專利名稱：梅嶺霉素c5-酮基還原酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種將梅嶺霉素糖苷配基C5-酮基還原為羥基的C5-酮基還原酶基因，特別是一種梅嶺霉素C5-酮基還原酶基因，屬于基因技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
梅嶺霉素(meilingmycin)是由南昌鏈霉菌(Streptomyces nanchangensis)產(chǎn)生的一種十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它的母核和世界著名抗生素阿弗菌素(avermectin)一致，而側(cè)鏈則完全不同。由于阿弗菌素獨特的作用機制，以及所具有的高效、毒副作用低、安全性高和對環(huán)境影響極小等優(yōu)點，使這一大環(huán)內(nèi)酯類抗生素逐漸成為目前世界上使用最廣泛的驅(qū)線蟲和除殺外寄生蟲抗生素，尤其是該類抗生素防治節(jié)肢動物類寄生蟲病的效果是當(dāng)今其它抗生素不可替代的，阿弗菌素對防治全球性的畜禽寄生蟲病起到了極為重要的作用并獲得了巨大的經(jīng)濟效益，詳見Haruo Ikeda and Satoshi Omura.Avermectin biosynthesis(阿弗菌素的生物合成).Chemical reviews(化學(xué)綜述).1997，97，2591-2609。從母核相同的角度考慮，梅嶺霉素與阿弗菌素有著相似的生物學(xué)活性。實驗證明，梅嶺霉素和阿弗菌素一樣，完全無抗微生物活性，而有廣譜殺蟲活性，并且梅嶺霉素也是通過破壞昆蟲、螨類、圓蟲類的神經(jīng)系統(tǒng)而起作用的，而且殺蟲譜及活性優(yōu)于阿弗菌素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種梅嶺霉素C5-酮基還原酶基因，使其可用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的化合物或蛋白的創(chuàng)新和發(fā)展。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明根據(jù)已知的阿弗菌素生物合成基因簇序列(國際GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號AB032524)，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增出阿弗菌素生物合成基因簇中負責(zé)催化梅阿弗菌素苷配基C5-酮基進行還原的C5-酮基還原酶基因(aveF)片段，并以之為探針進行Southern雜交，從南昌鏈霉菌基因文庫中獲得包含有其同源序列的陽性科斯質(zhì)粒(cosmid)。對其進行核苷酸序列測定和分析后，從南昌鏈霉菌中獲得了與C5-酮基還原酶基因高度同源的基因，被命名為meiF，其核苷酸序列長度為936個堿基對(bp)，編碼311個氨基酸。由AveF的生物學(xué)功能類比，MeiF的生物學(xué)功能是催化梅嶺霉素糖苷配基C5-酮基還原為羥基。
本發(fā)明利用已克隆的基因在抗生素生物合成基因簇中進行同源基因的定向敲除或增加，創(chuàng)造出非天然的“雜合”分子以開辟利用組合生物合成及遺傳工程技術(shù)創(chuàng)新微生物藥物的新途徑，為已知生物活性分子的高產(chǎn)和新微生物農(nóng)藥的創(chuàng)新提供新的技術(shù)和手段。
在藥物的創(chuàng)新方面，可利用已克隆的基因進行下述基因操作(1)基因敲除通過基因置換或基因中斷技術(shù)定向去除或失活不同抗生素生物合成基因簇中的該同源基因，獲得在相應(yīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)處的酮基不發(fā)生還原的新的結(jié)構(gòu)衍生物。
(2)基因加倍通過將該基因克隆至單拷貝或多拷貝基因表達載體上，在異源宿主進行表達，獲得在相應(yīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)處的酮基發(fā)生還原的新的結(jié)構(gòu)衍生物。


圖1由MeiF所催化的梅嶺霉素糖苷配基C5-酮基還原為羥基示意圖具體實施方式
如圖1所示，由AveF的生物學(xué)功能類比，MeiF的生物學(xué)功能是催化梅嶺霉素糖苷配基C5-酮基還原為羥基。以下進一步對本發(fā)明的實施具體描述1、從阿弗菌素產(chǎn)生菌Streptomyces avermitilis NRRL8165中PCR擴增aveF基因部分片段(1)按照《鏈霉菌遺傳操作實驗手冊》(霍普伍德等著，鄧子新等譯，1988，湖南科學(xué)技術(shù)出版社)實驗程序，從阿弗菌素產(chǎn)生菌Streptomyces avermitilisNRRL8165中提取總DNA。
