專利名稱：基因多態(tài)性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種快速檢測基因組中基因多態(tài)性(如單堿基多態(tài)性、單堿基插入或缺失)的方法，具體說是一種通過設(shè)計不同的引物，在單管中進行PCR擴增反應(yīng)，并使擴增反應(yīng)產(chǎn)生與基因多態(tài)性相對應(yīng)的DNA擴增產(chǎn)物，然后用電泳或色譜的方法進行分離，根據(jù)擴增產(chǎn)物中DNA片段的多少及鏈長判斷基因多態(tài)性的類型。
本發(fā)明的目的就是為了解決現(xiàn)有單管四引物基因多態(tài)性分析法存在的缺點，提出一種成本低、易于操作、特異性高、不需復(fù)雜優(yōu)化步驟就能快速完成基因多態(tài)性測定的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案一種用于快速檢測基因多態(tài)性的方法，具有如下特征(a)根據(jù)所測樣本靶序列設(shè)計兩對引物，其中一對為錨定引物；(b)將上述兩對引物及一個與錨定引物的錨定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR擴增反應(yīng)試劑的溶液中，進行PCR擴增反應(yīng)；(c)以適當?shù)姆椒z測擴增產(chǎn)物中鏈長不同的DNA片斷；(d)根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物中DNA片斷的多少及其長短判斷基因多態(tài)性的類型。
本發(fā)明與以往技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(1)特異性高。因為對基因多態(tài)性引物進行了人工修飾。
(2)可同時測定多個基因多態(tài)性位點。
(3)低成本。因為可利用一個標記的通用引物完成各種基因多態(tài)性的測定。
(4)可用于等位基因頻率的測定。因為本技術(shù)的特異性很好。
(5)檢測手段靈活，既可用常規(guī)的凝膠電泳法又可用高通量的微流控芯片法，也可采用液相色譜法。


圖1是本發(fā)明的測定方法原理圖。
圖2是本發(fā)明的實際樣品測定結(jié)果示意圖。
圖3是HPLC法測定等位基因頻率的原理圖。
圖4是芯片電泳法測定SNP原理圖。
本發(fā)明的方法原理如圖1所示。在圖1中，以基因多態(tài)性中最常見的SNP為例闡述本方法的原理。假設(shè)基因組1中存在SNP位點2，其類型為3，即A/G型。加入引物4和5擴增含有SNP位點2的DNA片段，為了分析SNP位點3的類型，分別加入SNP特異性錨定引物6和7，引物6和7的5’端含有由若干個堿基組成的錨定部分，其3’端區(qū)域含有一個為提高延伸反應(yīng)特異性的人工突變堿基。引物6的3’端為“T”，與底物鏈上的堿基“A”互補；引物7的3’端為“G”，與另一條底物鏈上的堿基“C”互補。
當SNP的類型為“A”時，引物6發(fā)生延伸反應(yīng)，產(chǎn)生延伸產(chǎn)物DNA片段8，由于在反應(yīng)混合物中含有引物9，其序列與引物6和7的錨定部分序列完全相同，所以引物9和引物5進行PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)生DNA片段10。而此時引物7的3’端為“G”，與底物上“T”不互補，故不產(chǎn)生延伸反應(yīng)。在最終的反應(yīng)產(chǎn)物中有由引物9和5產(chǎn)生的特異性擴增片段10和由引物4和5產(chǎn)生的PCR擴增片段11。經(jīng)過電泳分析后出現(xiàn)兩條帶12和13，分別代表DNA片段11和10。
當SNP的類型為“G”時，錨定引物7發(fā)生特異性延伸反應(yīng)，產(chǎn)生延伸產(chǎn)物DNA片段14，經(jīng)引物9和4的擴增反應(yīng)，產(chǎn)生DNA片段15；同樣在最終的反應(yīng)產(chǎn)物中有由引物4和5產(chǎn)生的PCR擴增片段11。所以經(jīng)過電泳分析后，產(chǎn)生兩條帶12和16，12為由引物4和5產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物11，16為由引物4和9產(chǎn)生的特異性擴增片段15。
