專利名稱：腫瘤消解病毒療法的制作方法
背景技術(shù)：
“用病毒治療腫瘤”(WO 00/62735)涉及一種將能夠復(fù)制和殺死具有IFN介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)缺陷的腫瘤細(xì)胞的病毒作為藥物使用的方法，該專利的一個特定的方面包括“全身性”使用這種病毒。
已知副粘病毒與紅細(xì)胞反應(yīng)并使其凝集，Howe，C.和Lee，L.T.報道說從紅細(xì)胞提取了比流感病毒的效率具有更低的副粘病毒(Adv.VirusRes.171-50，1972)。此外，通過病毒外殼蛋白的特異性抗體的中和而特異性地抑制由副粘病毒引起的紅細(xì)胞凝集是一個已了解得很清楚的現(xiàn)象。
Schirrmacher等人(Int.J of Oncology，16363-373，2000)已經(jīng)證明，NDV會激活小鼠巨噬細(xì)胞的抗腫瘤活性，下面的試驗結(jié)果表明NDV被加到小鼠全血中時并不優(yōu)先與小鼠白細(xì)胞組合。
Bonina等人(Giorn.Batt.Virol.Immun.，LXXVIII，254-261，1985)證明，人的巨噬細(xì)胞能支持NDV的生長。
Woodruff等人(Cellular Immunology 5296-306，1972)及Woodruff和Woodruff(J of Immunology，116(6)2176-2183，1974)發(fā)現(xiàn)，NDV在體外凝集大鼠、小鼠和人的淋巴細(xì)胞。
Faden等人(Blood，58221-7，1981)證明，NDV在體外會與人的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。
上述資料并沒有顯示任何NDV優(yōu)先于紅細(xì)胞而與白細(xì)胞結(jié)合的傾向性。
文獻(xiàn)描述了NDV與紅血細(xì)胞(通常為雞)的結(jié)合，由于NDV并不是人的病原體，發(fā)現(xiàn)NDV優(yōu)先與人血液中的白細(xì)胞成分結(jié)合的結(jié)果是很讓人驚異的。
文獻(xiàn)表明，NDV與細(xì)胞的結(jié)合是通過病毒HN蛋白的神經(jīng)氨酸苷酶與連接到細(xì)胞表面蛋白上的唾液酸殘基的相互反應(yīng)產(chǎn)生的。人紅細(xì)胞具有非常高濃度的與細(xì)胞表面蛋白連接的唾液酸殘基，在人血液中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的比例大約為1000∶1，因此，特別使人驚奇的是NDV與占小部分的白細(xì)胞結(jié)合而不是與數(shù)量上多得多的紅細(xì)胞結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種治療腫瘤患者的方法，包括給患者注射適量的可有效地對患者進(jìn)行治療的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在生理溶液中的人白細(xì)胞和具有復(fù)制能力的腫瘤消解病毒(oncolytic virus)，其中該病毒與白細(xì)胞特異性地結(jié)合，及組合物中病毒的空斑形成單位(plaque forming units)與白細(xì)胞數(shù)的比例至少為1∶100，從而對患者進(jìn)行治療。
本發(fā)明提供了一種治療腫瘤患者的方法，包括給患者注射適量的可有效地對患者進(jìn)行治療的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在生理溶液中的以腫瘤消解病毒感染的人體細(xì)胞，其中該細(xì)胞是白細(xì)胞或血小板，從而對患者進(jìn)行治療。
本發(fā)明提供藥物組合物用于治療腫瘤患者或在腫瘤治療藥物的制造中的應(yīng)用，該藥物組合物包含(a)懸浮在生理溶液中的人體白細(xì)胞和具有復(fù)制能力的腫瘤消解病毒，其中該病毒與白細(xì)胞特異性地結(jié)合且組合物中病毒的空斑形成單位與白細(xì)胞數(shù)的比例至少為1∶100；或(b)懸浮在生理溶液中的以腫瘤消解病毒感染的人體細(xì)胞，其中該細(xì)胞是白細(xì)胞或血小板。應(yīng)用(a)和應(yīng)用(b)是有關(guān)聯(lián)的，即實施應(yīng)用(a)通常包含實施應(yīng)用(b)，因為具有復(fù)制能力的腫瘤消解病毒通常會感染白細(xì)胞。
本發(fā)明部分地是基于腫瘤消解病毒如NDV與白細(xì)胞和血小板結(jié)合的發(fā)現(xiàn)，與紅細(xì)胞相比，NDV優(yōu)先與白細(xì)胞結(jié)合。腫瘤涉及到炎性過程，因此與腫瘤消解病毒結(jié)合的白細(xì)胞或以腫瘤消解病毒感染的白細(xì)胞是投送腫瘤消解病毒的特別有效的手段。
具體實施例方式
在這里使用的術(shù)語“人體細(xì)胞”意指從人體分離得到的細(xì)胞，或從人體分離得到的細(xì)胞衍生的和/或其核酸成分通過如永生化、照射或重組的方法改變了的培養(yǎng)細(xì)胞?！叭梭w白細(xì)胞”和“人體血小板”是本身分別為白細(xì)胞和血小板的人體細(xì)胞。除另外特別說明或由上下文所要求的外，術(shù)語“細(xì)胞”或“人體細(xì)胞”指的是白細(xì)胞和/或血小板。
在這里使用的術(shù)語“空斑形成單位”(pfu)意指一個傳染性病毒顆粒。
在這里使用的術(shù)語“感染多重度”(MOI)意指每個細(xì)胞添加的感染性病毒顆粒的數(shù)目。
在這里使用的術(shù)語“克隆病毒”意指源自單個感染性病毒顆粒的病毒，且其分子克隆個體具有顯著的核酸序列同源性，例如，序列同源性達(dá)到至少八個來自該病毒群體的分子克隆個體在超過300個相鄰核苷酸的序列上具有大于95％的序列同源性。
