專(zhuān)利名稱(chēng)：利用pcr確定已知dna序列的兩側(cè)未知序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種利用PCR(Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)，從部分已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列確定該DNA或基因序列兩側(cè)的未知DNA序列的方法。
本發(fā)明提出的根據(jù)部分DNA序列來(lái)確定其兩側(cè)未知DNA序列的方法，是通過(guò)對(duì)已知序列的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切，選擇合適的PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其具體步驟如下(1)寡聚脫氧核糖核酸引物設(shè)計(jì)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)半巢式PCR引物(semi-nested PCRprimers)，分別命名為P1和P2，長(zhǎng)度為15-25bp(base pair)，要求P1、P2引物的5’到3’是從已知DNA序列區(qū)域向待測(cè)定的未知DNA序列區(qū)域方向延伸。P2比P1更靠近待測(cè)的未知序列部分，而且兩者可以部分的重疊(見(jiàn)

圖1所示)。P2的3’端距離待測(cè)序列要保留15-100bp，合成引物L(fēng)P(Link Primer)，3’末端的四個(gè)寡聚脫氧核糖核苷酸為GTGC，長(zhǎng)度為15-25bp，表述如5’-XXXGTGC-3’，其中的XXX表示根據(jù)基因組DNA的GC含量來(lái)設(shè)計(jì)的11-21bp長(zhǎng)度的寡聚脫氧核糖核苷酸，其GC含量要與基因組DNA的接近；再設(shè)計(jì)三種寡聚脫氧核糖核苷酸，分別命名為MBO，TAQ和MAE，序列為MBO(為八堿基)5’-GATCGCAC-3’，TAQ(為六堿基)5’-CGGCAC-3’，MAE(為六堿基)5’-TAGCAC-3’(2)限制性?xún)?nèi)切酶的選擇根據(jù)對(duì)已知DNA序列上的限制性?xún)?nèi)切酶(RE，restrictionenzyme)酶切位點(diǎn)的分析，選用在已知序列上沒(méi)有酶切位點(diǎn)的常用酶，或者選擇在從P1到待測(cè)的未知序列之間沒(méi)有酶切位點(diǎn)的酶，對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，并與三種寡聚脫氧核糖核苷酸作用。
本發(fā)明可選用三種生成同樣粘端的同裂酶，分別為生成5’-GATC-3’粘性末端切口的BamH I，Sau3A I，Mbo I，Dpn I；生成5’-CG-3’粘性末端切口的Aci I，Cla I，Hin 6I，MaeII，Msp I，Taq I；生成5’-TA-3’粘性末端切口的Bfa I(MaeI*)，Csp6 I MseI，Nde I，MseI。
本發(fā)明中，上述三種類(lèi)型的寡聚核苷酸，可以根據(jù)不同的GC含量的基因組來(lái)選擇使用，高GC含量(＞60％)選用TAQ與LP作用，低GC含量(＜40％)選用MAE與LP作用?；蛘吒鶕?jù)實(shí)際需要作出調(diào)整，或者同時(shí)使用三種，可以滿足大部分的實(shí)驗(yàn)要求。
經(jīng)與寡聚核苷酸作用后，抽提基因組DNA(具體方法根據(jù)不同的樣品有差異)，將基因組DNA用根據(jù)上述原則確定的限制性?xún)?nèi)切酶作用0.5-18小時(shí)后，純化基因組DNA片斷。如可先用酚—氯仿去除限制性?xún)?nèi)切酶，再用乙醇沉淀的方法純化獲得基因組DNA片段；(3)PCR模板構(gòu)建按照一定比例將寡聚脫氧核糖核苷酸MBO或TAQ或MAE與LP作用，使LP與相應(yīng)的堿基配對(duì)部分形成雙鏈，再與基因組DNA酶切后的產(chǎn)物在12-25℃用連接酶連接5-24小時(shí)。作為PCR模板。流程見(jiàn)圖2。本發(fā)明中，MBO、TAB或MAE與LP的反應(yīng)條件可以為在50-80℃加熱5-30分鐘，然后室溫退火。
(4)PCR擴(kuò)增以步驟(3)中的產(chǎn)物為模板，以P1和LP為首輪PCR引物，PCR擴(kuò)增待測(cè)的未知DNA序列。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和回收，再用LP和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)所得到的片段進(jìn)行克隆和序列測(cè)定。