當SNP為雜合子“A/G”時，PCR擴增結(jié)果產(chǎn)生三條帶，在圖1中如17中的電泳條帶12，16和13所示，它們分別代表DNA片段10，15和11。
所以通過一次PCR擴增反應(yīng)，就可以同時確定SNP的三種可能類型?？刹捎枚喾N分離方法分析擴增產(chǎn)物，如凝膠電泳、高效液相色譜和微流控電泳芯片等，檢測時可用熒光染料標記圖1中引物9的5’端，也可用溴化乙淀或其它熒光嵌入試劑直接加入到PCR擴增產(chǎn)物中顯色，當采用高效液相色譜檢測時，也可根據(jù)DNA分子在260nm處的紫外吸收峰檢測，具體細節(jié)見實施例。
本發(fā)明的關(guān)鍵點(1)為提高基因多態(tài)性特異性引物延伸反應(yīng)的特異性、減少測定結(jié)果的假陽性，在SNP特異性引物的3’端區(qū)域人工引入了一個突變堿基。為使實驗簡單化，通常將特異性引物3’端倒數(shù)第三個堿基人工改變?yōu)榕c底物相一致的堿基。
(2)為提高特異性擴增產(chǎn)物的濃度和特異性，在SNP特異性引物的5’端附加一段由多個堿基組成的錨定部分，并用與錨定部分序列相同的引物共同進行基因多態(tài)性特異性片段的PCR擴增。
(3)合理設(shè)計PCR引物，使擴增反應(yīng)產(chǎn)生長度不同、容易分離的基因多態(tài)性特異性片段。
實施例1凝膠電泳法測定三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子1基因(ABC1)中SNP位點I823MABC1基因突變者，人體細胞內(nèi)低密度脂蛋白(LDL)濃度偏高，而高密度脂蛋白(HDL)相對偏低，人體則易發(fā)生多種心血管疾病，如動脈粥樣硬化，高血壓等。本實施例以其SNP位點I823M為例，研究本專利方法的適用性。首先設(shè)計一對引物可擴增含有I823M位點的DNA片段，引物對的序列為P15’- agg atgtgt caa gga gga aat-3’和P25’-gaa gcc aag aca aca aag aaa-3’。由該對引物擴增的DNA片段鏈長為446個堿基，I823M位點距離DNA鏈兩端的距離分別為200和247個堿基。
I823M位點的SNP種類為“A”和“G”，為了檢測“A”和“G”，分別設(shè)計一對SNP特異性引物，其3′末端堿基終止于SNP位點，兩引物分別與底物的兩條鏈互補，分別用于測定“A”和“G”。為了提高引物延伸反應(yīng)的特異性，減少假陽性結(jié)果，在特異性引物3′端倒數(shù)第3個堿基處人工引入一個與底物不匹配的堿基。將這兩個SNP特異性引物分別記為SP1和SP2，其序列為，SP15′-GCG GTCCCA AAA GGG TCA GT aac agc act tac ttt ctcac-3’；SP25′- GCG GTC CCA AAAGGG TCA GT gtt cca acc aga aga aga gatta-3’，其中以下劃線標記的單個堿基為人工引入的不匹配堿基，5’端大寫字母表示的堿基為特異性引物的錨定部分，在PCR擴增反應(yīng)時，另加入與該錨定部分序列完全一致的引物AP，用于提高擴增反應(yīng)的特異性和特異性擴增反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)率。
引物設(shè)計完成后，按照PCR反應(yīng)的要求，在單管中進行PCR反應(yīng)，即在含有引物的試管中加入人基因組DNA，DNA聚合酶、Mg++、反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷酸等組分，在PCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)，即先94℃變性2～10min，然后按下列條件進行25～45個循環(huán)反應(yīng)94℃，30～60s；48～60℃，30～60s；72℃40～120s，反應(yīng)完成后，繼續(xù)在72℃ 3～15min，最后于4℃保存。