在這里使用的術(shù)語“白細(xì)胞病毒復(fù)合體”(LVC)意指腫瘤消解病毒與白細(xì)胞群體混合且該病毒已與細(xì)胞結(jié)合形成的復(fù)合體，該術(shù)語既包括病毒結(jié)合在細(xì)胞外面的細(xì)胞，也包括被病毒感染的細(xì)胞。
在這里如果病毒與特定的細(xì)胞結(jié)合的特異性高于這種病毒與紅細(xì)胞結(jié)合的特異性，我們就說該病毒與該細(xì)胞“特異性地結(jié)合”?！疤禺愋缘亟Y(jié)合”或“特異性結(jié)合”的英文術(shù)語“bind(s)specifically”和“specifically bind(s)”可互換使用。
在這里“NDV”是新城雞瘟病毒(Newcastle Disease Virus)的縮寫。
在這里使用的術(shù)語“具有復(fù)制能力的”病毒指的是在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生傳染性子代的病毒。
在這里使用的過渡性詞“包括”是開放的，使用該詞語的權(quán)利要求可包含除在該權(quán)利要求中引用的元素外的額外的元素。
按照本發(fā)明，人體細(xì)胞可由任何來源獲得。它們可由患者以外的人提供，但從安全方面考慮，如果可能一般優(yōu)選患者提供的細(xì)胞。任選的從供體分離得到的細(xì)胞首先可在培養(yǎng)物中生長，而該培養(yǎng)的細(xì)胞也被認(rèn)為是細(xì)胞所取自的供體的細(xì)胞。按照本發(fā)明可使用的培養(yǎng)細(xì)胞的例子包括永生化的人體白細(xì)胞系，如美國菌種保藏中心(AmericanType Culture Collection)(ATCC)等來源可公開提供適宜的細(xì)胞系，如U-937(ATCC號CRL-1593.2)和KG-1(ATCC號CCL-246)。
按照本發(fā)明，所使用的白細(xì)胞(例如單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和包括腫瘤滲透性淋巴細(xì)胞在內(nèi)的淋巴細(xì)胞)可以是具有活性的或非活性的。滅活白細(xì)胞的技術(shù)包括照射。
按照本發(fā)明，所使用的細(xì)胞可被分離(例如在白細(xì)胞的情況下通過白細(xì)胞去除進(jìn)行分離)，但細(xì)胞分離不是必需的，也可以改用全血，在這種情況下藥物組合物包含懸浮在全血中的腫瘤消解病毒或含有病毒感染的白細(xì)胞和/或血小板的全血。任選的白細(xì)胞或血小板首先從全血中被分離出來，與病毒混合或以病毒感染，然后再加回到其它的血液成分中。
在本發(fā)明的不同實施例中，白細(xì)胞選自單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。在本發(fā)明的一個更特殊的實施例中，白細(xì)胞是腫瘤滲透性淋巴細(xì)胞(TILs)，TILs可通過例如Rabinowich，H.等人(Cancer Res.，47173-7，1987)描述的方法進(jìn)行制備。
按照本發(fā)明，所使用的腫瘤消解病毒可具有低(弱毒)、中等(中毒)或高(強毒)毒性，毒性水平是根據(jù)雞胚平均死亡時間(MDT)試驗(Alexander，“Chapter 27Newcastle Disease”in Laboratory Manual for theIsolation and Identification of Avian Pathogens，3rded.，Purchase，et al.eds.(Kendall/Hunt，Iowa)，page 117.)確定的，通過MDT試驗將病毒劃分為弱毒(MDT＞90小時)、中毒(MDT從60小時到90小時)和強毒(MDT＜60小時)。
在本發(fā)明的一實施例中，病毒是克隆病毒。
參照使用的藥物組合物包含懸浮的白細(xì)胞和腫瘤消解病毒的方法或應(yīng)用，在該方法的一實施例中病毒的空斑形成單位與組合物中的白細(xì)胞數(shù)的比例至少為1∶1，一般優(yōu)選白細(xì)胞被活性病毒顆粒飽和。在NDV的情況下病毒的空斑形成單位與白細(xì)胞數(shù)的比例為200∶1時達(dá)到飽和，因此在本發(fā)明的實施例中，病毒是NDV且組合物中病毒的空斑形成單位與白細(xì)胞數(shù)的比例從約1∶1到約200∶1，優(yōu)選為約200∶1。
在上述的使用的藥物組合物包含以腫瘤消解病毒感染的細(xì)胞的方法或應(yīng)用中，該方法的一實施例中被感染的細(xì)胞至少是組合物中白細(xì)胞和血小板總數(shù)的千分之一(0.1％)，更優(yōu)選為至少30％及最優(yōu)選為約百分之百。所使用的病毒可以是無復(fù)制能力的，雖然優(yōu)選為病毒是具有復(fù)制能力的。
在本發(fā)明的實施例中，腫瘤消解病毒是選自由新城雞瘟病毒(NDV)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、水泡性口膜炎病毒、副流感病毒、流感病毒、腺病毒、皰疹I(lǐng)型病毒、牛痘病毒和呼腸孤病毒組成的組。在一更特別的實施例可使用中等毒性的新城雞瘟病毒株。
有經(jīng)驗的醫(yī)師能夠確定在各病例中的注射的組合物的最適量。典型情況當(dāng)細(xì)胞是白細(xì)胞時，有效量是組合物注射日劑量包含6×106-6×1010白細(xì)胞/平方米體表面積，例如約6×107白細(xì)胞/平方米體表面積。當(dāng)細(xì)胞是血小板時，有效量一般是組合物的日劑量包含109-1011血小板/平方米體表面積，例如約1011血小板/平方米體表面積。
