專(zhuān)利名稱(chēng)：用于生產(chǎn)慢病毒載體的人重組單純皰疹病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。具體涉及一組主要用于制備慢病毒載體的重組人1型單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus type 1，HSV1)“重組HSV1-Lenti-helper病毒”的構(gòu)建及其用途。
背景技術(shù)：
有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retroviral vector)在基因治療和基因轉(zhuǎn)移領(lǐng)域有非常廣闊應(yīng)用，它可以將外援基因?qū)氚ㄊ箢?lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)及人在內(nèi)的體細(xì)胞中，并整合到細(xì)胞基因組中，達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的目的，使其在包括遺傳病治療、移植、干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多領(lǐng)域的應(yīng)用都有非常好的前景。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，其生活史中有DNA中間體。逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒包含2條完全相同的RNA分子，病毒核心蛋白中含有與復(fù)制相關(guān)的酶類(lèi)，核心外包裹病毒的包膜，其上有來(lái)自宿主細(xì)胞膜和病毒編碼的糖蛋白。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞的過(guò)程如下病毒顆粒通過(guò)其包膜上的糖蛋白與細(xì)胞膜上的受體作用，兩者發(fā)生膜融合，病毒核心顆粒通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞漿，病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，后者被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核，在核內(nèi)病毒DNA永久整合至染色體中(稱(chēng)為原病毒provirus)，成為宿主DNA的一部分，并隨宿主細(xì)胞復(fù)制和分裂。Proviral DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，并轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿，并在此處翻譯成病毒蛋白前體，后者隨后被分別切割成病毒結(jié)構(gòu)蛋白和復(fù)制酶蛋白，與病毒RNA組裝成病毒核衣殼，在細(xì)胞膜處裝上包膜。經(jīng)過(guò)對(duì)前體核衣殼蛋白的進(jìn)一步處理最終得到成熟的、有感染性的子代病毒顆粒。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要有兩種致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。
致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體早期的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來(lái)源于禽類(lèi)或鼠的致瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒(oncogenicretroviruses)，這些病毒有著相似的基因組結(jié)構(gòu)，在它們的自然宿主中都能引起轉(zhuǎn)化。其代表病毒是鼠白血病病毒(MLV)。所有的逆轉(zhuǎn)錄病毒都有以下三種基因gag、pol和env。在受感染的細(xì)胞內(nèi)，provirus基因組在5’LTR(長(zhǎng)末端重復(fù)序列，long terminal repeat)啟動(dòng)子和3’LTR的終止子和polyA的作用下，轉(zhuǎn)錄出單鏈前體mRNA。gag編碼病毒核心蛋白(core protein)，pol編碼病毒復(fù)制酶類(lèi)。以上兩個(gè)基因最初是以Gag-Pol融合蛋白形式表達(dá)的，病毒的蛋白酶將Gag-Pol前體切開(kāi)，并進(jìn)一步加工。Pol蛋白成為各種蛋白酶(用于將病毒前體蛋白切割成成熟形式)、逆轉(zhuǎn)錄酶(用于復(fù)制病毒核酸)和整合酶(將病毒基因組整合進(jìn)染色體DNA)。Gag蛋白被進(jìn)一步切割成病毒核心組分基質(zhì)(matrix)、衣殼(capsid)和核衣殼(nucleocapsid)蛋白(在所有逆轉(zhuǎn)錄病毒中都相同)以及各種病毒特有的核心蛋白。env編碼病毒包膜糖蛋白，后者被細(xì)胞中蛋白酶切割成外膜蛋白和穿膜蛋白。包膜上糖蛋白與細(xì)胞表面受體的特異性，決定了病毒的細(xì)胞親嗜性。