取適量(如5μl)在凝膠上電泳，然后用熒光染料(如溴化乙碇)染色DNA，在紫外光照射下檢測電泳條帶。根據(jù)DNA條帶的分子量大小即可迅速判斷SNP類型，如出現(xiàn)鏈長為446bp和220bp(200bp加上20個錨定堿基)兩條帶，則SNP類型為“G”；如出現(xiàn)鏈長為446bp和266bp(246bp加上20個錨定堿基)兩條帶，則SNP類型為“A”，如出現(xiàn)446bp、220bp和246bp三條帶，則SNP類型為“A/G”雜合子。圖2為用本方法測定三種不同樣品的結(jié)果，條帶18為引物P1和P2的FCR產(chǎn)物，19為對應(yīng)于“A”型擴增片段，20對應(yīng)于“G”型擴增片段。樣品A和C分別為“G”型、“A”型，樣品B為“A/G”雜合子型，與測序結(jié)果一致。在圖2中，三個樣品均出現(xiàn)條帶18，該片段的鏈長為446bp，可用作分子量內(nèi)控指際。
進一步的研究表明，當特異性引物中不含有人工引入的不匹配堿基時，圖2中三個樣品均出現(xiàn)三條帶，說明特異性不好。因此在特異性引物的3′端區(qū)域人工地引入一個不匹配堿基可大大提高反應(yīng)的特異性。
實施例2高效液相色譜法測定等位基因頻率本例采用高效液相色譜法測定等位基因的頻率。隨著人類對SNP與疾病關(guān)系認識的深入，迫切需要了解遺傳信息的差異對疾病易感性與藥物療效和毒副作用的影響，通常的研究方法是分別測定具有一定個體數(shù)量的正常組與異常組之間單堿基多態(tài)性(SNP)的差異。如逐個樣品分析，則工作量太大，采用測定兩組樣品之間等位基因頻率則可以大大減少勞動力，也可節(jié)省時間和財力。本例先將兩組中多個樣品21分別等量混合均勻成樣品22，然后進行四引物PCR擴增反應(yīng)，取反應(yīng)液23適量注入液相色譜儀分離，得峰24，25和26，分別對應(yīng)于“G”型和PCR片段(其長度為24和25之和)，根據(jù)峰24和25的峰面積A24和25，分別按公式27和28計算“A”和“G”的出現(xiàn)頻率，其測定方法原理如圖3所示。
實施例3芯片電泳法快速測定SNP采用芯片電泳法可實現(xiàn)快速和微量分析，通常在較短的時間內(nèi)可對小于10μl的樣品進行測定，如采用集成化的芯片裝置可實現(xiàn)多個樣品的并行測定。測定原理如圖4所示。仍以實施例1中的樣品為例來說明，首先取基因組樣品29，用本專利中的方法測定，即加入兩個5′端帶一錨定部分的SNP特異性引物及一個經(jīng)生物素染料Cy-5標記的、且序列與SNP特異性引物中錨定部分完全一致的引物，進行擴增反應(yīng)，產(chǎn)生擴增反應(yīng)產(chǎn)物30，點樣于芯片中的孔31，在孔31和34間加上電壓，完成進樣，然后于孔32和33之間施加電壓進行分離，在分離通道35中填滿液體凝膠溶液，以半導(dǎo)體激光為激發(fā)光源，并收集DNA片段所發(fā)射出的熒光，得到電泳圖譜，如出現(xiàn)峰36(對應(yīng)于本例樣品SNP的“G”型)，則SNP的類型為“G”；如出現(xiàn)峰37(對應(yīng)于本例樣品SNP的“A”型)，則SNP的類型為“A”；如同時出現(xiàn)峰36和37，則為“A/G”型雜合子。
本例說明了用本專利的方法實現(xiàn)快速測定SNP的方法，從血液中基因組提取開始，進行PCR擴增反應(yīng)，然后用芯片電泳檢測，可望在三個小時之內(nèi)完成。由于僅對錨定引物進行標記，所以可將其作為通用引物用于各種類型的SNP測定，也可以實現(xiàn)單管中多重SNP的同時測定。
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權(quán)利要求