組合物的日劑量可在單個的24小時的時間段的療程中分多次給患者注射，其中一次注射日劑量的一部分。更優(yōu)選日劑量進(jìn)行單次注射給藥。在本發(fā)明的一實施例中，在一周的時間內(nèi)組合物的日劑量按1到7次的頻率(即在1到7天的各天中)給患者注射。
按照本發(fā)明，任何常規(guī)的注射方式都適用于該藥物組合物的注射，例如該組合物可進(jìn)行靜脈注射、腫瘤內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或膀胱內(nèi)注射(腎)。在靜脈注射的情況下，適宜的組合物注射量從25毫升到1升，在腫瘤內(nèi)注射的情況下，適宜的組合物注射量從100微升到10毫升/腫瘤塊，在腹膜內(nèi)注射的情況下，適宜的組合物注射量可達(dá)到2升，在膀胱內(nèi)注射的情況下，適宜的組合物注射量可達(dá)到75毫升，優(yōu)選為50-60毫升。根據(jù)病毒的pfus和注射的細(xì)胞的量的不同，可對組合物的濃度進(jìn)行改變以獲得適宜的體積。當(dāng)腫瘤是實體瘤時，可采用上述給出的給藥方式中的任一種進(jìn)行組合物的注射，例如靜脈注射或腫瘤內(nèi)注射，而當(dāng)腫瘤是非實體瘤(如白血病)時，不能采用腫瘤內(nèi)注射，而可通過上述給出的其它的給藥方式進(jìn)行組合物的注射，例如靜脈注射。
參照下面的實施例可更好地理解本發(fā)明，這些實施例只是闡述而不是限制在這里所描述的本發(fā)明。在下面的實施例中，所使用的NDV是三次空斑純化的(triple-plaque purified)新城雞瘟病毒MK107株的減毒變體，在2000年10月26日出版的國際專利公開文件WO 00/62735(Pro-Virus公司)中對其有更全面的描述。
實施例實施例1NDV與人體血細(xì)胞的結(jié)合目的研究NDV與人體血細(xì)胞的結(jié)合以確定與病毒結(jié)合的細(xì)胞類型。
材料索引號RL-004的NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗體(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的疊氮鈉的、編目號554656、批號M059394的BD PharMingen Stain Buffer(PSB)緩沖液，編目號710-1832、批號7367的藻紅蛋白偶聯(lián)-Rockland羊抗鼠多克隆抗體，編目號349202、批號82026的Becton Dickinson免疫細(xì)胞計數(shù)儀10X FACS溶血素溶液。
方法人全血被收集在檸檬酸管(3.2％，0.105M，Becton Dickinson#366415)中，從兩管中各取出約4ml全血經(jīng)冷卻并保持在室溫下直至使用。用臺盼藍(lán)排除法和血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，批號RL-004的NDV(1.3E+10PFU/ml)按MOIs(感染多重度，表示為PFU/細(xì)胞)為0.2、0.05和0.02(還有不添加病毒的陰性對照)感染細(xì)胞。在添加病毒后，樣品管在37℃孵育30分鐘，在孵育期間輕輕攪拌三次以使細(xì)胞保持在懸浮狀態(tài)。
樣品清洗兩次，清洗步驟如下加入2ml的冷PSB，在4℃的溫度下2000rpm離心5分鐘并吸除溶液留下細(xì)胞團(tuán)。各次PSB是通過抽吸去除的。通過加入冷PSB將各樣品的體積調(diào)整到1ml，通過加入20μl的含9.1μg抗體的溶液向各樣品添加Mab2F12單克隆抗體。樣品在冰上孵育30分鐘并按前述步驟再清洗兩次，羊抗鼠PE指示抗體通過加入1ml的含12μg/ml該抗體的溶液被加入各樣品中，樣品再在冰上孵育30分鐘并按上述方法清洗。為分析白細(xì)胞部分，100μl的各樣品與3ml的1X FACS溶血素溶液在室溫下孵育6分鐘，再如前進(jìn)行離心和抽吸，細(xì)胞團(tuán)重懸在0.5ml的PSB中。為進(jìn)行紅細(xì)胞分析，1.5μl的各樣品被加入到2.0ml的PSB中。用Becton Dickinson FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品分析，前向和側(cè)向散射參數(shù)采用線性設(shè)置，而藻紅蛋白的FL2檢測采用對數(shù)設(shè)置。
結(jié)果在表1中顯示的試驗結(jié)果表明NDV優(yōu)先與人全血中的白細(xì)胞部分結(jié)合。在MOI為0.05(對于全血)的情況下，46％的白細(xì)胞為NDV陽性，而紅細(xì)胞的NDV陽性率為0％；在MOI為0.2的情況下，NDV在89％的白細(xì)胞中出現(xiàn)，而只與15％的白細(xì)胞結(jié)合。請注意如果扣除紅細(xì)胞不算，則MOI為0.05和0.2對于白細(xì)胞來說約為5和200。在較高的MOI時少量的與紅細(xì)胞結(jié)合的NDV可能反映了與存在于細(xì)胞表面上的唾液酸殘基結(jié)合的低親和力。
表1NDV結(jié)合陽性細(xì)胞百分率(％)

一般認(rèn)為，副粘病毒與紅細(xì)胞相互反應(yīng)并產(chǎn)生紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)(參見How，C.and Lee，L.T.，“Virus-Erythrocyte Interactions”)。因此，人們普遍相信，涉及到與這些病毒結(jié)合的主要的細(xì)胞類型，包括NDV，是紅細(xì)胞。NDV與細(xì)胞的結(jié)合被認(rèn)為是通過病毒HN蛋白的神經(jīng)氨酸酶與連接到細(xì)胞表面蛋白上的唾液酸殘基的相互反應(yīng)產(chǎn)生的。在血液中，為達(dá)到將細(xì)胞保持在溶液中的目的，人紅細(xì)胞具有非常高濃度的與表面蛋白連接的唾液酸殘基。因為在人血液中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的比例大約為1000∶1，因此特別讓人驚奇的是NDV與占小部分的白細(xì)胞結(jié)合而不是與數(shù)量更為巨大的紅細(xì)胞結(jié)合。