由于逆轉(zhuǎn)錄病毒能永久性地將自身基因組整合到受其感染的細(xì)胞的染色體中，從而使被其轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在受感染的細(xì)胞及其子代中穩(wěn)定存在和表達(dá)。因此致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒被廣泛研究，用來(lái)作為基因轉(zhuǎn)移載體和基因治療研究中。其中MLV載體是其中應(yīng)用最多和最廣的。MLV是鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒，某些MLV病毒株，比如雙嗜性群(amphotropic group)的包膜糖蛋白可以介導(dǎo)MLV進(jìn)入人體細(xì)胞。
通常作為載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒都是復(fù)制缺陷型的，它們可以感染并將外源基因整合到靶細(xì)胞中，但病毒無(wú)法復(fù)制和傳播到其它細(xì)胞中。這是因?yàn)檩d體基因組中無(wú)病毒基因，只剩下一些單輪復(fù)制所必需的順式元件。載體基因組中被保留的順式元件有與RNA逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)的順式元件(如LTR)、與病毒DNA整合相關(guān)的順式元件(如att site)、與provirus的轉(zhuǎn)錄相關(guān)的順式元件(LTR)以及病毒RNA包裝相關(guān)的位點(diǎn)(ψ，psi)等順式元件。
包含以上順式元件的質(zhì)粒在細(xì)胞中可以擴(kuò)增，在反式提供gag、pol和env基因的條件下，該質(zhì)?？梢宰鳛榛蜣D(zhuǎn)移載體。上述反式元件可以由野生型病毒DNA提供，其結(jié)果是在得到病毒載體的同時(shí)，得到有感染和復(fù)制能力的野生型病毒，這在臨床上是無(wú)法接受的。
隨后出現(xiàn)了不使用野生型病毒的構(gòu)建方式。即將野生型病毒DNA中擴(kuò)增所需的所有順式元件去除，再與載體DNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，由于構(gòu)建體只表達(dá)病毒蛋白，但不含復(fù)制所需的順式元件，因此不產(chǎn)生輔助病毒。用這種方法得到的載體感染正常細(xì)胞，由于細(xì)胞不表達(dá)病毒蛋白，所以載體不再擴(kuò)增。這種方法得到的載體滴度較低。
第三種改進(jìn)的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法是運(yùn)用包裝細(xì)胞株。后者表達(dá)載體擴(kuò)增所需的病毒蛋白。這種方法大大提高了載體的包裝效率。通常的做法是將病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因和復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中，并使其穩(wěn)定表達(dá)或可誘導(dǎo)表達(dá)。將載體基因組轉(zhuǎn)染到該細(xì)胞中，就能產(chǎn)生載體病毒。這種方法同樣不產(chǎn)生輔助病毒，載體在非包裝細(xì)胞株上也不會(huì)復(fù)制和擴(kuò)增。與上一種方法相比，該方法的優(yōu)點(diǎn)有二第一，產(chǎn)生病毒載體的過(guò)程更簡(jiǎn)單而有效，產(chǎn)生的載體滴度高于共轉(zhuǎn)染法。第二，減少了載體質(zhì)粒與反式蛋白基因間發(fā)生重組的幾率，因此更安全。
慢病毒載體慢病毒(lentivirus)基因組比致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒更復(fù)雜一些，從而導(dǎo)致其復(fù)制過(guò)程也更復(fù)雜。HIV-1載體是目前研究得最充分的慢病毒載體。其基因組基本組成與致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣，包括gag，pol和env。但HIV-1還含有另外一些輔助基因，包括vif，vpr，tat，rev，vpu，nef和vpx等。其中某些在病毒復(fù)制過(guò)程中起著重要作用。比如，Tat和Rev蛋白是病毒基因高效表達(dá)所必需的。Tat激活HIV-1的LTR中的啟動(dòng)子功能，提高病毒RNA的轉(zhuǎn)錄效率。Rev與病毒基因組RNA上的RRE(Rev-responsive element)區(qū)域相互作用，促進(jìn)病毒RNA從胞核向胞漿的轉(zhuǎn)移。
慢病毒載體與致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，取得的最大進(jìn)展是它可以感染非分裂細(xì)胞和終末分化的細(xì)胞。致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體雖然也能感染非分裂細(xì)胞，但病毒基因組被核膜阻擋在細(xì)胞核之外，只有細(xì)胞分裂時(shí)，核膜的完整性被打破，載體基因組才能進(jìn)入核內(nèi)。因此致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的RNA的反轉(zhuǎn)錄和整合只有在分裂細(xì)胞中才能得以完成。雖然慢病毒感染非分裂細(xì)胞的準(zhǔn)確機(jī)制還不清楚，但目前看來(lái)HIV能感染非分裂細(xì)胞得益于以下幾種病毒蛋白整合酶蛋白、基質(zhì)蛋白以及輔助蛋白Vpr等。整合酶和基質(zhì)蛋白含有核定位信號(hào)，Vpr可能與核孔復(fù)合物直接結(jié)合。
