專利名稱：同種異體組織工程化軟骨及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地涉及組織工程化軟骨及其制各方法和用途。
背景技術(shù)：
軟骨組織作為一種結(jié)締組織主要起支撐、保護、分散應(yīng)力等作用。組織學(xué)上可分為透明軟骨(關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨、鼻軟骨、氣管軟骨)、彈性軟骨(會厭軟骨、耳軟骨)、纖維軟骨(半月板)三類。它們在組織學(xué)上都是只含有軟骨細胞的單一組織，內(nèi)部無血管，營養(yǎng)主要依靠組織液的滲透。
從結(jié)構(gòu)上看，軟骨細胞被包裹在軟骨陷窩內(nèi)，其周圍厚厚的軟骨囊作為一道天然屏障，將軟骨細胞與周圍組織分離開來。因此，軟骨組織具有抗原性弱，不易被機體免疫系統(tǒng)識別和攻擊而具有較輕免疫排斥反應(yīng)的特點。早期的研究結(jié)果表明，同種異體軟骨細胞可以在受體體內(nèi)存活并保持分泌基質(zhì)的功能。
軟骨病損是臨床常見疾病之一，如由創(chuàng)傷、感染、自身免疫、腫瘤等因素引起的各種關(guān)節(jié)表面疾患；耳廓軟骨、鼻、喉軟骨支架的缺損、畸形；以及兒童骨骺生長板的創(chuàng)傷、早閉、壞死等。由于軟骨組織幾乎沒有自我修復(fù)能力，所以必須利用軟骨或其它替代材料進行修復(fù)。
自體軟骨組織移植療效可靠，但必須以犧牲人體正常組織為代價，且患者要多遭受一次手術(shù)的痛苦。此外，自體組織來源有限，小塊移植物還有易變形的問題。
目前，雖然有一些人工合成的軟骨組織代用品，還存在著組織相容性、材料機械特性等方面的缺陷，尚不能滿足臨床上的各項要求。
組織工程學(xué)為軟骨組織缺損的治療開辟了新的途徑。組織工程用少量細胞在體外擴增，然后接種到生物可降解材料上，構(gòu)建成組織，用于移植，修復(fù)缺損。
構(gòu)建組織工程化軟骨組織的重要條件之一是必須獲得大量的有功能和活力的軟骨細胞，研究表明，原代單層培養(yǎng)的軟骨細胞能夠持續(xù)表達特異性II型膠原數(shù)日至數(shù)周，但在隨后的傳代培養(yǎng)中，軟骨細胞發(fā)生“去分化”，即向成纖維樣細胞轉(zhuǎn)化，開始表達I型和III型膠原，喪失分泌軟骨基質(zhì)的能力，植入體內(nèi)后已無成軟骨能力，所以難以用少量自體組織經(jīng)體外培養(yǎng)擴增后來獲得大量有正常功能的軟骨細胞，限制了其在臨床的應(yīng)用。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的安全性高、可操作性強的組織工程化軟骨。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的安全性高、制法簡便的組織工程化軟骨。
本發(fā)明的另一目的就是提供所述組織工程化軟骨的制法和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種一種組織工程化軟骨移植物，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；(b)軟骨細胞，所述的軟骨細胞為體外培養(yǎng)原代至第六代的胚胎軟骨細胞。
在一優(yōu)選例中，所述的軟骨細胞是同種異體的。
在另一優(yōu)選例中，所述的移植物為液態(tài)，且軟骨細胞的含量為1×106個細胞/ml-1×108個細胞/ml。
在另一優(yōu)選例中，所述的移植物為固態(tài)，且軟骨細胞的含量為1×106個細胞/ml-1×108個細胞/ml。
在另一優(yōu)選例中，所述的軟骨細胞表達II型膠原。
在另一優(yōu)選例中，所述軟骨細胞來源于3-10月齡自然流產(chǎn)人胎兒的軟骨。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠、脫細胞基質(zhì)，及其混合物。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備組織工程化軟骨移植物的方法，包括步驟將軟骨細胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，形成移植物，其中所述的軟骨細胞為體外培養(yǎng)原代至第六代的軟骨細胞。
在一優(yōu)選例中，移植物中軟骨細胞的含量為1×106個細胞/ml-1×108個細胞/ml。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠、脫細胞基質(zhì)，及其混合物。


