài)。此突變發(fā)生在第3內(nèi)含子區(qū)域。
④提供了一種新的豬UCP2的多態(tài)性檢測方法，即PCR-SSCP方法。
1.用動物血樣制作模板DNA的方法豬前腔靜脈采血10ml。取700μl抗凝血中加入35μl 10％的SDS，室溫下劇烈振蕩數(shù)分鐘后加入等體積飽和苯酚抽提兩次，每次振蕩15分鐘，12000g離心2分鐘，水相加入5M的NaCl至終濃度為0.25M，混勻，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后室溫下放置10分鐘。12000g離心5分鐘，沉淀以70％的乙醇洗滌，離心后真空或空氣中干燥，溶于20μl滅菌雙蒸水中。
2.根據(jù)已報道的人UCP2基因序列(GenBank accession numberAF096289)設(shè)計引物，擴增片段為人UCP2外顯子3和4，大小為380bp。
引物序列為UCP2-34F 5′-AGATGCCAGCATTGGGAGCCGC-3′UCP2-34R 5′-ACCTGTCATGAGGTTGGCTTTC-3′擴增條件為94℃5min，30個循環(huán)的94℃30s、60℃30s、72℃30s，之后，反應(yīng)于72℃延伸7min。
3.UCP2擴增產(chǎn)物的純化，克隆及其序列測定采用Geneclean試劑盒(Biolab LTD)回收純化UCP2的PCR擴增產(chǎn)物；用PGEM-T載體克隆UCP2的PCR擴增產(chǎn)物；使用ABI PRISM377 DNA測序儀，通過Dye primer試劑盒對純化的PCR擴增產(chǎn)物進行測序。
4.PCR-SSCP方法檢測5品種豬的UCP2基因多態(tài)性PCR-SSCP分析是通過1μL PCR產(chǎn)物和5～6μL的上樣緩沖液(98％甲酰胺、0.025％溴酚藍、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0、10％甘油)，98℃變性10min，然后冰浴5min，使之保持變性狀態(tài)。變性后PCR產(chǎn)物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE，10％)電泳。10V/cm電泳10～12h后，銀染顯色分析。
SEQ ID No.1～3的說明SEQ ID No.1的信息(1)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(2)分子型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.1AGATGCCAGCATTGGGAGCCGC 22SEQ ID No.2的信息(1)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(2)分子型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.2ACCTGTCATGAGGTTGGCTTTC 22SEQ ID No.3的信息(1)序列特征(A)長度379堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(2)分子型多核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.31 AGATGCCAGC ATTGGGAGCC GCCTCCTGGC AGGCAGCACC ACGGGGGCCT TGGCTGTGGC61 CGTGGCCCAG CCAACAGACG TGGTAAAGGT CCGGTTCCAA GCGCAGGCCC GGGCCGGCGG121AGGCCGGCGG TACCGGAGCA CTGTCGACGC CTACAAGACC ATCGCCCGAG AGGAGGGGCT181GCGGGGCCTC TGGAAAGGTG TGTGCGCAGC TCTCTCCCCT CCTCCTCCTC CCCTACTCCC241TGGCCTCACC CAGGCACCCC CCCTTGCTCC CTTAGGGACC TCACCCAATG TCGCTCGTAA301TGCCATTGTC AACTGTGCTG AGCTGGTGAC CTATGACCTC ATCAAGGACA CGCTCCTGAA361AGCCAACCTC ATGACAGGT
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有豬UCP2蛋白活性的核苷酸序列，SEQ ID No.3，所述的核苷酸序列為豬UCP2外顯子3-4區(qū)段和內(nèi)含子3區(qū)段序列；所述的核苷酸序列與人的相應(yīng)序列從核苷酸3～377位的核苷酸序列有至少89％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與人的相應(yīng)序列從核苷酸3～377位的核苷酸雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離出的DNA分子，其特征在于，所說的內(nèi)含子3區(qū)段序列內(nèi)存在一個多態(tài)位點，為第272位的T/G堿基替換。
3.一種豬解聯(lián)蛋白基因2多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，它的步驟如下1).取700μl抗凝血中加入35～40μl10％的SDS，室溫下劇烈振蕩后用等體積飽和苯酚抽提兩次，水相加入0.6～0.7倍體積的異丙醇，混勻后室溫下放置。然后離心，倒去上清，沉淀以70～75％的乙醇洗滌，離心后真空或空氣中干燥，沉淀溶于滅菌雙蒸水中。2)擴增豬UCP2基因序列的引物，擴增片段為UCP2外顯子3、4和內(nèi)含子3，大小為380bp；擴增條件為94℃5min，30個循環(huán)的94℃30s、60℃30s、72℃30s，之后，反應(yīng)于72℃延伸7min。3).取1μL PCR產(chǎn)物，加入5～6μL的上樣緩沖液，98℃變性10min，然后冰浴5min，變性后PCR產(chǎn)物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE，10％)電泳。10V/cm電泳10～12h后，銀染顯色。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種豬解聯(lián)蛋白基因2多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所說的擴增豬UCP2基因序列的引物，其序列為SEQ ID No.1、2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種豬解聯(lián)蛋白基因2多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所說的上樣緩沖液組成為98％甲酰胺、0.025％溴酚藍、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0、10％甘油。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬解耦聯(lián)蛋白基因2核苷酸序列及其多態(tài)性的檢測方法。它包括編碼具有豬UCP2蛋白活性的核苷酸序列，SEQ ID No.3，所述的核苷酸序列為豬UCP2外顯子3－4區(qū)段和內(nèi)含子3區(qū)段序列；所述的核苷酸序列與人的相應(yīng)序列從核苷酸3～377位的核苷酸序列有至少89％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與人的相應(yīng)序列從核苷酸3～377位的核苷酸雜交。豬解耦聯(lián)蛋白家族是線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運蛋白，對維持機體能量平衡所涉及的體重、靜止代謝率和食物轉(zhuǎn)化效率等性狀具有顯著的影響。本發(fā)明為進一步研究UCP2基因?qū)ωi生長和能量轉(zhuǎn)化效率作用、以及新多態(tài)位點對該基因的表達調(diào)控等分子機理打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/12GK1513992SQ0311703
公開日2004年7月21日 申請日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者徐寧迎, 趙興波, 郭曉令, 章勝喬 申請人:浙江大學(xué)