慢病毒載體在許多需要以非分裂細(xì)胞作為靶細(xì)胞的基因治療(包括極少分裂的造血干細(xì)胞、終末分化的神經(jīng)細(xì)胞甚至腫瘤細(xì)胞等)方案中具有優(yōu)勢(shì)，將可能成為首選。由于慢病毒可以感染非分裂細(xì)胞，(某些細(xì)胞類(lèi)型中，需要細(xì)胞處于G0期到G1b期)，慢病毒載體的臨床研究前景是非常誘人的。但是，由于慢病毒基因組和復(fù)制的復(fù)雜性，導(dǎo)致載體和包裝細(xì)胞株的研究進(jìn)展比致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒更困難。致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞只要提供Gag、Pol和Env蛋白就可以，而HIV載體還需要提供Tat和Rev蛋白，而且其它輔助基因的功能還不清楚，而且要產(chǎn)生穩(wěn)定的包裝細(xì)胞系也有很大難度，分析原因可能與HIV某些蛋白的毒性有關(guān)。
由于存在上述困難，最初的HIV載體的包裝系統(tǒng)簡(jiǎn)單地采用含HIV-1病毒的核心蛋白、酶、輔助基因以及VSV-G基因等的質(zhì)粒。VSV的G蛋白(VSV-G)等可以擴(kuò)大慢病毒載體的可感染細(xì)胞的類(lèi)型。而且用VSV-G還可以得到滴度更高、穩(wěn)定性更好的慢病毒載體。
第二代慢病毒載體包裝質(zhì)粒成分減少到只有HIV-1的gag、pol、tat、rev和VSV-G，載體質(zhì)粒只含有HIV-1轉(zhuǎn)錄、包裝、反轉(zhuǎn)錄和整合相關(guān)的順式元件。載體質(zhì)粒所包括的基因元件的順序從5’至3’依次是HIV-15’LTR、前導(dǎo)序列、5’SD位點(diǎn)(splice donor site)、360bp gag基因部分、700bp env(含RRE和SA位點(diǎn)splice acceptor site)、內(nèi)部啟動(dòng)子(CMV的IE增強(qiáng)子/啟動(dòng)子或PGK(phosphoglycerokinase)啟動(dòng)子)、外源基因和HIV-1的3’LTR。重組慢病毒載體的生產(chǎn)方式是將攜帶了各種必需元件的三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。該慢病毒載體只在有Tat和Rev蛋白的條件下，才能激活LTR的轉(zhuǎn)錄活性和未切割的基因組RNA在胞漿中的聚集。
第三代慢病毒載體是在第二代的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步刪除了一些病毒序列，使包裝質(zhì)粒成分進(jìn)一步減少到只有g(shù)ag、pol、rev和VSV-G。比如，5’LTR的U3被RSV(Rous肉瘤病毒)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子代替，使病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄不受Tat蛋白的限制，Tat基因及其作用位點(diǎn)被分別從包裝質(zhì)粒和載體質(zhì)粒中刪除；另外，3’LTR中的U3區(qū)也被完全刪除，而后者是LTR轉(zhuǎn)錄的模板，U3區(qū)的缺失導(dǎo)致載體基因組感染細(xì)胞后，不會(huì)產(chǎn)生新的子代病毒，成為“自滅活載體”(self-inactivating vector，SIN)，安全性得到了進(jìn)一步保障。
慢病毒載體目前還只用于HIV復(fù)制機(jī)制和對(duì)慢病毒載體系統(tǒng)的研究等方面，在基因治療臨床應(yīng)用上仍落后于致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。其中主要原因有二一是人們對(duì)HIV載體安全性的關(guān)注和擔(dān)心遠(yuǎn)大于對(duì)致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒的，前者含有的某些順式元件，比如RRE序列，在載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒上都存在，因此存在重組出野生型病毒的可能。另外，HIV的包裝信號(hào)延伸到了gag基因中，因此HIV載體中包含部分gag基因序列，同樣有可能導(dǎo)致載體與輔助質(zhì)粒的同源重組；另一個(gè)限制因素是VSV-G對(duì)細(xì)胞有毒性，因此難以構(gòu)建HIV載體包裝細(xì)胞株。有專(zhuān)利(US PATENT 6218181)用可調(diào)控啟動(dòng)子，如四環(huán)素啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)VSV-G的表達(dá)，從而構(gòu)建出HIV載體包裝細(xì)胞株，再用轉(zhuǎn)染的方式將載體質(zhì)粒導(dǎo)入該細(xì)胞株中，生產(chǎn)出HIV載體。但目前通用的方法仍是多個(gè)(2～4個(gè))質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，因此載體滴度低，而且能產(chǎn)生重組的可復(fù)制型載體。
