專利名稱：水稻dreb類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及水稻DREB類耐寒和耐旱轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在生長過程中會受到諸多環(huán)境因素的影響，冷害和干旱會導(dǎo)致農(nóng)作物的大規(guī)模減產(chǎn)。培育耐逆性的作物品種一直是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究的主要目標(biāo)之一。生物體能感受細(xì)胞外環(huán)境條件的變化并通過多種途徑將其傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而對外界的變化做出相應(yīng)的反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子作為一種調(diào)控基因，當(dāng)生物體感受逆境脅迫時，能調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)生物體對逆境的耐受力，達(dá)到抵抗不良環(huán)境條件脅迫的效果。在植物中，AP2/EREBP家族中的DREB類轉(zhuǎn)錄因子能夠接受環(huán)境脅迫信號并且啟動逆境應(yīng)答基因的表達(dá)。
水稻(Oryza Sativa)是最重要的糧食作物之一，培育耐寒，耐旱的品種對提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有較強(qiáng)抗逆特性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，該轉(zhuǎn)錄因子在植物抗寒和抗旱反應(yīng)中具有調(diào)控作用。
本發(fā)明所提供的抗逆轉(zhuǎn)錄因子來源于水稻，名稱為OsDREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由281個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域序列為自氮端到碳端第82-138位氨基酸殘基。
抗逆轉(zhuǎn)錄因子OsDREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1169個堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第91到第936位堿基，其表達(dá)主要受低溫和干旱的誘導(dǎo)。
本發(fā)明所提供的類轉(zhuǎn)錄因子OsDREB具有與DRE順式作用元件結(jié)合的能力，并能激活下游基因的表達(dá)。其編碼基因都含有保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域序列。
用本發(fā)明所提供的編碼轉(zhuǎn)錄因子OsDREB的基因，使用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體(這些植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體以及用于單子葉植物微彈轟擊的載體)轉(zhuǎn)化植株，可獲得對低溫和干旱脅迫耐受力得到增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。載體還可包括3’非翻譯區(qū)域，包含聚腺苷酸信號和任何其它的可效應(yīng)mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。聚腺苷酸信號引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。3’區(qū)域的例子有農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)等。本發(fā)明的OsDREB基因的3’非翻譯區(qū)域可被用于在植物中表達(dá)。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。這些啟動子很多，如花椰菜花葉病毒(CAMV 35S)和Ubiqutin啟動子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時，也可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的翻譯。翻譯控制信號和起始密碼子可以是天然或合成等多種不同來源的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，包括加入植物可選擇性標(biāo)記。使用的選擇性標(biāo)記可以是編碼對抗生素抗性酶的基因，抗生素包括慶大霉素、潮霉素、卡那霉素等。也可以是產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因，如GUS、熒光酶，還可以是抗化學(xué)試劑(例如除莠劑)的基因。當(dāng)然，也可以不用任何篩選標(biāo)記。
攜帶有本發(fā)明OsDREB基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，Now York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
可使用包括本發(fā)明的OsDREB基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物宿主(既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等)，培育抗寒和抗旱的植物品種。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為OsDREB基因轉(zhuǎn)化酵母雙報道子細(xì)胞后，在0mM 3-AT SD/-His-Ura-Trp平板和30mM 3-AT SD/-His-Ura-Trp平板上的生長情況。
圖2為OsDREB基因轉(zhuǎn)化酵母雙報道子細(xì)胞后，B-半乳糖苷酶活力的測定來檢測LacZ報道基因的表達(dá)強(qiáng)度的情況。
圖3為Southern雜交分析OsDREB基因在水稻基因組中組成的結(jié)果。
圖4為OsDREB基因在低溫、干旱誘導(dǎo)條件下表達(dá)狀態(tài)的RT-PCR檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、水稻cDNA文庫的構(gòu)建水稻(Oryza Sativa)品種旱稻502植株栽培在1/2MS固體培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中(28℃，12小時光照，12小時黑暗)培養(yǎng)10-14天，取全株于液氮中速凍、研磨，懸于TRIzole(Gibco)中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入異丙醇沉淀總RNA，溶于水中。經(jīng)mRNA純化試劑盒處理得到mRNA。取1ug mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后再合成第二鏈。雙鏈cDNA與EcoRI-NotI-BamHI接頭連接后磷酸化，經(jīng)制備離心柱(Sephacryl-400)去除多余的接頭，然后與pAD-GAL4載體連接(具體步驟詳見Stratagene HybriZAP-1.1 XR Library Construction Kit)。