圖1是人胎兒軟骨細胞的增殖率曲線。
圖2是人胎兒軟骨細胞的增殖曲線。
圖3是以胎兒軟骨細胞為種子細胞來源，裸鼠體內(nèi)構(gòu)建的組織工程化軟骨的照片(大體觀)。
圖4是組織工程化軟骨的HE染色照片，表明組織工程化軟骨組織學(xué)觀察與正常軟骨組織結(jié)構(gòu)接近(HE染色，×200)。
具體實施例方式
同種異體軟骨組織作為一種移植物來源，因其獨特的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特性，而引起研究者和臨床醫(yī)生的興趣。同種異體來源的軟骨細胞具有來源廣泛，取材容易，一次可獲取大量細胞的優(yōu)點，此外，由于成熟的軟骨組織屬于無血管結(jié)構(gòu)的組織，在很大程度上隔離了免疫細胞，使得組織工程化軟骨組織能夠在體內(nèi)長期存活。
不同生長、發(fā)育階段的同種異體軟骨細胞可以在有組織相容性差異，并且具有完全免疫功能的同種異體動物體內(nèi)形成軟骨組織。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)胚胎來源的軟骨細胞所形成的組織工程化軟骨比新生及成年動物來源的軟骨細胞所形成的新生軟骨在受體體內(nèi)存留的時間要顯著延長。因此，胚胎來源的軟骨細胞可以作為組織工程化軟骨組織的種子細胞來源。尤其是體外培養(yǎng)原代至第六代的軟骨細胞具有較強的增殖能力，可與藥學(xué)上可接受的降解材料一起構(gòu)成組織工程化軟骨移植物，有效地用于修復(fù)軟骨損傷。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
術(shù)語術(shù)語“純化的或分離的”指純化的或分離的物質(zhì)基本上不含有其他細胞、蛋白質(zhì)或多肽，例如純化的細胞因子或分離的細胞因子。
術(shù)語“異種移植”指將所需生物材料(如皮膚)從某一物種中取出并再施用于另一物種對象的方法。
術(shù)語“自體移植”指將所需生物材料(如皮膚)從某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
術(shù)語“異體移植”指將所需生物材料(如皮膚)從某個體中取出并再施用于另一不同病人的方法。
本發(fā)明的軟骨細胞的來源沒有特別限制，可以是任何來源的軟骨細胞，通常，本發(fā)明的軟骨細胞的是同種異體的。一種優(yōu)選的來源是來自自然流產(chǎn)的人胎兒，以3-10月胎齡左右為佳。獲取軟骨的部位也沒有特別限制，可以是關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨或其他軟骨。
分離獲得軟骨細胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。一種優(yōu)選的方法是通過胰酶、膠原酶消化進行分離，即用無血清F-12培養(yǎng)基(GIBCO公司)將胰酶或膠原酶濃度調(diào)整至0.1-5mg/ml(較佳地約為1mg/ml)，37℃±2℃恒溫振蕩器內(nèi)消化約4-20h。檢測時，可采用臺盼藍染色，顯微鏡下計數(shù)。通常，原代細胞活力＞50％即可。
軟骨細胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液也是本領(lǐng)域中熟知的。一種優(yōu)選的方法是將軟骨細胞在體外CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于)1)F-12培養(yǎng)基(GIBCO公司)+10％胎牛血清；2)F-12培養(yǎng)基(GIBCO公司)+20％小牛血清；3)F-12培養(yǎng)基(GIBCO公司)+10-20％自體(異體)人血清。此外，上述培養(yǎng)液中添加各種生長因子(例如促進軟骨細胞生長的細胞因子等)、各種轉(zhuǎn)基因成分、各種細胞成分。
適用于本發(fā)明的軟骨細胞應(yīng)能在體內(nèi)或體外增殖。一種優(yōu)選的軟骨細胞是體外培養(yǎng)的原代-第六代細胞。因為這一階段軟骨細胞具有較強的增殖力。對于這一階段的軟骨細胞，免疫組織化學(xué)染色證明了它們表達II型膠原，而原位雜交檢測證實了其中有II型膠原mRNA表達。
