專利名稱：與小麥赤霉病抗性主效qtl緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是選擇利用小麥抗赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，以提高小麥抗赤霉病育種的效率。
近幾年發(fā)展起來的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，有效地解決了這一問題，通過構(gòu)建重要抗源的遺傳圖譜和數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative Trait Loci，QTL)分析，可以找到與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖(或共分離)的分子標(biāo)記。使用與某一特定抗源抗赤性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以對(duì)該特定抗源的后代及其衍生品種(系)在苗期進(jìn)行早世代篩選，淘汰不抗病的植株，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高育種和選擇效率。
通過這一方法，與重要抗源蘇麥3號(hào)及其衍生品種(系)的赤霉病抗性主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記，已有多篇文章報(bào)導(dǎo)，正在用于生產(chǎn)實(shí)際。而江蘇溧陽(yáng)望水白(小麥赤霉病研究，陸維忠等主編，科學(xué)出版社，北京，2001)為我國(guó)特有的地方品種，具有較高和穩(wěn)定的赤霉病抗性，也是到現(xiàn)在為止發(fā)現(xiàn)的對(duì)小麥赤霉病抗性最強(qiáng)的小麥品種，目前尚未有與其主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記報(bào)道。
本發(fā)明提供的與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的a)小麥赤霉病抗病品種望水白(♀)和小麥赤霉病感病品種(♂)雜交，得到雜種F1；b)由雜種F1自花授粉獲得子代，通過子代單粒傳(SSD)方法獲得F7代的重組自交系；c)分離每個(gè)重組自交系家系小麥葉片的DNA，采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)引物或擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6％(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得分子標(biāo)記資料；d)基于遺傳連鎖交換定律，對(duì)分子標(biāo)記分析資料構(gòu)建小麥遺傳連鎖圖；e)接種赤霉病病原菌，測(cè)定重組自交系每個(gè)家系的赤霉病抗性，病小穗率10％以下為“抗”，病小穗率10.1-25％為“中抗”，病小穗率25.1％以上為“感”。
f)將重組自交系每個(gè)家系的赤霉病抗性與小麥遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和QTL分析，以2.5為L(zhǎng)OD閾值，大于2.5說明存在一個(gè)QTL位點(diǎn)，確定與抗源望水白赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，最終獲得3個(gè)與抗源望水白赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記Xgwm161、BARC147和Xgwm493，它們的大小分別為171bp、107bp和210bp。
與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記應(yīng)用包括將分子標(biāo)記Xgwm161、BARC147和Xgwm493用于小麥品種或品系的基因型檢測(cè)，以判斷該品種或品系是否具有赤霉病抗性a)以望水白及其衍生品種或品系為父本或母本與其他小麥雜交并繁衍至F2代以上；b)對(duì)通過步驟a)獲得的小麥單個(gè)植株，分離葉片DNA，檢測(cè)分離的DNA中是否存在與赤霉病主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記；如有2-3個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，預(yù)測(cè)該小麥的赤霉病的抗性達(dá)到“抗”的水平。
所用望水白衍生品種或品系，是指以望水白為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、或采用花藥培養(yǎng)、或采用玉米與小麥雜交誘導(dǎo)單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種或品系。
本發(fā)明能克服常規(guī)育種中小麥赤霉病抗性鑒定易受環(huán)境影響，并且只能在開花期鑒定篩選的缺點(diǎn)，在苗期就可通過檢測(cè)分子標(biāo)記對(duì)小麥植株的赤霉病抗性進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選，淘汰感病植株，減少人力物力的浪費(fèi)，提高育種效率。
赤霉病抗性接種鑒定分別在溫室或田間進(jìn)行，選取麥穗中部剛開花的小穗，接種禾谷鐮刀菌菌株F34的分生孢子懸浮液10微升(50000個(gè)孢子/毫升)，彌霧保濕3天，21天后調(diào)查病小穗率。
病小穗率＝(發(fā)病小穗數(shù)/總小穗數(shù))×100％。(2)分子標(biāo)記分析，遺傳圖譜構(gòu)建及QTL分析
選取在兩親本間具有擴(kuò)增多態(tài)性的SSR引物和AFLP引物組合對(duì)104個(gè)家系根據(jù)已有方法(Marion S.Rder Genetics1492007-2023，1998；Guihua Bai，Phytopathology 89343-348，1999)進(jìn)行分析，分離每個(gè)重組自交系家系小麥葉片的DNA，采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)引物或擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6％(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)，將獲得的多態(tài)性數(shù)據(jù)采用JoinMap3.0軟件，LOD值在3.0-7.0進(jìn)行連鎖群分組，Kosambi方法將重組值換算成遺傳圖距，構(gòu)建望水白的遺傳連鎖圖譜，綜合遺傳連鎖圖數(shù)據(jù)和抗性鑒定資料，QTL分析采用MapQTL4.0進(jìn)行，先進(jìn)行Kruskal-Wallis(K-W)測(cè)驗(yàn)，P＜0.005表明該標(biāo)記與赤霉病抗性緊密連鎖，可能存在QTL。然后對(duì)可能存在QTL的區(qū)間進(jìn)行區(qū)間作圖(Interval Mapping)和多QTL作圖(MQM Mapping)分析，以2.5為L(zhǎng)OD閾值，大于2.5說明存在一個(gè)QTL位點(diǎn)。
Kruskal-Wallis測(cè)驗(yàn)表明位于3B染色體短臂的Xgwm161、BARC147和Xgwm493和BARC102a與抗赤性緊密連鎖(見附表1)；區(qū)間作圖分析(IntervalMapping)發(fā)現(xiàn)在BARC147和BAR102a之間確有一抗赤QTL位點(diǎn)，其LOD值為2.93，可解釋14.5％的抗赤性變異，多QTL作圖(MQM Mapping)發(fā)現(xiàn)此QTL位點(diǎn)在BARC147與Xgwm493的14.2cM的區(qū)間內(nèi)(見附表2，附