(2)根據(jù)已知的阿弗菌素生物合成基因簇序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號AB032524)，在aveF基因內(nèi)設(shè)計一對引物引物15’ATT CCC GTT GCC GTC ACT CG 3’引物25’GCG GTT CAT GTC GGT GGC GG 3’(3)按以下體系與條件進行PCR反應(yīng)試劑 反應(yīng)濃度 體積(μl)buffer(10x)1x 4DNTP(各2.5mM) 0.2mM 3.2MgCl2(25mM) 1.2mM 2引物1(4μM)0.5μM 5引物2(4μM)0.5μM 5模版總DNA(1μg/μl)1μg 1DMSO(50％) 2.5％ 2Taq DNA聚合酶(5U/μl) 5U 1H2O 16.8步驟 溫度(℃)時間預(yù)變性 94 8分鐘變性 94 30秒退火 60 40秒延伸 72 60秒循環(huán) 352、aveF PCR產(chǎn)物的測序驗證純化705bp PCR擴增產(chǎn)物并進行核苷酸序列測定，與aveF序列進行比較，驗證一致。
3、aveF PCR產(chǎn)物與南昌鏈霉菌NS3226總DNA基因文庫的Southern雜交以純化測序的705bp PCR擴增產(chǎn)物為探針，進行α-P32放射性同位素標記后與南昌鏈霉菌NS3226總DNA基因文庫進行Southern雜交，在高嚴謹度洗膜條件下(65℃，0.2×SSC)獲得4個陽性科斯質(zhì)粒(cosmid)。
4、陽性科斯質(zhì)粒的測序與分析選取其中一個陽性科斯質(zhì)粒16B1進行核苷酸序列測定。將DNA片段用550Sonic Dismembrator超聲波(Fisher Scientific公司)斷裂并0.7％用低熔點瓊脂糖回收其中1.6-2.0kb片段，再經(jīng)過Geneclean II reagent kit(Bio 101，Inc公司)純化后克隆至pUC18的SmaI位點(預(yù)先經(jīng)CIAP處理)，構(gòu)建成一系列測序亞克隆。測序亞克隆質(zhì)粒DNA的制備采用Prep 96 Plasmid Kit(Qiagen公司)。序列的測定采用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kits(AppliedBiosystem Division，Perkin Elmer公司)在377 DNA Sequencers(PE/ABD)上自動完成，測序通用引物為5’GTA AAA CGA CGG CCA GT3’(forward)，5’GCGGAT AAC AAT TTC ACA CAG G 3’(reverse)。序列的ORF分析是通過日本國立衛(wèi)生研究院的在線服務(wù)器http//watson.nih.go.jp/~jun/cgi-bin/frameplot.pl提供的Frame-Plot2.3.2在線軟件進行。序列的同源性比較是通過美國國家生物技術(shù)信息中心的在線服務(wù)器提供的PSI-BLAST軟件(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行。
序列1為催化梅嶺霉素糖苷配基C5-酮基還原的基因meiF的核苷酸序列，長度為936個堿基對(bp)。
序列2為催化梅嶺霉素糖苷配基C5-酮基還原的基因meiF的氨基酸序列，長度為311個氨基酸。
以下根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容提供基因序列序列列表<110>上海交通大學(xué)<120>梅嶺霉素C5-酮基還原酶基因(meiF)<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>936<212>DNA<213>南昌鏈霉菌NS3226(Streptomyces nanchangensis n.sp.NS3226)<400>1atggattacg agggcccggc agggtacccc gcgtggctcg gcttccggtg gagtccttct 60ccttggaatt ccggggtctt gagggggttc cgtgctgtgt gctcggttgc gatggtcgtc120gccatgaccc aaacagctgg aaaaaccgca ctggtgaccg gtgcgtcgcg gggcatcggc180gcggccatcg cccgaaggct cgccgccgaa ggtgttctgg tggccgtgca ctacgggcgg240tgcaaagcgg acgcggagga aacggtcgcg tcgatcgagc aggccggcgg gcaggcattc300gccatcaggg cggaccttgc ggccgacgac gccctcgaca