實施例2在NDV中和抗體存在的情況下NDV與白細(xì)胞結(jié)合介紹/背景本試驗的目的是檢測NDV在有或無NDV中和抗體存在的情況下與白細(xì)胞結(jié)合能力。在抽取本試驗的全血樣本之前，521號臨床患者接受了大約27個療程的NDV治療，通過空斑中和(plaqueneutralization)和微中和(micro-neutralization)分析顯示521號患者具有顯著水平的NDV中和抗體。
方法從正常供體和521號患者獲得的人全血樣本被收集在檸檬酸管(3.2％，0.105M，Becton Dickenson#366415)中，各供體的采樣管保持在室溫下。將全血樣本按測試用量均分并摻入NDV(批號RL-005)。NDV是按MOIs(感染多重度，表示為PFU/細(xì)胞)為0.2、0.02和0.002(同時還有不加病毒的陰性對照)摻入。在病毒被加入后，采樣管在室溫下孵育30分鐘，通過使用polymorphprep(Nycomed，Inc.)分離液的梯度離心從添加了病毒的樣本中分離血漿和白細(xì)胞。從梯度層的頂部小心地去除血漿，收集兩個白細(xì)胞帶(多形核白細(xì)胞帶和單核細(xì)胞帶)并將其置于0.5X DMEM，使細(xì)胞成團(tuán)并重懸在全濃度DMEM中。細(xì)胞清洗幾次以除去分離介質(zhì)，使用庫耳特顆粒計數(shù)器對各測試量中的白細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。已知數(shù)目的白細(xì)胞或已知用量的血漿被共培養(yǎng)或接種在25cm2組織培養(yǎng)瓶(Corning)中的單層HT1080人纖維肉瘤細(xì)胞(ATCC，CCL-121)上。HT1080細(xì)胞對NDV的細(xì)胞溶解作用是高度敏感的，在數(shù)天內(nèi)對細(xì)胞單層進(jìn)行定性觀察以確定CPE(細(xì)胞病變效應(yīng))的出現(xiàn)。出現(xiàn)CPE的培養(yǎng)瓶被認(rèn)為是陽性的。
結(jié)果如表2中所示，在每瓶300000白細(xì)胞的情況下，對于所有三種MOI的摻入，正常供體和521號患者的兩個被檢測的培養(yǎng)瓶都為NDV感染的陽性；對于正常供體，在3000細(xì)胞的水平所有的培養(yǎng)瓶都為陽性，而在30細(xì)胞的水平除最低的MOI摻入外所有的培養(yǎng)瓶也為陽性；對于521號患者，在3000細(xì)胞水平，MOI為0.02時2個培養(yǎng)瓶中只有1個為陽性，MOI為0.002時2個培養(yǎng)瓶中沒有1個為陽性，在30細(xì)胞水平，MOI為0.2時2個培養(yǎng)瓶中只有1個為陽性，其它所有在這一細(xì)胞水平的培養(yǎng)瓶都為陰性。
血漿數(shù)據(jù)表明，在正常供體，病毒可在所有的MOIs測試中從血漿中恢復(fù)(參見表3)，但是，沒有感染性病毒從含中和抗體的521號患者的血漿中恢復(fù)。
討論結(jié)果表明，與正常供體相比，521號患者與感染性病毒結(jié)合的白細(xì)胞的數(shù)目減少了，但是，病毒仍然能夠在中和抗體存在的情況下與白細(xì)胞結(jié)合，即使在與患者劑量相似的低MOI(0.002)時也出現(xiàn)了這種結(jié)合。
NDV引起導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生的人體免疫反應(yīng)，病毒與白細(xì)胞的結(jié)合可以使該病毒免于中和抗體的攻擊，這是其優(yōu)于游離病毒的地方，游離病毒暴露于中和抗體并導(dǎo)致非感染性。
從這些數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，使用白細(xì)胞作為向腫瘤投送病毒的載體優(yōu)于游離的傳播病毒，在已產(chǎn)生反射反應(yīng)的患者(如已接受多劑量NDV的患者)體內(nèi)的中和抗體會導(dǎo)致游離病毒喪失感染性。
表2感染性NDV與白細(xì)胞結(jié)合的檢測正常供體

521號患者

*每2個測試培養(yǎng)瓶中陽性培養(yǎng)瓶的數(shù)目。
表3感染性NDV的血漿檢測

N＝1培養(yǎng)瓶由于NDV不是人體的病原體，發(fā)現(xiàn)NDV優(yōu)先與人血液中的白血細(xì)胞成分結(jié)合是一個讓人驚異的結(jié)果。
實施例3人白細(xì)胞/NDV復(fù)合體的制備通過白細(xì)胞去除或采用POLYMORPHPREP(Nycomed公司)按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行的梯度離心制備人白細(xì)胞(5×10+8細(xì)胞)，在室溫下用消毒1XPBS清洗細(xì)胞兩次并用同樣的緩沖液將容積調(diào)整到10ml，細(xì)胞與1×10+10pfu的NDV(無菌條件下添加)混合并使其靜置30分鐘(在10和20分鐘進(jìn)行短暫的混合)，在1500rpm對細(xì)胞離心5分鐘并去除PBS，用20ml的1XPBS清洗細(xì)胞并再次離心，細(xì)胞團(tuán)被稀釋到10ml以用于注射。
實施例4用人白細(xì)胞/NDV復(fù)合體治療無胸腺小鼠中的人腫瘤異種移植(＜10mm及＞5mm)無胸腺小鼠用1千萬人腫瘤細(xì)胞進(jìn)行皮內(nèi)注射，在腫瘤大小達(dá)到5-10mm之間的范圍后，給予8×10+6細(xì)胞的如實施例3中所描述的白細(xì)胞/NDV復(fù)合體的單次注射，按完全退化和部分退化觀察LVC對腫瘤生長的作用。