人1型單純皰疹病毒人1型單純皰疹病毒HSV1基因組的全長(zhǎng)152kb，共72個(gè)基因，其中約1/3是非必需基因，即這些基因缺失或失活不影響HSV1載體細(xì)胞中的感染和繁殖。HSV1基因組中插入15kb以下的外源基因，不影響其基因組的包裝和病毒的感染性。另外，HSV1對(duì)大部分動(dòng)物或人的細(xì)胞都有較高水平的感染，其攜帶的外源基因能在這些細(xì)胞中以較高水平表達(dá)。因此，HSV1成為用來(lái)攜帶外源基因到細(xì)胞中比較理想的載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了一種重組人1型單純皰疹病毒(Herpes Simplex VirusType 1，HSV1)“重組HSV1-Lenti-helper病毒”，它的基因組中插入了慢病毒載體包裝所需的各種反式蛋白的表達(dá)盒(gag、pol、VSV-G、Rev等)。用該重組HSV病毒感染載體細(xì)胞株，能高水品表達(dá)gag，pol，VSV-G，Rev等蛋白，從而將載體細(xì)胞株染色體中以provirus形式存在的慢病毒載體基因組拯救出來(lái)，包裝出慢病毒載體。用親和層析、離子吸附層析或超離等方法，可以將慢病毒載體與HSV分離，達(dá)到純化的目的。本方法的特點(diǎn)是用病毒感染的方式代替質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方式生產(chǎn)慢病毒載體，載體滴度高，成本低，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。
在本發(fā)明中，插入到HSV1基因組的外源DNA片段包括(1)gag/pol為逆轉(zhuǎn)錄病毒、特別是人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的病毒核心蛋白/復(fù)制及整合酶的編碼基因。gag/pol基因上游的啟動(dòng)子是真核強(qiáng)啟動(dòng)子，比如含人beta-globin intron增強(qiáng)子的人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子等。gag/pol基因下游是HIV-1的Rev效應(yīng)元件(RRE)，RRE在Rev的作用下，表達(dá)Gag和Pol蛋白。RRE下游是真核轉(zhuǎn)錄終止和加尾信號(hào)，比如人beta-globin polyA。gag/pol的DNA片段組成的示意圖參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖中的圖1。gag/pol的核苷酸序列參見(jiàn)附加文件之核苷酸或氨基酸序列表的軟盤(pán)中之文件(文件名稱(chēng)gag-pol.prj)。
(2)Rev為逆轉(zhuǎn)錄病毒、特別是人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的調(diào)控蛋白的編碼基因。其上游是真核強(qiáng)啟動(dòng)子，比如Rous肉瘤病毒RSV的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子。Rev基因下游是真核轉(zhuǎn)錄終止和加尾信號(hào)，比如HIV-1的LTR的polyA。Rev的DNA片段組成的示意圖參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖中的圖2。Rev的核苷酸序列參見(jiàn)附加文件之核苷酸或氨基酸序列表的軟盤(pán)中之文件(文件名稱(chēng)rev.prj)。
(3)非HIV-1的包膜蛋白包括、但不局限于以下病毒的包膜蛋白的編碼基因Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人水泡口炎病毒的G蛋白(VSV-G)等?；蛏嫌蔚膯?dòng)子是真核強(qiáng)啟動(dòng)子，比如含人beta-globin intron增強(qiáng)子的人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子。下游是真核轉(zhuǎn)錄終止和加尾信號(hào)，比如人beta-globin polyA。非HIV-1的包膜蛋白的DNA片段組成的示意圖參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖中的圖3。vsv的核苷酸序列參見(jiàn)附加文件之核苷酸或氨基酸序列表的軟盤(pán)中之文件(文件名稱(chēng)vsv.prj)。
上述(1)、(2)、(3)中的三種DNA片段分別通過(guò)酶切插入或同源臂重組等方法插入或取代HSV1的非必需基因區(qū)。
上述(1)、(2)、(3)中的三種DNA片段可以分別插入三株單純皰疹病毒基因組中，也可以將(1)、(2)、(3)插入同一株單純皰疹病毒基因組中，或是(1)、(3)插入同一株單純皰疹病毒基因組中，(2)插入另一株單純皰疹病毒基因組中。