根據(jù)P2和未知序列之間保留的15-100bp長(zhǎng)度的已知DNA序列，可以快速驗(yàn)證所獲得的序列是否為目標(biāo)序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的單側(cè)PCR法如同RACE方法一樣可以測(cè)定已知DNA序列兩端的未知序列。但是RACE所采用的是在RNA基礎(chǔ)上的操作。與RACE相比，更具有如下的優(yōu)點(diǎn)1、技術(shù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單易行。本發(fā)明提供了一種在已知部分DNA序列的基礎(chǔ)上測(cè)定其兩端未知序列的有效，快速的實(shí)用方法，2、簡(jiǎn)化勞動(dòng)。與傳統(tǒng)方法比較，避免了對(duì)基因組進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，節(jié)省了大量的時(shí)間和財(cái)力，而且無(wú)需進(jìn)行繁瑣的計(jì)算和排序工作。
3、應(yīng)用范圍廣。單側(cè)PCR可以應(yīng)用于已知部分RNA或DNA序列的基礎(chǔ)上對(duì)其兩端未知序列的測(cè)定。連接基因組DNA酶切位點(diǎn)粘性末端上的六或八個(gè)堿基的寡聚核苷酸(MBO，TAQ和MAE)以及LP引物，一次設(shè)計(jì)，長(zhǎng)期可用于不同類(lèi)型的序列測(cè)定。
4、操作限制少。單側(cè)PCR只要有50bp的已知序列就足夠操作。相比之下，RACE要求已知300bp以上的長(zhǎng)度。避免了RNA操作，減低了污染可能性。
5、結(jié)果分析簡(jiǎn)便可靠。使用巢式引物，可以用內(nèi)套引物P2進(jìn)行特異性更強(qiáng)的擴(kuò)增，從而提高了克隆的正確度和可靠性，提高工作效率。內(nèi)套引物的3’端和未知待測(cè)序列間的一部分已知序列(一般在設(shè)計(jì)引物時(shí)預(yù)先留下15-100bp)可以用來(lái)驗(yàn)證所測(cè)得的DNA序列是否是目標(biāo)序列，這種驗(yàn)證方法準(zhǔn)確方便，實(shí)用性強(qiáng)。
6、長(zhǎng)度不限。基因組DNA的酶切是隨機(jī)的，可以獲得未知序列長(zhǎng)達(dá)幾Kb的序列，而且序列的準(zhǔn)確性和真實(shí)性不會(huì)由于長(zhǎng)度的增加而受影響。這是RACE方法所不能及的。
7、操作對(duì)人員和環(huán)境無(wú)危害。不用構(gòu)建Genomic庫(kù)，所以避免了使用同位素。
8、成本低。只相當(dāng)于普通的PCR，無(wú)需昂貴的操作試劑盒。
其中，半巢式PCR引物P1和P2，長(zhǎng)度為15-25bp，P2比P1更靠近待測(cè)的未知序列部分，而且兩者可以部分的重疊。P2的3’端距離待測(cè)序列要保留15-100bp，引物5’→3’方向?yàn)閺囊阎狣NA序列區(qū)域向待測(cè)定的未知DNA序列區(qū)域方向延伸。
圖2為已知DNA序列擴(kuò)增的模板構(gòu)建圖示。
圖中的MBO處可以MBO或TAQ或MAE代替，和LP作用，形成部分雙鏈的DNA結(jié)構(gòu)，再和三種類(lèi)型的同裂酶作用后形成的基因組DNA片斷的粘端分別連接，構(gòu)建形成三種模板，應(yīng)用到后續(xù)的PCR中作為模板具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1Lip I(Alkaline Lipase I，圓弧青霉PG37堿性脂肪酶I)基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增在已知Lip I DNA序列的基礎(chǔ)上，采用本發(fā)明擴(kuò)增Lip I基因的上游啟動(dòng)子DNA片段(啟動(dòng)子位于基因的上游位置)。首先根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)合成了3’端引物P1和P2，P2靠近LipI的啟動(dòng)子端。TAQ5’-CGGCAC-3’和5’端連接處引物L(fēng)P 5’-GGATCCCTTCACTCTCAAGTGC-3’，用識(shí)別位點(diǎn)為CCGG的限制性?xún)?nèi)切酶Msp1酶切PG37基因組DNA；然后將TAQ和LP在50℃加熱5min，室溫退火，再與PG37基因組DNA酶切產(chǎn)物在25℃連接12小時(shí)，就會(huì)在5’端的待測(cè)未知序列的Msp I酶切部位的粘性末端上連接上LP。