實施例5用人白細(xì)胞/NDV復(fù)合體對患者進(jìn)行全身性的腫瘤治療通過白細(xì)胞去除從患者獲得人白細(xì)胞，按實施例3中所述制備白細(xì)胞/NDV復(fù)合體(LVC)，該復(fù)合體(5×10+8細(xì)胞)通過靜脈注射返回到患者體內(nèi)。LVC的注射隔三天一次，持續(xù)21天。
實施例6用人供體的白細(xì)胞/NDV復(fù)合體對患者進(jìn)行全身性的腫瘤治療通過白細(xì)胞去除從正常供體獲得人白細(xì)胞，按實施例3中所述制備白細(xì)胞/NDV復(fù)合體(LVC)，該復(fù)合體(5×10+8細(xì)胞)通過靜脈注射返回到患者體內(nèi)。LVC的注射隔三天一次，持續(xù)21天。
實施例7NDV與小鼠血細(xì)胞的結(jié)合目的研究NDV與小鼠血細(xì)胞的結(jié)合以確定與病毒結(jié)合的細(xì)胞類型。
材料參考批號RL-004NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗體(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的疊氮鈉的、編目號554656、批號M059394的BD PharMingen Stain Buffer(PSB)緩沖液，編目號710-1832、批號7367的藻紅蛋白偶聯(lián)-Rockland羊抗鼠多克隆抗體，編目號349202、批號82026的Becton Dickinson免疫細(xì)胞計數(shù)儀10X FACS溶血素溶液。
方法小鼠全血被收集在檸檬酸管(3.2％，0.105M，Becton Dickinson#366415)中，用臺盼藍(lán)排除法和血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，批號RL-005的NDV(4.2E+10PFU/ml)按MOIs(感染多重度，表示為PFU/細(xì)胞)為0.2、1和3(還有不添加病毒的陰性對照)感染細(xì)胞。在添加病毒后，樣品管在37℃孵育30分鐘，在孵育期間輕輕攪拌三次以使細(xì)胞保持在懸浮狀態(tài)。
樣品清洗兩次，清洗步驟如下加入2ml的冷PSB，在4℃的溫度下2000rpm離心5分鐘并吸除溶液留下細(xì)胞團(tuán)。每次PSB是通過抽吸去除的。通過加入冷PSB將各樣品的體積調(diào)整到1ml，通過加入20μl的含9.1μg抗體的溶液向各樣品添加Mab2F12單克隆抗體。樣品在冰上孵育30分鐘并按前述步驟再清洗兩次，羊抗鼠-PE指示抗體通過加入1ml的含12μg/ml該抗體的溶液被加入各樣品中，樣品再在冰上孵育30分鐘并按上述方法清洗。為分析白細(xì)胞部分，100μl的各樣品與3ml的1X FACS溶血素溶液在室溫下孵育6分鐘，再如前進(jìn)行離心，細(xì)胞團(tuán)重懸在0.5ml的PSB中。為進(jìn)行紅細(xì)胞分析，1.5μl的各樣品被加入到2.0ml的PSB中。用Becton Dickinson FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品分析，前向和側(cè)向散射參數(shù)采用線性設(shè)置，而藻紅蛋白的FL2檢測采用對數(shù)設(shè)置。
結(jié)果在表4中顯示的試驗結(jié)果表明，與NDV與人血液細(xì)胞結(jié)合時病毒優(yōu)先與人全血中的白細(xì)胞部分結(jié)合(實施例1)的情況不同，NDV優(yōu)先與小鼠全血的紅細(xì)胞部分結(jié)合而不與白細(xì)胞結(jié)合。
表4NDV結(jié)合陽性細(xì)胞百分率(％)

在人白細(xì)胞大部分為NDV結(jié)合陽性的MOI為0.2的情況下，小鼠白細(xì)胞為陰性。
實施例8NDV與大鼠血細(xì)胞的結(jié)合目的研究NDV與大鼠血細(xì)胞的結(jié)合以確定與病毒結(jié)合的細(xì)胞類型。
材料參考批號RL-004 NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗體(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的疊氮鈉的、編目號554656、批號M059394的BD PharMingen Stain Buffer(PSB)緩沖液，編目號710-1832、批號7367的藻紅蛋白偶聯(lián)-Rockland羊抗鼠多克隆抗體，編目號349202、批號82026的Becton Dickinson免疫細(xì)胞計數(shù)儀10X FACS溶血素溶液。
方法從Sprague Dawley大鼠獲得的全血(1.8ml)被收集在檸檬酸管(3.2％，0.105M，Becton Dickinson#366415)中并保持在室溫下直至使用，用臺盼藍(lán)排除法和血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，批號RL-005的NDV(4.2E+10PFU/ml)按MOIs(感染多重度，表示為PFU/細(xì)胞)為0.05、0.2、0.5、1和3(還有不添加病毒的陰性對照)感染細(xì)胞。在添加病毒后，樣品管在37℃孵育30分鐘，在孵育期間輕輕攪拌三次以使細(xì)胞保持在懸浮狀態(tài)。