cgctcttcag cgagctcgcg360accgggctcg ccggccggcc gctgaacatc ctggtgaaca acgccgccat ctacgccgac420ccggacgacc cggccgccgc gcaggcggac ggctatgtgg cgggcatttc cgaggtcact480caggaggagt tcgaccgtat cttcagcgtc aatgtacgtg ccccgttttt cgtcacccaa540cggtgtctgc cgctcctcgc cgacggcgga cggatcgtca acatctcttc cgccgtcacc600aggatcgcct ggccgctgct gccctacgcc atgagcaagg gcgccctcga gatcatggcg660cccaggctgg ccaatgagct gggacaccgg ggaatcaccg tcaacaccat cgcgccgggc720atcaccgaca acaccaaaac caacacgtgg ctgcacgata tgcccggggc ggccgagggc780gtggccgcca tgaccgcact gcgccgactc ggtcagccgt ccgacatcgc cgatgtcgtc840gccctcctcg cctcggacga ggcccgctgg gtcaccggac aactggtcga cgcctccggc900ggcatggccc tggcccccac accaccgggc atgtag 936<210>2<211>311<212>PRT<213>南昌鏈霉菌NS3226(Streptomyces nanchangensis n.sp.NS3226)<400>1Met Asp Tyr Glu Gly Pro Ala Gly Tyr Pro Ala Trp Leu Gly Phe Arg1 5 10 15Trp Ser Pro Ser Pro Trp Asn Ser Gly Val Leu Arg Gly Phe Arg Ala20 25 30Val Cys Ser Val Ala Met Val Val Ala Met Thr Gln Thr Ala Gly Lys35 40 45Thr Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Ala Ala Ile Ala5055 60Arg Arg Leu Ala Ala Glu Gly Val Leu Val Ala Val His Tyr Gly Arg65 70 75 80Cys Lys Ala Asp Ala Glu Glu Thr Val Ala Ser Ile Glu Gln Ala Gly85 90 95Gly Gln Ala Phe Ala Ile Arg Ala Asp Leu Ala Ala Asp Asp Ala Leu100105110Asp Thr Leu Phe Ser Glu Leu Ala Thr Gly Leu Ala Gly Arg Pro Leu115120 125Asn Ile Leu Val Asn Asn Ala Ala Ile Tyr Ala Asp Pro Asp Asp Pro130135 140Ala Ala Ala Gln Ala Asp Gly Tyr Val Ala Gly Ile Ser Glu Val Thr145 150 155 160Gln Glu Glu Phe Asp Arg Ile Phe Ser Val Asn Val Arg Ala Pro Phe165 170175Phe Val Thr Gln Arg Cys Leu Pro Leu Leu Ala Asp Gly Gly Arg Ile180185190Val Asn Ile Ser Ser Ala Val Thr Arg Ile Ala Trp Pro Leu Leu Pro195200205Tyr Ala Met Ser Lys Gly Ala Leu Glu Ile Met Ala Pro Arg Leu Ala210215220Asn Glu Leu Gly His Arg Gly Ile Thr Val Asn Thr Ile Ala Pro Gly225230235 240Ile Thr Asp Asn Thr Lys Thr Asn Thr Trp Leu His Asp Met Pro Gly245 250255Ala Ala Glu Gly Val Ala Ala Met Thr Ala Leu Arg Arg Leu Gly Gln260 265270Pro Ser Asp Ile Ala Asp Val Val Ala Leu Leu Ala Ser Asp Glu Ala275280285Arg Trp Val Thr Gly Gln Leu Val Asp Ala Ser Gly Gly Met Ala Leu290295 300Ala Pro Thr Pro Pro Gly Met305 310