以連接產(chǎn)物為模板，LP和P1為引物，PCR擴(kuò)增Lip I的啟動(dòng)子片段。PCR擴(kuò)增條件為10xPCR Buffer 5μl，無(wú)菌去離子水32μl，Taq酶(1U/μl)1μl，dNTP(1 mM)Mix 10μl，5’端引物L(fēng)P(20pmol/μl)1μl，3’端引物P1(20pmol/μl)1μl，連接產(chǎn)物1μl。94℃預(yù)變性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，共35循環(huán)；最后72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，純化，再用LP和3’端內(nèi)套引物P2進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確后，進(jìn)行克隆和序列測(cè)定。測(cè)得新的序列大小為120bp，為L(zhǎng)ip I的啟動(dòng)子序列。
實(shí)施例2嗜鹽西藏515菌株紫膜蛋白(Archaerhodopsin of Halobacteria halobium SpeciesXZ515 Strain，H.sp.xz515)基因全序列的測(cè)定Rhodopsin是一個(gè)七次跨膜的具有光驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵功能的蛋白質(zhì)。為研究它和其它功能相近的蛋白質(zhì)之間的功能差異的原因，需要獲得DNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行比較生物學(xué)分析，以期望獲得增進(jìn)Rhodopsin的質(zhì)子泵功能。通過(guò)純化得到了Rhodopsin，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序，但是由于蛋白質(zhì)末端結(jié)構(gòu)封閉，從蛋白質(zhì)測(cè)序從而設(shè)計(jì)引物無(wú)法獲得Rhodopsin DNA的全序列，只能獲得中間的一部分DNA序列。通過(guò)本發(fā)明可以測(cè)定其兩端序列。對(duì)于Rhodopsin的N端序列，通過(guò)中間這一已知DNA序列，設(shè)計(jì)引物P1和P2P15’-ACTTCGGTCACACCGATGC-3’P25’-ACATCGCCAGATACGC-3’P2為內(nèi)套引物，靠近待測(cè)DNA序列，P2與待測(cè)DNA序列有13bp的已知序列5’-GATCGCGTCGGCC-3’。TAQ和5’端引物L(fēng)P 5’-GGATCCCTTCACTCTCAAGTGC-3’，用限制性?xún)?nèi)切酶MspI酶切H.sp.xz515基因組DNA；然后將TAQ和LP在60℃加熱5min，退火，再與H.sp.xz515基因組DNA酶切后的產(chǎn)物在25℃連接18小時(shí)。以連接產(chǎn)物為模板，LP和P1為引物，PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為10xPCR Buffer 5μl，無(wú)菌去離子水32μl，Taq酶(1U/μl)1μl，dNTP(1mM)Mix 10μl，5’端引物L(fēng)P(20pmol/μl)1μl，3’端引物P1(20pmol/μl)1μl，連接液1μl。94℃預(yù)變性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35循環(huán)；最后72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，割膠回收，再用LP和內(nèi)套引物P2進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確后，進(jìn)行克隆和序列測(cè)定。DNA序列測(cè)定結(jié)果在緊鄰P2的3’端有13bp的已知序列5’-GATCGCGTCGGCC-3’，可以證明所得到的DNA序列確實(shí)是Rhodopsin的N端序列，其中還包含有啟動(dòng)子序列和起始翻譯密碼子ATG.根據(jù)本發(fā)明同樣測(cè)定了Rhodopsin的蛋白質(zhì)C端的序列。通過(guò)本發(fā)明所獲得的DNA序列，將Rhodopsin的全序列(包括上游調(diào)控序列)從基因組DNA上用PCR法擴(kuò)增得到。本發(fā)明所獲得的Rhodopsin基因全序列已經(jīng)收錄入GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)，編號(hào)Bankit358492AF306937.