樣品清洗兩次，清洗步驟如下加入2ml的冷PSB，在4℃的溫度下2000rpm離心5分鐘并吸除溶液留下細(xì)胞團(tuán)。每次PSB是通過抽吸去除的。通過加入冷PSB將各樣品的體積調(diào)整到1ml，通過加入20μl的含9.1μg抗體的溶液向各樣品添加Mab2F12單克隆抗體。樣品在冰上孵育30分鐘并按前述步驟再清洗兩次，羊抗鼠-PE指示抗體通過加入1ml的含12μg/ml該抗體的溶液被加入各樣品中，樣品再在冰上孵育30分鐘并按上述方法清洗。為分析白細(xì)胞部分，100μl的各樣品與3ml的1X FACS溶血素溶液在室溫下孵育6分鐘，再如前進(jìn)行離心，細(xì)胞團(tuán)重懸在0.5ml的PSB中。為進(jìn)行紅細(xì)胞分析，1.5μl的各樣品被加入到2.0ml的PSB中。用Becton Dickinson FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品分析，前向和側(cè)向散射參數(shù)采用線性設(shè)置，而藻紅蛋白的FL2檢測采用對數(shù)設(shè)置。
結(jié)果在表5中顯示的試驗結(jié)果表明，在低MOI(0.02和0.05)的情況下NDV與大鼠白細(xì)胞結(jié)合，而在這些MOI’s的情況下NDV與紅細(xì)胞的結(jié)合并不好。這一形式介于病毒與人白細(xì)胞優(yōu)先結(jié)合和與小鼠白細(xì)胞不結(jié)合之間。
表5NDV結(jié)合陽性細(xì)胞百分率(％)

實施例9NDV與人血小板的結(jié)合目的研究NDV與人血小板的結(jié)合。
材料參考批號RL-004 NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗體(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的疊氮鈉的、編目號554656、批號M059394的BD PharMingen Stain Buffer(PSB)緩沖液，編目號710-1832、批號7367的藻紅蛋白偶聯(lián)-Rockland羊抗鼠多克隆抗體，編目號349202、批號82026的Becton Dickinson免疫細(xì)胞計數(shù)儀10X FACS溶血素溶液。
方法血小板的分離人全血被收集在檸檬酸管(3.2％，0.105M檸檬酸鹽，BectonDickinson#366415)中，將7ml的全血放入15ml的聚丙烯離心管中，該管在室溫下按800g離心5分鐘，從離心管的頂部收集大約1.5ml的富血小板血漿(PRP)。根據(jù)公布的產(chǎn)率，確定樣品中含有8.0E+8細(xì)胞/ml。100μl的PRP在室溫下用NDV(RL-005)按MOIs為0.1、10和100感染30分鐘。
樣品清洗兩次，清洗步驟如下加入2ml的冷PSB，在4℃的溫度下2000rpm離心5分鐘并吸除溶液留下細(xì)胞團(tuán)。每次PSB是通過抽吸去除的。通過加入冷PSB將各樣品的體積調(diào)整到1ml，通過加入20μl的含9.1μg抗體的溶液向各樣品添加Mab2F12單克隆抗體。樣品在冰上孵育30分鐘并按前述步驟再清洗兩次，羊抗鼠-PE指示抗體通過加入0.1ml的含12μg/ml該抗體的溶液被加入各樣品中，樣品再在冰上孵育30分鐘并按上述方法清洗。用Becton Dickinson FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品分析，前向和側(cè)向散射參數(shù)采用線性設(shè)置，而藻紅蛋白的FL2檢測采用對數(shù)設(shè)置。
結(jié)果在表6中顯示的試驗結(jié)果表明，NDV與人血小板結(jié)合。在MOI的測試范圍內(nèi)NDV結(jié)合陽性的血小板的數(shù)目沒有很大的增加，盡管平均熒光值的顯著增長，這表明隨著MOI的增大，有更多的NDV結(jié)合到血小板的陽性部分。
表6NDV與人血小板的結(jié)合

實施例10NDV與人白細(xì)胞結(jié)合的等級材料參考批號RL-004NDV，抗NDV HN蛋白的Mab2F12抗體(3.5mg/ml)，含有2％的新生小牛血清和0.02％的疊氮鈉的、編目號554656、批號M059394的BD PharMingenTMStain Buffer(PSB)緩沖液，編目號7100-1832、批號7367的藻紅蛋白偶聯(lián)-Rockland羊抗鼠多克隆抗體，編目號349202、批號82026的Becton Dickinson免疫細(xì)胞計數(shù)儀10X FACS溶血素溶液。
方法人全血被收集在檸檬酸管(3.2％，0.105M，Becton DickinsonTM#366415)中，從兩管中各取出約4ml全血經(jīng)冷卻并保持在室溫下直至使用。用臺盼藍(lán)排除法和血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，批號RL-004的NDV(1.3E+10PFU/ml)按相對于全血的MOIs(感染多重度，表示為PFU/細(xì)胞)為0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1和0.2感染100μl的樣品。在添加病毒后，樣品在37℃孵育30分鐘。
樣品清洗兩次，清洗步驟如下加入2ml的冷PSB，在4℃的溫度下2000rpm離心5分鐘并吸除溶液留下細(xì)胞團(tuán)。用PSB將各樣品的體積調(diào)整到100μl，通過加入2μl在PSB中制備的含1μg抗體的溶液向各樣品添加Mab2F12單克隆抗體。樣品在冰上孵育30分鐘并按前述步驟再清洗兩次，向各樣品中加入100μl的由含12μg/ml該抗體的溶液按2.4∶1的比率在PSB中稀釋的溶液以添加羊抗鼠-PE指示抗體，樣品再在冰上孵育30分鐘并按上述方法清洗。為制備用于白細(xì)胞分析的樣品，各樣品與3ml的1X FACS溶血素溶液在室溫下孵育6分鐘，再如前進(jìn)行離心和抽吸，細(xì)胞團(tuán)重懸在0.5ml的PSB中。用Becton DickinsonFACSCaliburTM流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品分析，通過比較各樣品的前向散射和側(cè)向散射參數(shù)選擇性通過粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞群體，這被用于確定各樣品中各細(xì)胞群體的病毒結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)和平均熒光值。