可用于本發(fā)明的組織工程化軟骨的材料是醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細胞基質(zhì)；(c)上述材料的混合物或復(fù)合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料。
優(yōu)選的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是可注射性的材料，例如藻酸鈣凝膠、聚環(huán)氧乙烷等。
本發(fā)明組織工程化軟骨中的軟骨細胞濃度通常約為1×106/ml至1×108/ml或更高。當(dāng)材料為可注射性材料時，以該液體材料調(diào)整軟骨細胞濃度；當(dāng)材料為固體性材料時，以培養(yǎng)液調(diào)整軟骨細胞濃度，然后與固體性材料混合，其中混合時培養(yǎng)液與固體性材料的比例沒有特別限制，但是以該固體材料能夠吸附的培養(yǎng)液最大量為準(zhǔn)。
在本發(fā)明的組織工程化軟骨移植物中，還可添加或復(fù)合其他各種細胞、生長因子、各種轉(zhuǎn)基因成分，從而保持軟骨細胞表型、促進軟骨細胞生長或基質(zhì)合成能力等，或者促進組織生長、血管、神經(jīng)長入等。
本發(fā)明的組織工程化軟骨的制備方法簡便，將一定數(shù)量的所述軟骨細胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合即可。
用本發(fā)明方法形成的組織工程化軟骨，分為兩類，一類是軟骨細胞與可注射性生物材料構(gòu)成的復(fù)合物，該復(fù)合物可直接注射到皮下、軟骨缺損處等體內(nèi)各部位。另一類是軟骨細胞與非可注射性復(fù)合物，該復(fù)合物可直接植入體內(nèi)皮下、軟骨缺損處等體內(nèi)各部位。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)解決了軟骨組織工程化構(gòu)建種子細胞來源不足的問題，流產(chǎn)的胚胎可提供大量的軟骨細胞來源；(2)胚胎軟骨細胞較成年軟骨細胞活力旺盛，基質(zhì)分泌能力強，軟骨組織形成速度快；(3)該細胞生物材料復(fù)合物可在適宜條件下保存，為臨床修復(fù)軟骨組織缺損提供“現(xiàn)貨供應(yīng)”的組織工程化軟骨。省卻病人自體軟骨細胞培養(yǎng)所需的較長的等待時間。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人胚胎軟骨細胞的分離培養(yǎng)自然流產(chǎn)的人胎兒，5月胎齡左右；產(chǎn)下10小時內(nèi)。無菌操作分離關(guān)節(jié)軟骨將收獲的軟骨塊切成約2mm×2mm大小的碎片，置于15ml離心管中，PBS沖洗2次，按1g軟骨組織加入15mg II型膠原酶的比例混合，并用無血清F-12培養(yǎng)基將II型膠原酶濃度調(diào)整至1mg/ml。37℃恒溫振蕩器內(nèi)消化16h后，以150目不銹鋼網(wǎng)過濾，1500r/min離心，去上清，PBS洗2次，F(xiàn)-12條件培養(yǎng)基重懸軟骨細胞，臺盼藍染色，顯微鏡下計數(shù)，細胞活力＞85％的可用于組織構(gòu)建。
從流產(chǎn)的胎兒關(guān)節(jié)軟骨中分離軟骨細胞的得率是2×107-4×107個/克人胎兒關(guān)節(jié)軟骨，活力為90％。五月胎齡的胎兒可得關(guān)節(jié)軟骨重量平均為5g。
實施例2人胚胎軟骨細胞體外增殖規(guī)律每代細胞經(jīng)培養(yǎng)擴展后得到的細胞數(shù)，除以培養(yǎng)前接種的細胞數(shù)就是該代次細胞的增殖率；根據(jù)不同代次細胞的增殖率繪出增殖率曲線。假設(shè)原代細胞數(shù)為1，根據(jù)前述計算得出的增殖率，推算經(jīng)擴展每一代次可得到的細胞數(shù)，據(jù)此再繪出細胞的增殖曲線。
結(jié)果如圖1和圖2所示，人胎兒軟骨細胞在體外單層傳代培養(yǎng)時，原代幾乎不增殖，第一代開始增殖，第二、三代時增殖率最大；連續(xù)傳代至第六代喪失增殖能力。
實施例3人胚胎軟骨細胞體外培養(yǎng)基質(zhì)合成規(guī)律免疫組織化學(xué)檢測含培養(yǎng)單層軟骨細胞的蓋玻片置PBS漂洗，按DAKO EnVisionTM+System，Peroxidase(DAB)試劑盒(DAKO，Carpinteria，CA)提供的操作程序進行I、II、III型膠原的免疫組織化學(xué)檢測。(一抗為來自O(shè)ncogeneTM公司的鼠抗人I型膠原、II型膠原、III型膠原的單克隆Ig G)。用成纖維細胞作II型膠原的陰性對，作I型膠原、III型膠原的陽性對照，并設(shè)空白對照。