所謂“酶切插入”方法是指利用一套粘粒系統(tǒng)SetC，通過(guò)酶切、連接、共轉(zhuǎn)染的方法重組出含上述(1)、(2)、(3)三種DNA片段的重組單純皰疹病毒。
Set C粘粒按HSV1病毒全基因順序由依次分載了HSV1病毒(17株)全基因組的5個(gè)粘粒組成cos6、cos28、cos14、cos56、cos48。為Davision AJ贈(zèng)送(Conningham C，Davision AJ.Virology，1993，197116-124)。(cos6，cos14cos28，cos48，cos56的序列分別見(jiàn)Seq6、Seq7、Seq8、Seq9、Seq10)。該套粘粒中，從cos6開(kāi)始，按順序至cos28、cos14、cos56，最后到cos48，其中所裝載的HSV1病毒基因組的各片段的3’末端與裝載于下一粘粒中的HSV1片段的5’末端序列重復(fù)，即cos6中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的3’末端與cos28中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的5’末端序列重復(fù)，cos28中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的3’末端與cos14中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的5’末端序列重復(fù)，依次類(lèi)推，cos14中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的3’末端與cos56中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的5’末端序列重復(fù)，cos56中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的3’末端與cos48中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的5’末端序列重復(fù)，cos48中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的3’末端與cos6中所裝載的HSV1病毒基因組的片段的5’末端序列重復(fù)。這是5個(gè)HSV1基因組片段在細(xì)胞中發(fā)生同源重組從而產(chǎn)生重組HSV1的基礎(chǔ)。SetC粘粒圖譜的示意圖參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖中的圖4。
在SetC中的cos6上的HSV1的非必需基因UL2和cos56上的HSV1的非必需基因UL44中各有一個(gè)XbaI單切點(diǎn)，cos28上的HSV1的非必需基因TK中有一個(gè)NsiI單切點(diǎn)。這三個(gè)單酶切位點(diǎn)被用于將外源基因插入其中，并通過(guò)將5個(gè)粘粒共轉(zhuǎn)染至HSV1敏感的真核細(xì)胞(如BHK-21)，通過(guò)5個(gè)HSV1基因組片段的重組產(chǎn)生插入了外源基因的重組HSV1病毒，本重組HSV1病毒被命名為“重組HSV1-Lenti-helper病毒”。
上述(1)、(2)、(3)中的三種DNA片段可以分別插入cos6的UL2的XbaI單切點(diǎn)、cos56的UL44的XbaI單切點(diǎn)或cos28的TK的NsiI單切點(diǎn)中，位置不限。
所謂“同源臂重組方法”是指分別在要插入(1)、(2)、(3)三種DNA片段的HSV1非必需基因的上、下游各找一段序列，長(zhǎng)約100～2000bp，用DNA合成或PCR方法將其調(diào)出，分別放在(1)、(2)、(3)三種DNA片段的兩端，將這樣構(gòu)建好的DNA構(gòu)建體與HSV1病毒或含相應(yīng)非必需基因的SetC粘粒共同導(dǎo)入對(duì)HSV1敏感的真核細(xì)胞(如BHK-21)中，篩選出含有(1)、(2)、(3)三種DNA片段的HSV1重組病毒，或篩選出含有(1)、(2)、(3)三種DNA片段的粘粒，與SetC的其它幾種粘粒共轉(zhuǎn)染對(duì)HSV1敏感的真核細(xì)胞(如BHK-21)，同樣將得到含有(1)、(2)、(3)三種DNA片段的HSV1重組病毒“重組HSV1-Lenti-helper病毒”。
上述(1)、(2)、(3)中的三種DNA片段可以分別用同源重組的方法插入HSV1的任何非必需基因區(qū)，位置不限。
上述(1)、(2)中提到的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以是除HIV-1外的其它逆轉(zhuǎn)錄病毒。
用以上方法得到的重組HSV1病毒“重組HSV1-Lenti-helper病毒”可以用對(duì)HSV1敏感的真核細(xì)胞(如BHK-21)制備并進(jìn)行穩(wěn)定地長(zhǎng)期傳代，或-70℃保存。
本發(fā)明提出的重組單純皰疹病毒的用途以上方法得到的含有(1)、(2)、(3)三種DNA片段的重組HSV1病毒“重組HSV1-Lenti-helper病毒”主要用途是生產(chǎn)攜帶外源基因的慢病毒載體，特別是HIV-1載體。