權(quán)利要求
1.一種梅嶺霉素C5-酮基還原酶基因，其特征在于它編碼C5-酮基還原酶，催化梅嶺霉素糖苷配基C5-酮基還原為羥基，基因的核苷酸序列長度為936個堿基對(bp)，編碼311個氨基酸，序列分別如下atggattacg agggcccggc agggtacccc gcgtggctcg gcttccggtg gagtccttct 60ccttggaatt ccggggtctt gagggggttc cgtgctgtgt gctcggttgc gatggtcgtc120gccatgaccc aaacagctgg aaaaaccgca ctggtgaccg gtgcgtcgcg gggcatcggc180gcggccatcg cccgaaggct cgccgccgaa ggtgttctgg tggccgtgca ctacgggcgg240tgcaaagcgg acgcggagga aacggtcgcg tcgatcgagc aggccggcgg gcaggcattc300gccatcaggg cggaccttgc ggccgacgac gccctcgaca cgctcttcag cgagctcgcg360accgggctcg ccggccggcc gctgaacatc ctggtgaaca acgccgccat ctacgccgac420ccggacgacc cggccgccgc gcaggcggac ggctatgtgg cgggcatttc cgaggtcact480caggaggagt tcgaccgtat cttcagcgtc aatgtacgtg ccccgttttt cgtcacccaa540cggtgtctgc cgctcctcgc cgacggcgga cggatcgtca acatctcttc cgccgtcacc600aggatcgcct ggccgctgct gccctacgcc atgagcaagg gcgccctcga gatcatggcg660cccaggctgg ccaatgagct gggacaccgg ggaatcaccg tcaacaccat cgcgccgggc720atcaccgaca acaccaaaac caacacgtgg ctgcacgata tgcccggggc ggccgagggc780gtggccgcca tgaccgcact gcgccgactc ggtcagccgt ccgacatcgc cgatgtcgtc840gccctcctcg cctcggacga ggcccgctgg gtcaccggac aactggtcga cgcctccggc900ggcatggccc tggcccccac accaccgggc atgtag 936MDYEGPAGYP AWLGFRWSPS PWNSGVLRGF RAVCSVAMVV AMTQTAGKTA LVTGASRGIG 60AAIARRLAAE GVLVAVHYGR CKADAEETVA SIEQAGGQAF AIRADLAADD ALDTLFSELA120TGLAGRPLNI LVNNAAIYAD PDDPAAAQAD GYVAGISEVT QEEFDRIFSV NVRAPFFVTQ180RCLPLLADGG RIVNISSAVT RIAWPLLPYA MSKGALEIMA PRLANELGHR GITVNTIAPG240ITDNTKTNTW LHDMPGAAEG VAAMTALRRL GQPSDIADVV ALLASDEARW VTGQLVDASG300GMALAPTPPG M 31全文摘要
一種梅嶺霉素C5－酮基還原酶基因，屬于基因技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明編碼C5－酮基還原酶，催化梅嶺霉素糖苷配基C5－酮基還原為羥基，基因的核苷酸序列長度為936個堿基對(bp)，編碼311個氨基酸。根據(jù)已知的阿弗菌素生物合成基因簇序列，通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增出阿弗菌素生物合成基因簇中負責(zé)催化阿弗菌素糖苷配基C5－酮基進行還原的C5－酮基還原酶基因片段，并以之為探針進行Southern雜交，從南昌鏈霉菌基因文庫中獲得包含有其同源序列的陽性科斯質(zhì)粒，經(jīng)過測序與功能分析，獲得梅嶺霉素C5－酮基還原酶基因。本發(fā)明開辟以利用組合生物合成及遺傳工程技術(shù)創(chuàng)新微生物藥物的新途徑，為已知生物活性分子的高產(chǎn)和新微生物農(nóng)藥的創(chuàng)新提供新的技術(shù)和手段。
文檔編號C12N15/53GK1472322SQ03116989
公開日2004年2月4日 申請日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者鄧子新, 孫宇暉, 周秀芬 申請人:上海交通大學(xué)