1.一種用于快速檢測基因多態(tài)性的方法，具有如下特征(a)根據(jù)所測樣本靶序列設(shè)計兩對引物，其中一對為錨定引物；(b)將上述兩對引物及一個與錨定引物的錨定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR擴增反應(yīng)試劑的溶液中，進行PCR擴增反應(yīng)；(c)以適當?shù)姆椒z測擴增產(chǎn)物中鏈長不同的DNA片斷；(d)根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物中DNA片斷的多少及其長短判斷基因多態(tài)性的類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述“兩對引物”中的一對是指合適的PCR引物，用于擴增含有基因多態(tài)性位點的DNA片段；另一對是指基因多態(tài)性特異性引物，用于判斷基因多態(tài)性的類型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述“合適的PCR引物”是指合理設(shè)計引物并使基因多態(tài)性位點不位于PCR擴增產(chǎn)物鏈的正中間，即該位點距離PCR擴增產(chǎn)物兩端必須相差若干個堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述“基因多態(tài)性特異性引物”是指與DNA雙鏈模板中的兩條互補鏈分別結(jié)合的一對引物，其3’端正好位于基因多態(tài)性位點上，并用3’端堿基的種類來控制引物的延伸，兩個引物的3’端分別與基因多態(tài)性的兩種可能堿基互補；并且在引物的3’端區(qū)域，如倒數(shù)第三個堿基處，人為地引入一個與模板不互補的堿基，用以提高延伸反應(yīng)的特異性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述“錨定引物”是指引物由兩部分組成，一部分堿基的序列與底物序列互補；另一部分為附加堿基，即在引物的5’端附加若干個與底物序列不互補的堿基作為錨定部分，兩引物錨定部分的序列可以相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述“與其錨定部分序列相同的引物”是指引物的序列與權(quán)利要求項[5]中所指“錨定引物”的5’端附加堿基的序列相同。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述“鏈長不同的DNA片斷”是指一對PCR引物與一對基因多態(tài)性特異性引物分別擴增的反應(yīng)產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述“以適當?shù)姆椒z測”是指以凝膠電泳法、毛細管電泳法、微流控芯片法或高效液相色譜法等分離技術(shù)中的任何一種方法檢測鏈長不同的DNA片斷。為提高靈敏度，可用熒光染料標記權(quán)利要求項[6]中所指引物的5’端，也可采用DNA嵌入熒光染料標記擴增產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因多態(tài)性檢測方法，可用于單堿基多態(tài)性、基因突變、單堿基插入或缺失、微衛(wèi)星分析等。本方法是首先設(shè)計兩對引物，其中一對為通常PCR引物，用于擴增含有基因多態(tài)性位點的DNA片段；另一對為錨定引物，用于判斷基因多態(tài)性的類型。再將上述兩對引物及一個與錨定引物的錨定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR擴增反應(yīng)試劑的溶液中，在單管中進行PCR擴增反應(yīng)，并使擴增反應(yīng)產(chǎn)生與基因多態(tài)性相對應(yīng)的DNA擴增產(chǎn)物，然后以凝膠電泳法、或毛細管電泳法、或微流控芯片法，或高效液相色譜法等分離技術(shù)檢測，根據(jù)擴增產(chǎn)物中DNA片段的多少及鏈長判斷基因多態(tài)性的類型。為提高延伸反應(yīng)的特異性，在錨定引物的3’端區(qū)域人為地引入一個與模板不互補的堿基。
文檔編號C12Q1/68GK1446928SQ0311283
公開日2003年10月8日 申請日期2003年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月31日
發(fā)明者周國華, 卜瑩, 張曉丹, 伍小勇, 古卓良 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)聯(lián)勤部軍事醫(yī)學研究所