具體方法是，先構(gòu)建一個(gè)載體質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有以下成分1、兩端帶有慢病毒、特別是HIV-1的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的外源基因表達(dá)盒，該外源基因的啟動(dòng)子是強(qiáng)真核啟動(dòng)子，如人巨細(xì)胞病毒CMV的IE啟動(dòng)子，外源基因下游是真核轉(zhuǎn)錄終止和加尾信號(hào)，比如SV40病毒的polyA；2、兩個(gè)LTR之間還含有慢病毒、特別是HIV-1基因組包裝和定位所需的兩個(gè)順式元件psi(包裝信號(hào))和RRE(將完整的病毒RNA基因組帶出細(xì)胞核)；3、在真核細(xì)胞中表達(dá)的抗性基因表達(dá)盒，如neor、blasticidinr、kanr等；4、使該質(zhì)粒在原核細(xì)胞，如大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)序列，如pUC ori以及抗性篩選基因，如ampr等。
將該載體質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)導(dǎo)到對(duì)HSV1敏感的真核細(xì)胞(如BHK-21)中，再在培養(yǎng)液中加入合適濃度的抗生素，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)，篩選出載體質(zhì)粒被穩(wěn)定攜帶和或整合到細(xì)胞染色體中的細(xì)胞株。
該細(xì)胞株感染含有(1)、(2)、(3)三種DNA片段的重組HSV1病毒“重組HSV1-Lenti-helper病毒”(三種DNA片段在同一重組HSV1病毒基因組上)后，表達(dá)gag/pol、VSV-G和Rev蛋白，將整合到細(xì)胞染色體中的載體DNA反轉(zhuǎn)錄成慢病毒RNA基因組，并包裝出慢病毒載體。
該細(xì)胞株以一定比例感染兩種分別含有(1)、(3)兩種DNA片段和(2)一種DNA片段的重組HSV1病毒后，表達(dá)gag/pol、VSV-G和Rev蛋白，將整合到細(xì)胞染色體中的載體DNA反轉(zhuǎn)錄成慢病毒RNA基因組，并包裝出慢病毒載體。
用本發(fā)明提出的重組單純皰疹病毒(“重組HSV1-Lenti-helper病毒”)感染載體細(xì)胞株的方法生產(chǎn)的慢病毒載體的細(xì)胞裂解液中混雜有重組單純皰疹病毒(“重組HSV1-Lenti-helper病毒”)，后者對(duì)動(dòng)物或人細(xì)胞是有細(xì)胞毒性，需要除去?？梢圆捎冕槍?duì)VSV-G蛋白的親和層析、離子吸附層析或CsCl密度梯度離心等方法將其去除。


說(shuō)明書(shū)附圖之圖1是gag/pol的DNA片段組成的結(jié)構(gòu)示意圖，它的上游(即5’端)是人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子(CMV promoter)，其后依次是beta-globin intron增強(qiáng)子、gag/pol、RRE、beta-globin polyA。說(shuō)明書(shū)附圖之圖2是Rev的DNA片段組成的結(jié)構(gòu)示意圖，它的5’端從上游至下游依次是RSV啟動(dòng)子(RSV enhancer/promoter)、Rev、HIV的LTR polyA。說(shuō)明書(shū)附圖之圖3是非HIV-1的包膜蛋白的DNA片段組成的結(jié)構(gòu)示意圖，它的5’端從上游至下游依次是人巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子(CMV promoter)、beta-globin intron增強(qiáng)子、VSV-G、beta-globin polyA。說(shuō)明書(shū)附圖之圖4是SetC的結(jié)構(gòu)示意譜，Set C粘粒按HSV1病毒全基因順序由依次分載了HSV1病毒(17株)全基因組且相鄰的粘粒首位DNA序列有部分完全相同的5個(gè)粘粒cos6、cos28、cos14、cos56、cos48組成。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的用于重組慢病毒載體生產(chǎn)的全功能輔助病毒(“重組HSV1-Lenti-helper病毒”)的制備和用途作了詳細(xì)說(shuō)明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1 cos6-VSVG的構(gòu)建將質(zhì)粒pLP/VSVG(Invitrogen)中的VSV-G表達(dá)盒(CMV啟動(dòng)子/beta-globin增強(qiáng)子+VSV-G+beta-globin polyA)用PCR的方式調(diào)出(長(zhǎng)約3770bp)，引物是上游5’TCTAGACTTGGCCCATTGCATA 3’；下游5’TCTAGAACTGCCATGTCGAGGG 3’。兩端是XbaI位點(diǎn)。反應(yīng)條件是94℃，30”；56℃，30”；72℃，4’。PCR產(chǎn)物用XbaI酶切后，裝入cos6的XbaI位點(diǎn)中，得到粘粒cos6-VSVG。