實(shí)施例2、含有DRE順式作用元件的酵母雙報道子細(xì)胞的獲得將從rd29A啟動子區(qū)分離的由75bp組成的DRE順式作用元件通過HindIII酶切位點(diǎn)將其串聯(lián)成4個重復(fù)，獲得含有4個串聯(lián)重復(fù)的DRE元件的DNA片段。將所得到的DNA片段插入pHISi-1載體的PminHIS3啟動子的上游，并獲得能在缺乏組氨酸的SD培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉(zhuǎn)化體。同時將這個DNA片段構(gòu)建到pLacZi載體的PCYC1啟動子的上游，然后將載體轉(zhuǎn)化到含有pHISi-1載體的酵母轉(zhuǎn)化體中。這樣，在同時缺乏組氨酸和尿嘧啶的培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHISi-1和pLacZi載體的酵母轉(zhuǎn)化體。以同樣的方法獲得含有突變型DRE順式作用元件的酵母雙報導(dǎo)子細(xì)胞。HIS和LacZ基因作為2個報告基因，當(dāng)其上游的DRE元件被DREB轉(zhuǎn)錄因子識別后，其表達(dá)強(qiáng)度會顯著增強(qiáng)。通過3-AT(組氨酸合成酶競爭性抑制劑)來檢測HIS基因的表達(dá)強(qiáng)度，同時通過B-半乳糖苷酶活力的測定來檢測LacZ基因的表達(dá)強(qiáng)度。圖1顯示了本發(fā)明編碼DREB類轉(zhuǎn)錄因子OsDREB轉(zhuǎn)化酵母雙報導(dǎo)子細(xì)胞后在含3-AT的SD/-His-Ura-Trp平板上的生長情況。其中A表示yepGAP空載體轉(zhuǎn)化wDRE酵母雙報道子；B表示yepGAP空載體轉(zhuǎn)化mDRE酵母雙報道子；C表示OsDREB基因轉(zhuǎn)化wDRE酵母雙報道子；D表示OsDREB基因轉(zhuǎn)化mDRE酵母雙報道子。圖2是半乳糖苷酶活力檢測的結(jié)果。從圖中可以看出，當(dāng)上游為wDRE元件時，酵母轉(zhuǎn)化體半乳糖苷酶活力明顯增強(qiáng)；若其上游為mDRE順式作用元件，則其表達(dá)將無法得到增強(qiáng)。
實(shí)施例3、水稻cDNA文庫的篩選和編碼轉(zhuǎn)錄因子OsDREB基因的克隆利用含有DRE順式作用元件的酵母雙報導(dǎo)子細(xì)胞，在含30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上篩選水稻cDNA文庫，(具體操作步驟見Clontech Mathchmakerone-hybrid system)。所得到的陽性克隆在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將所插入的cDNA片段從載體上切下，構(gòu)建到Y(jié)epGAP酵母表達(dá)載體中。由于此載體上無GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，因此只有既能與DRE元件結(jié)合又能激活下游報導(dǎo)基因表達(dá)的蛋白才能在30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上生長。對于這樣的陽性克隆，將其cDNA片段再構(gòu)建到SK+載體上，經(jīng)過測序獲得了編碼轉(zhuǎn)錄因子OsDREB基因的核苷酸序列。OsDREB基因包括846bp的開放讀碼框架，編碼由281個氨基酸組成的多肽，其5’端為90bp，3’端為233bp，為序列表中的序列1。
實(shí)施例4、OsDREB基因在水稻基因組中的分析提取水稻品種旱稻502的基因組總DNA，分別用EcoRI、NotI、XbaI、XhoI 4種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。將消化后的DNA轉(zhuǎn)到N+Hybond膜上，用部分全長的OsDREB作探針，進(jìn)行Southern雜交分析。在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下洗膜(65℃，0.1×SSC，0.1％SDS)得到1-2雜交條帶，如圖3所示，圖中E代表EcoRI、N代表NotI、Xb代表XbaI、Xh代表XhoI，結(jié)果表明OsDREB基因在水稻基因組中以低拷貝形式存在。
實(shí)施例5、水稻OsDREB基因在逆境中的表達(dá)特征對在1/2MS培養(yǎng)基上生長10-14天的水稻植株，在4℃下低溫處理6小時，或在干旱條件下處理6小時，經(jīng)液氮速凍，提取RNA作RT-PCR分析。RT-PCR反應(yīng)中以水稻rRNA為對照，以控制PCR反應(yīng)中模板cDNA濃度的一致。結(jié)果如圖4所示，M為C表示樣品未經(jīng)逆境處理、L表示樣品經(jīng)低溫處理6小時、D表示樣品經(jīng)干旱處理6小時，表明OsDREB的轉(zhuǎn)錄受到低溫和干旱的誘導(dǎo)。
序列表<160> 2<210> 1<211> 1169<212> DNA<213> 水稻屬水稻(Oryza sativa L.)<220>
<221> CDS<222> (91)..(936)<223>
<400> 1cttaccgttg attgctgata gcctccttga tttttggaca aatgaaaagg attccgcttt 60tggtttgttg tttttcataa tttcaattgc atg ctg ttt cga ttt gtg tct tgc 114Met Leu Phe Arg Phe Val Ser Cys1 5aat gtt cag ctt tgt gga att att gag tta cct cat tgg gtc agg aag 162Asn Val Gln Leu Cys Gly Ile Ile Glu Leu Pro His Trp Val Arg Lys10 15 20aag aga acg cga agg aaa agc gat ggc cct gat tca atc gct gaa acc 210Lys Arg Thr Arg Arg Lys Ser Asp Gly Pro Asp Ser Ile Ala Glu Thr25 30 35 40atc aag tgg tgg aag gag caa aac cag aag ctc cag gag gag aat agc 258Ile Lys Trp Trp Lys Glu Gln Asn Gln Lys Leu Gln Glu Glu Asn Ser45 50 55tcc agg aaa gcg cca gcc aag ggg tcc aag aaa ggg tgc atg gct ggg 306Ser Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Ala Gly60 65 70aaa gga ggt ccg gaa aat tca aat tgt gct tac cgc ggt gtc agg caa 354
Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Asn Cys Ala Tyr Arg Gly Val Arg Gln75 80 85cgg aca tgg ggt aag tgg gtg gct gag atc cgt gaa cca aac cgt gga 402Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Gly90 95 100agg cgc cta tgg cta gga tca ttt cct act gcg ctg gag gct gcg cat 450Arg Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe Pro Thr Ala Leu Glu Ala Ala His105 110 115 120gca tac gat gag gcg gca agg gca atg tat ggt ccc aca gca cgt gtc 498Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Pro Thr Ala Arg Val125 130 135aat ttt gca gat aat tcc aca gat gcc aac tct ggc tgc aca tca gca 546Asn Phe Ala Asp Asn Ser Thr Asp Ala Asn Ser Gly Cys Thr Ser Ala140 145 150cct tca ttg atg atg tct aat ggg ccg gcc act ata cct tct gat gag 594Pro Ser Leu Met Met Ser Asn Gly Pro Ala Thr Ile Pro Ser Asp Glu155 160 165aag gat gag ctg gaa tct cct cct ttc atc gtg gct aat ggg cca gct 642Lys Asp Glu Leu Glu Ser Pro Pro Phe Ile Val Ala Asn Gly Pro Ala170 175 180gtg ttg tat cag cct gat aag aag gat gtg ttg gaa cgt gta gtc cct 690Val Leu Tyr Gln Pro Asp Lys Lys Asp Val Leu Glu Arg Val Val Pro185 190 195 200gag gtg cag gat gtt aaa aca gaa ggg agc aat ggc ttg aaa cgt gtt 738Glu Val Gln Asp Val Lys Thr Glu Gly Ser Asn Gly Leu Lys Arg Val205 210 215
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Gly Pro Asp Ser Ile Ala Glu Thr Ile Lys Trp Trp Lys Glu Gln Asn35 40 45Gln Lys Leu Gln Glu Glu Asn Ser Ser Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly50 55 60Ser Lys Lys Gly Cys Met Ala Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Asn65 70 75 80Cys Ala Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala85 90 95Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Gly Arg Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe100 105 110Pro Thr Ala Leu Glu Ala Ala His Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala115 120 125Met Tyr Gly Pro Thr Ala Arg Val Asn Phe Ala Asp Asn Ser Thr Asp130 135 140Ala Asn Ser Gly Cys Thr Ser Ala Pro Ser Leu Met Met Ser Asn Gly145 150 155 160Pro Ala Thr Ile Pro Ser Asp Glu Lys Asp Glu Leu Glu Ser Pro Pro165 170 175Phe Ile Val Ala Asn Gly Pro Ala Val Leu Tyr Gln Pro Asp Lys Lys180 185 190Asp Val Leu Glu Arg Val Val Pro Glu Val Gln Asp Val Lys Thr Glu195 200 205Gly Ser Asn Gly Leu Lys Arg Val Cys Gln Glu Arg Lys Asn Met Glu210 215 220Val Cys Glu Ser Glu Gly Ile Val Leu His Lys Glu Val Asn Ile Ser225 230 235 240Tyr Asp Tyr Phe Asn Val His Glu Val Val Glu Met Ile Ile Val Glu245 250 255Leu Ser Ala Asp Gln Lys Thr Glu Val His Glu Glu Tyr Gln Glu Gly260 265 270Asp Asp Gly Phe Ser Leu Phe Ser Tyr275 280
權(quán)利要求
1.水稻的DREB類轉(zhuǎn)錄因子OsDREB，它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
3.水稻DREB類轉(zhuǎn)錄因子OsDREB的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述水稻DREB類轉(zhuǎn)錄因子OsDREB的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第91到第936位堿基。
6.含有權(quán)利要求3所述基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求3所述基因的細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求3所述的基因在培育抗寒和抗旱植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，具體地說是公開了水稻DREB類耐寒和耐旱轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供水稻的DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，該轉(zhuǎn)錄因子在植物抗寒和抗旱反應(yīng)中具有調(diào)控作用。本發(fā)明提供的DREB類轉(zhuǎn)錄因子名稱為OsDREB，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。抗逆轉(zhuǎn)錄因子OsDREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的OsDREB基因在培育抗寒和抗旱植物品種中具有重要意義。
文檔編號C12N15/29GK1491960SQ02129518
公開日2004年4月28日 申請日期2002年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月29日
發(fā)明者劉強(qiáng), 陳 峰, 陳受宜, 劉 強(qiáng) 申請人:清華大學(xué), 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所