圖1)，表明Xgwm161、BARC147和Xgwm493標(biāo)記與望水白的主效赤霉病抗性QTL相連鎖，可用于以望水白為赤霉病抗源的品種或品系的赤霉病抗性預(yù)測(cè)。附表1Kruskal-Wallis測(cè)驗(yàn)結(jié)果

K值Kruskal-Wallis測(cè)驗(yàn)分析值，值越大表明與赤霉病抗性越相關(guān)。P值表示與赤霉病抗性相關(guān)的顯著程度，P＜0.005表明該標(biāo)記與赤霉病抗性緊密連鎖。附表2望水白/Alondra抗赤QTL分析

LOD＝對(duì)數(shù)幾率值(反映QTL的幾率)VE＝％由QTL所造成的表型變化與抗源望水白赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記Xgwm161、BARC147和Xgwm493是用小麥葉片分離的DNA采用引物5’GATCGAGTGATGGCAGATGG3’和5’TGTGAATTACTTGGACGTGG3’；5’GCGCCATTTATTCATGTTCCTCAT3’和5’CCGCTTCACATGCAATCCGTTGAT3’；5’TTCCCATAACTAAAACCGCG3’和5’GGAACATCATTTCTGGACTTTG3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6％(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后獲得，它們的大小分別為171bp、107bp和210bp。區(qū)施例2與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記在高代遺傳群體中驗(yàn)證獲得的與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，也在望水白與Alondra雜交的F9后代的部分植株進(jìn)行了赤霉病抗性預(yù)測(cè)，先從它們的葉片中分離DNA，然后用SSR標(biāo)記Xgwm493、BARC147和Xgwm161的引物對(duì)這些DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，并通過評(píng)判圖譜來確定是否存在相應(yīng)的標(biāo)記，存在2-3個(gè)標(biāo)記，說明該品種或品系赤霉病抗性達(dá)到“抗”的水平，不存在則是感病的。然后基于這些判定準(zhǔn)則對(duì)每個(gè)小麥植株的赤霉病抗性進(jìn)行預(yù)測(cè)。隨后利用接種赤霉病病原菌的方法測(cè)定受測(cè)樣品的赤霉病實(shí)際抗性并與預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果見附表3，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果非常吻合。附表3用與望水白主效QTL緊密連鎖分子標(biāo)記預(yù)測(cè)望水白/Alondra的雜交后代(F9)的赤霉病抗性