原位雜交接種在蓋玻片上的軟骨細胞用3％多聚甲醛固定。用地高辛標(biāo)記的DNA試劑盒，分別作I、II、III型膠原mRNA的原位雜交檢測。用成纖維細胞作對照，并設(shè)空白對照。免疫組化、原位雜交結(jié)果顯示，原代、第一代、第二代軟骨細胞只表達II型膠原；至第三代開始出現(xiàn)I、III型膠原的表達，II型膠原漸減少；到第六代II型膠原的表達消失。
實施例4軟骨細胞-生物材料復(fù)合物的制備將原代、第一代、第二代、第三代、第四代、第五代、第六代的細胞懸液分別離心(1500r/min)，傾去上清，將細胞沉淀與可注射性生物材料Pluronic F-127(一種市售的聚環(huán)氧乙烯商品)在4℃下充分混合，濃度為5×107個細胞/ml，制成細胞-聚環(huán)氧乙烯復(fù)合物。用2ml注射器吸取復(fù)合物備用。
實施例5組織工程化軟骨構(gòu)建逐次取每代人胎兒軟骨細胞和30％Pluronic-F127混勻，使細胞終濃度為5×107/ml，無菌條件下，將軟骨細胞-Pluronic-F127復(fù)合物注入裸鼠背部皮下，每點0.5ml。六周后取材。
結(jié)果如圖3和圖4所示。以胎兒軟骨細胞為種子細胞來源，裸鼠體內(nèi)構(gòu)建的組織工程化軟骨，不僅在大體觀上與正常軟骨相似，而且HE染色也表明組織工程化軟骨組織學(xué)觀察與正常軟骨組織結(jié)構(gòu)接近。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種組織工程化軟骨移植物，其特征在于，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；(b)軟骨細胞，所述的軟骨細胞為體外培養(yǎng)原代至第六代的胚胎軟骨細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的軟骨細胞是同種異體的。
3.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物為液態(tài)，且軟骨細胞的含量為1×106個細胞/ml-1×108個細胞/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物為固態(tài)，且軟骨細胞的含量為1×106個細胞/ml-1×108個細胞/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的軟骨細胞表達II型膠原。
6.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述軟骨細胞來源于3-10月齡自然流產(chǎn)人胎兒的軟骨。
7.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠、脫細胞基質(zhì)，及其混合物。
8.一種制備組織工程化軟骨移植物的方法，其特征在于，包括步驟將軟骨細胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，形成移植物，其中所述的軟骨細胞為體外培養(yǎng)原代至第六代的軟骨細胞。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，移植物中軟骨細胞的含量為1×106個細胞/ml-1×108個細胞/ml。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠、脫細胞基質(zhì)，及其混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同種異體組織工程化軟骨移植物，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；(b)軟骨細胞，所述的軟骨細胞為體外培養(yǎng)原代至第六代的軟骨細胞。本發(fā)明的同種異體組織工程化軟骨可有效地治療軟骨病損。本發(fā)明還提供了該組織工程化軟骨的制備方法和用途。
文檔編號C12N5/08GK1476903SQ02136560
公開日2004年2月25日 申請日期2002年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月19日
發(fā)明者曹誼林, 劉偉, 崔磊 申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院