結(jié)果(表7)表明，NDV優(yōu)先與三個細(xì)胞群體結(jié)合，優(yōu)先順序為單核細(xì)胞＞粒細(xì)胞＞＞淋巴細(xì)胞。而且，如平均熒光值數(shù)據(jù)所顯示的，單核細(xì)胞群體與NDV的結(jié)合比粒細(xì)胞群體顯著要多，比淋巴細(xì)胞群體更多得多。
表7

權(quán)利要求
1.一種藥物組合物在腫瘤患者治療中的應(yīng)用，該藥物組合物包含(a)懸浮在生理溶液中的人體細(xì)胞和具有復(fù)制能力的腫瘤消解病毒(oncolytic virus)，其中所說的細(xì)胞為白細(xì)胞，所說的病毒與白細(xì)胞特異性地結(jié)合，且在該組合物中病毒的空斑形成單位(plaque forming units)與白細(xì)胞數(shù)的比例至少是1∶100；或者(b)懸浮在生理溶液中的以腫瘤消解病毒感染的人體細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞為白細(xì)胞或血小板。
2.一種腫瘤患者的治療方法，包括給患者注射適量的可有效地對患者進(jìn)行治療的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在生理溶液中的人體細(xì)胞和具有復(fù)制能力的腫瘤消解病毒(oncolytic virus)，其中所說的細(xì)胞為白細(xì)胞；所說的病毒與白細(xì)胞特異性地結(jié)合；及組合物中病毒的空斑形成單位(plaque forming units)與白細(xì)胞數(shù)的比例至少為1∶100，從而對患者進(jìn)行治療。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的藥物組合物包含懸浮在全血中的腫瘤消解病毒。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中組合物中病毒的空斑形成單位與白細(xì)胞數(shù)的比例至少為1∶1。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用或方法，其中組合物中病毒的空斑形成單位與白細(xì)胞數(shù)的比例范圍從約1∶1到約200∶1。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用或方法，其中所說的比例為約200∶1。
7.一種腫瘤患者的治療方法，包括給患者注射適量的可有效地對患者進(jìn)行治療的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在生理溶液中的以腫瘤消解病毒感染的人體細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞為白細(xì)胞或血小板，從而對患者進(jìn)行治療。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的細(xì)胞是患者的細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的細(xì)胞是除患者外的供體的細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的細(xì)胞是培養(yǎng)細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用或方法，其中所說的培養(yǎng)細(xì)胞包括永生細(xì)胞系。
12.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用或方法，其中所說的永生細(xì)胞系為U-937或KG-1。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的細(xì)胞為白細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用或方法，其中所說的白細(xì)胞是通過白細(xì)胞去除(leukopheresis)分離的白細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求13-14中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的白細(xì)胞是具有活性的。
16.如權(quán)利要求13-14中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的白細(xì)胞是非活性的。
17.如權(quán)利要求13-16中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的白細(xì)胞是單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用或方法，其中所說的白細(xì)胞是腫瘤滲透性淋巴細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求1-3和權(quán)利要求7-11中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的細(xì)胞是血小板。