+表示有SSR標(biāo)記(Xgwm493、Xgwm161和BARC147)的條帶；-表示沒有SSR標(biāo)記(Xgwm493、Xgwm161和BARC147)的條帶。實(shí)施例3與望水白抗赤性主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記對(duì)育種高代材料抗性預(yù)測(cè)利用篩選到的與望水白赤霉病抗性主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記對(duì)育種高代材料進(jìn)行初步試驗(yàn)，以顯示該方法在快速評(píng)判小麥赤霉病抗性中的實(shí)用價(jià)值。選取8個(gè)以望水白及其衍生品種(系)為親本的高代育種材料或小麥品種，先從它們的葉片中分離DNA，然后用SSR標(biāo)記Xgwm493、BARC147和Xgwm161的引物進(jìn)行分析，并通過評(píng)判圖譜來確定是否存在相應(yīng)的標(biāo)記，存在2-3個(gè)標(biāo)記，說明該品種或品系赤霉病抗性達(dá)到“抗”的水平，不存在則是感病的。隨后利用接種赤霉病病原菌的方法測(cè)定受測(cè)樣品的赤霉病實(shí)際抗性并與預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。
附表4給出的是高代品系或品種的DNA測(cè)試的預(yù)測(cè)結(jié)果以及經(jīng)接種病原菌后的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，可以看出，采用與主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記預(yù)測(cè)以望水白及其衍生品種(系)為抗源的小麥的赤霉病抗性是非常準(zhǔn)確的。附表4用與望水白主效QTL緊密連鎖分子標(biāo)記預(yù)測(cè)以望水白及其衍生品種(系)為抗源的小麥品系的赤霉病抗性

+表示有SSR標(biāo)記(Xgwm493、Xgwm161和BARC147)的條帶；-表示沒有SSR標(biāo)記(Xgwm493、Xgwm161和BARC147)的條帶。
權(quán)利要求
1.一種與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的a)小麥赤霉病抗病品種望水白(♀)和小麥赤霉病感病品種(♂)雜交，得到雜種F1；b)由雜種F1自花授粉獲得子代，通過子代單粒傳(SSD)方法獲得F7代的重組自交系；c)分離每個(gè)重組自交系家系小麥葉片的DNA，采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)引物或擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6g/100ml聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得分子標(biāo)記資料；d)基于遺傳連鎖交換定律，對(duì)分子標(biāo)記分析資料構(gòu)建小麥遺傳連鎖圖；e)接種赤霉病病原菌，測(cè)定重組自交系每個(gè)家系的赤霉病抗性，病小穗率10％以下為“抗”，病小穗率10.1-25％為“中抗”，病小穗率25.1％以上為“感”；f)將重組自交系每個(gè)家系的赤霉病抗性與小麥遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和QTL分析，以2.5為L(zhǎng)OD閾值，大于2.5說明存在一個(gè)QTL位點(diǎn)，確定與抗源望水白赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記Xgwm161、BARC147和Xgwm493。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，用小麥葉片分離的DNA，采用引物5’GATCGAGTGATGGCAGATGG3’和5’TGTGAATTACTTGGACGTGG3’；5’GCGCCATTTATTCATGTTCCTCAT3’和5’CCGCTTCACATGCAATCCGTTGAT3’；5’TTCCCATAACTAAAACCGCG3’和5’GGAACATCATTTCTGGACTTTG3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6％(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，分別獲得分子標(biāo)記Xgwm161、BARC147和Xgwm493它們的大小分別為171bp、107bp和210bp。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于a)以望水白及其衍生品種或品系為父本或母本與其他小麥雜交并繁衍至F2代以上；b)對(duì)通過步驟a)獲得的小麥單個(gè)植株，分離葉片DNA，檢測(cè)分離的DNA中是否存在與赤霉病主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記；如有2-3個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，預(yù)測(cè)該小麥的赤霉病的抗性達(dá)到“抗”的水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于將分子標(biāo)記Xgwm161、BARC147和Xgwm493用于小麥品種或品系的基因型檢測(cè)，以判斷該品種或品系是否具有赤霉病抗性。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所用望水白衍生品種或品系，是指以望水白為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、或采用花藥培養(yǎng)、或采用玉米與小麥雜交誘導(dǎo)單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種或品系。
全文摘要
本發(fā)明與小麥赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于小麥育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。對(duì)抗病品種望水白(♀)和感病品種(♂)雜交獲得的重組自交系的每個(gè)家系的基因型和每個(gè)家系的赤霉病抗性表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL和遺傳連鎖分析，獲得與望水白赤霉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記Xgwm161、BARC147和Xgwm493。通過檢測(cè)望水白及其衍生品種(系)的DNA中是否有分子標(biāo)記，可預(yù)測(cè)其赤霉病抗性水平，從而可加快抗赤霉病小麥的選擇進(jìn)度。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1442039SQ03112778
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2003年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月28日
發(fā)明者周淼平, 陸維忠, 張旭, 任麗娟, 馬鴻翔 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院