實(shí)施例2 cos56-gag/pol的構(gòu)建將質(zhì)粒pLP1(Invitrogen)中的gag/pol表達(dá)盒(CMV啟動(dòng)子/beta-globin增強(qiáng)子+gag/pol+RRE+beta-globin polyA)用PCR的方式調(diào)出(長(zhǎng)約6837bp)，引物是上游5’TCTAGATTGGCCCATTGCATAC 3’；下游5’TCTAGAACTGCCATGTCGAGGG 3’。兩端是XbaI位點(diǎn)。反應(yīng)條件是94℃，30”；56℃，30”；72℃，7’。PCR產(chǎn)物用XbaI酶切后，裝入cos56的XbaI位點(diǎn)中，得到粘粒cos56-gag/pol。
實(shí)施例3 cos6-rev的構(gòu)建將質(zhì)粒pLP2(Invitrogen)中的Rev表達(dá)盒(RSV啟動(dòng)子+Rev+HIV polyA)用PCR的方式調(diào)出(長(zhǎng)約971bp)，引物是上游5’TCTAGACAATGTAGTCTTATGC 3’；下游5’TCTAGACCAGGGTTTTCCTGAT3’。兩端是XbaI位點(diǎn)。反應(yīng)條件是94℃，30”；56℃，30”；72℃，1’。PCR產(chǎn)物用XbaI酶切后，裝入cos6的XbaI位點(diǎn)中，得到粘粒cos6-rev。
實(shí)施例4 重組單純皰疹病毒rHSV-VSVG-gag/pol的構(gòu)建將cos6-VSVG、cos56-gag/pol與cos14，cos28，cos48等5個(gè)粘粒等摩爾混合，用PacI酶切去cos骨架(不必分離去除)，用酚、酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2.5倍無(wú)水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul與10ug DNA按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)共轉(zhuǎn)染80％鋪滿(mǎn)的BHK-21細(xì)胞(約2×106)細(xì)胞，5個(gè)HSV1片段將在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組而分別產(chǎn)生rHSV-VSVG-gag/pol重組病毒。轉(zhuǎn)染24h后換用含2％FBS的1640培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)，每天換液一次。5天后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)病變，待細(xì)胞完全病變后收培養(yǎng)液上清，2000r/min離心5min，上清分裝保存于-20℃。對(duì)獲得的重組病毒進(jìn)行兩次空斑純化，可得到純一的rHSV-VSVG-gag/pol重組病毒。
實(shí)施例5 重組單純皰疹病毒rHSV-rev的構(gòu)建將cos6-rev與cos56、cos14，cos28，cos48等5個(gè)粘粒等摩爾混合，用PacI酶切去cos骨架(不必分離去除)，用酚、酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2.5倍無(wú)水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul與10ug DNA按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)共轉(zhuǎn)染80％鋪滿(mǎn)的BHK-21細(xì)胞(約2×106)細(xì)胞，5個(gè)HSV1片段將在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組而分別產(chǎn)生rHSV-rev重組病毒。轉(zhuǎn)染24h后換用含2％FBS的1640培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)，每天換液一次。5天后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)病變，待細(xì)胞完全病變后收培養(yǎng)液上清，2000r/min離心5min，上清分裝保存于-20℃。對(duì)獲得的重組病毒進(jìn)行兩次空斑純化，可得到純一的rHSV-rev重組病毒。
實(shí)施例6 攜帶報(bào)告基因EGFP的載體質(zhì)粒pLenti-EGFP的構(gòu)建用PCR的方法將pEGFP(Gibco)中的EGFP基因調(diào)出(長(zhǎng)度約730bp)，引物是上游5’cacc atg gtg agc aag ggc gag 3’；下游5’gaattc cct cta gag tcg cgg ccg ctt t 3’。PCR反應(yīng)條件94℃，30”；56℃，30”；72℃，1’。再通過(guò)TOPO酶定向插入慢病毒載體質(zhì)粒pLenti6/D-TOPO(Invitrogen)中，得到重組載體質(zhì)粒pLenti-EGFP。