20.如權(quán)利要求1和7-19中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的藥物組合物包含全血，在全血中含有以病毒感染的白細(xì)胞或血小板。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的病毒具有低到中等的毒性。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的病毒是克隆病毒。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的被感染細(xì)胞至少是組合物中白細(xì)胞和血小板總數(shù)的千分之一。
24.如權(quán)利要求23所述的應(yīng)用或方法，其中所說的被感染細(xì)胞至少是組合物中白細(xì)胞和血小板總數(shù)的百分之三十。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的病毒選自由新城雞瘟病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、水泡性口膜炎病毒、副流感病毒、流感病毒、腺病毒、皰疹I(lǐng)型病毒、牛痘病毒和呼腸孤病毒組成的組。
26.如權(quán)利要求25所述的應(yīng)用或方法，其中所說的病毒是具有中等毒性的新城雞瘟病毒。
27.如權(quán)利要求1-18和20-26中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的藥物組合物的有效量是6×106至6×1010白細(xì)胞/平方米體表面積的日注射劑量。
28.如權(quán)利要求27所述的應(yīng)用或方法，其中所說的日劑量為約6×107白細(xì)胞/平方米體表面積。
29.如權(quán)利要求1、7-11和19-26中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的有效量是109-1011血小板/平方米體表面積的日劑量。
30.如權(quán)利要求29所述的應(yīng)用或方法，其中所說的日劑量為約1011血小板/平方米體表面積。
31.如權(quán)利要求27-30中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的日劑量是單次給藥的。
32.如權(quán)利要求27-31中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中在一周的時間內(nèi)，所說的日劑量按一到七次的頻率給藥。
33.如權(quán)利要求1-32中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的組合物是通過靜脈給藥。
34.如權(quán)利要求33所述的應(yīng)用或方法，其中所說的組合物的給藥量從25毫升到1升。
35.如權(quán)利要求1-32中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的組合物是腫瘤內(nèi)注射給藥的。
36.如權(quán)利要求35所述的應(yīng)用或方法，其中所說的組合物的給藥量是每個腫瘤塊100微升到10毫升。
37.如權(quán)利要求1-36中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的腫瘤是實體瘤，且所說的組合物是靜脈注射或腫瘤內(nèi)注射給藥。
38.如權(quán)利要求1-36中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的腫瘤是非實體瘤，且所說的組合物是靜脈注射給藥。
39.如權(quán)利要求38所述的應(yīng)用或方法，其中所說的腫瘤是白血病。
40.如權(quán)利要求1-32中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的組合物是腹膜內(nèi)注射的。
41.如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用或方法，其中所說的組合物的注射量最大達(dá)到2升。
42.如權(quán)利要求1-32中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的組合物是膀胱內(nèi)注射的。
43.如權(quán)利要求42所述的應(yīng)用或方法，其中所說的組合物的注射量最大達(dá)到75毫升。
44.如權(quán)利要求43所述的應(yīng)用或方法，其中所說的組合物的注射量為50-60毫升。
45.如權(quán)利要求1、3-15和17-44中任一項所述的應(yīng)用或方法，其中所說的病毒是能夠復(fù)制的。
46.本發(fā)明基本上如此所述。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤患者的治療方法。給患者注射一種藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在生理溶液中的人體白細(xì)胞和具有復(fù)制能力的腫瘤消解病毒(oncolytic virus)，或者該藥物組合物包含以腫瘤消解病毒感染的人體白細(xì)胞或血小板。
文檔編號C12N5/02GK1514688SQ02809700
公開日2004年7月21日 申請日期2002年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月11日
發(fā)明者威廉S·格洛依那, 威廉S 格洛依那, A 米勒, 杰弗里A·米勒, N 繆勒, 斯蒂芬N·繆勒 申請人:沃爾斯泰特生物制劑公司