權(quán)利要求
1.一種根據(jù)部分DNA序列確定其兩側(cè)未知序列的方法，其特征在于通過(guò)對(duì)已知序列的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切，選擇合適的PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)展，其具體步驟如下(1)寡聚脫氧核糖核酸引物設(shè)計(jì)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)半巢式PCR引物，分別命名為P1和P2，長(zhǎng)度為15-25bp，P2比P1更靠近待測(cè)的未知序列部分，而且兩者可以部分的重疊，P2的3’端距離待測(cè)序列要保留15-100bp；合成引物L(fēng)P，3’末端的四個(gè)寡聚脫氧核糖核苷酸為GTGC，長(zhǎng)度為15-25bp，表述如5’-XXXGTGC-3’，其中的XXX表示根據(jù)基因組DNA的CG含量來(lái)設(shè)計(jì)的11-21bp長(zhǎng)度的寡聚脫氧核糖核苷酸；再設(shè)計(jì)三種寡聚脫氧核糖核苷酸，分別命名為MBO，TAQ和MAE，序列為MBO5’-GATCGCAC-3’，TAQ5’-CGGCAC-3’，MAE5’-TAGCAC-3’(2)限制性?xún)?nèi)切酶的選擇根據(jù)對(duì)已知DNA序列上的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的分析，選用在已知序列上沒(méi)有酶切位點(diǎn)的常用酶，或者選擇在從P1到待測(cè)的未知序列之間沒(méi)有酶切位點(diǎn)的酶，對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，并與三種寡聚脫氧焦糖核苷酸作用；經(jīng)與寡聚核苷酸作用后，抽提基因組DNA，將基因組DNA用根據(jù)上述原則確定的限制性?xún)?nèi)切酶作用0.5-18小時(shí)后，純化基因組DNA片斷；(3)PCR模板構(gòu)建按照一定比例將寡聚脫氧核糖核苷酸MBO或TAQ或MAE與LP作用，使LP與相應(yīng)的堿基配對(duì)部分形成雙鏈，再與基因組DNA酶切后的產(chǎn)物在12-25℃用連接酶連接5-24小時(shí)；(4)PCR擴(kuò)增以步驟(3)中的產(chǎn)物為模板，以P1和LP為首輪PCR引物，PCR擴(kuò)增待測(cè)的未知DNA序列；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和回收，再用LP和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對(duì)所得到的片段進(jìn)行克隆和序列測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選用如下三種生成同樣粘端的同裂酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切生成5’-GATC-3’粘性末端切口的BamH I，Sau3A I，Mbo I，Dpn I；生成5’-CG-3’粘性末端切口的Aci I，Cla I，Hin 6I，Mae II，Msp I，Taq I；生成5’-TA-3’粘性末端切口的Bfa I(MaeI*)，Csp6 I，MseI，Nde I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于根據(jù)基因組不同的GC含量選擇使用MBO、TAQ、MAE和LPGC含量＞60％，選用TAQ與LP作用，GC含量≤40％，選用MAE與LP作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于構(gòu)建PCR模板時(shí)MBO、TAQ或MAE與LP的作用條件為在50-80℃加熱30分鐘，然后室溫退火。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用PCR確定已知DNA序列的兩側(cè)未知序列的方法。它是通過(guò)對(duì)已知序列的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切，設(shè)計(jì)合適的PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后對(duì)所得片斷進(jìn)行克隆和序列測(cè)定。本發(fā)明技術(shù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單易行，操作限制少，應(yīng)用范圍廣，結(jié)果分析簡(jiǎn)便可靠，而且成本低廉。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1418968SQ0213747
公開(kāi)日2003年5月21日 申請(qǐng)日期2002年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月16日
發(fā)明者黃偉達(dá), 王奕然, 錢(qián)志康, 鄔敏辰, 王維榮 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)