實(shí)施例7 穩(wěn)定整合載體質(zhì)粒pLenti-EGFP的載體細(xì)胞株的構(gòu)建將載體質(zhì)粒pLenti-EGFP用lipofactamine(GIBCO BRL)轉(zhuǎn)染至80％鋪滿(mǎn)的BHK-21細(xì)胞(約2×106)細(xì)胞。24h后，在培養(yǎng)液(1640)中加入終濃度為50μg/ml的抗生素“Blasticdin”，約10d后，挑選出單細(xì)胞克隆，分別在熒光顯微鏡下觀察，挑選出GFP表達(dá)較高的細(xì)胞株。成為穩(wěn)定整合載體質(zhì)粒pLenti-EGFP的載體細(xì)胞株。
實(shí)施例8 慢病毒載體Lenti-EGFP的產(chǎn)生用實(shí)施例4產(chǎn)生的rHSV-VSVG-gag/pol和實(shí)施例5產(chǎn)生的rHSV-rev兩個(gè)重組單純皰疹病毒按一定滴度比例(比如10∶1)感染上述載體細(xì)胞株pLenti-EGFP(MOI＝1)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3d，至細(xì)胞病變完全。反復(fù)凍融3次后，離心得到上清，即是混有重組單純皰疹病毒的慢病毒載體Lenti-EGFP。
實(shí)施例9 慢病毒載體Lenti-EGFP的純化上述混有重組單純皰疹病毒的慢病毒載體Lenti-EGFP的上清加到含有VSV-G單克隆抗體的親和層析柱中，通過(guò)提高鹽離子濃度的梯度洗脫方式，將慢病毒載體Lenti-GFP洗脫下來(lái)，得到純化了的慢病毒載體Lenti-EGFP。
實(shí)施例10 慢病毒載體Lenti-EGFP的滴度測(cè)定將用PBS進(jìn)行10倍比稀釋的慢病毒載體Lenti-EGFP分別感染80％鋪滿(mǎn)的BHK-21細(xì)胞，24h后，在培養(yǎng)液(10％FBS 1640)中加入終濃度為50μg/ml的抗生素“Blasticdin”，約10d后，分別在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)，即得到慢病毒載體Lenti-EGFP的滴度。
權(quán)利要求
1.一組重組人1型單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus type 1，HSV1)，命名為“重組HSV1-Lenti-helper病毒”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，重組HSV1-Lenti-helper病毒是用于制備慢病毒載體的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，重組HSV1-Lenti-helper病毒的基因組中插入了慢病毒載體包裝所需的各種反式蛋白的表達(dá)盒g(shù)ag、pol、VSV-G、Rev等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，用重組HSV1-Lenti-helper病毒感染載體細(xì)胞株，能高水品表達(dá)gag、pol、VSV-G、Rev等蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4，所表達(dá)的gag、pol、VSV-G、Rev等蛋白能將載體細(xì)胞株染色體中以provirus形式存在的慢病毒載體基因組拯救出來(lái)，包裝出慢病毒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，重組HSV1-Lenti-helper病毒的獲得是在一套Set C粘粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行操作完成的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，用人1型單純皰疹病毒HSV-1攜帶慢病毒的各種基因元件。
全文摘要
本發(fā)明描述的是一種重組人1型單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus Type，HSV1)“重組HSV1－Lenti－h(huán)elper病毒”，它的基因組中插入了慢病毒載體包裝所需的各種反式蛋白的表達(dá)盒(gag，pol，VSV－G，Rev等)。用該重組HSV病毒感染載體細(xì)胞株，能高水品表達(dá)gag，pol，VSV－G，Rev等蛋白，從而將載體細(xì)胞株染色體中以provirus形式存在的慢病毒載體基因組拯救出來(lái)，包裝出慢病毒載體。用親和層析、離子吸附層析或超離等方法，可以將慢病毒載體與HSV分離，達(dá)到純化的目的。本方法的特點(diǎn)是用病毒感染的方式代替質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方式生產(chǎn)慢病毒載體，載體滴度高，成本低，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/867GK1482239SQ02130619
公開(kāi)日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2002年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月10日
發(fā)明者吳小兵, 董小巖, 曹暉, 侯云德 申請(qǐng)人:本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有限公司