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一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法

文檔序號:478092閱讀:203來源:國知局
專利名稱:一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白及其編碼基因與應(yīng)用,特別是涉及一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
盡管目前至少已克隆了7種IL-17家族成員,但有關(guān)該家族成員的受體研究卻知之甚少。IL-17R是第一個被鑒定的IL-17受體家族成員,廣泛表達于多種不同的組織。但是,IL-17與IL-17R的親和力較弱,與IL-17具有的廣泛的生物學(xué)功能并不匹配,并且IL-17R并不含有與先前已知蛋白相似的結(jié)構(gòu)。IL-17Rh1/IL-17BR與IL-17R一樣,并不含有與先前已知蛋白相似的結(jié)構(gòu)域,但它們的胞外結(jié)構(gòu)域具有保守的胱氨酸殘基,胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有與IL-17R相似的氨基酸殘基序列,暗示它們可能具有相似的下游信號事件。研究結(jié)果表明NF-κB是它們共同介導(dǎo)的下游信號分子。
IL-17E/IL-25是一種結(jié)構(gòu)與功能相似于IL-17A的促炎癥細(xì)胞因子,主要表達于活化的TH2 T細(xì)胞。IL-17E能夠誘導(dǎo)某些細(xì)胞因子的表達,包括IL-8,IL-4,IL-5,IL-13,ICAM-1和IL-6。同時,IL-17E還能通過其低親和力受體IL-17ER/IL-17BR/IL-17Rh1介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化。IL-17E在小鼠的增強表達能誘導(dǎo)小鼠生長延緩、黃疸、多器官炎癥等疾病癥狀和一種TH2型的炎癥應(yīng)答。IL-17B和IL-17C是IL-17家族的另外兩個細(xì)胞因子,與IL-17有27%的氨基酸一致性。IL-17B信使RNA表達在前列腺、小腸、胃。IL-17B和IL-17C能夠誘導(dǎo)人急性單核白血病細(xì)胞系THP-1釋放IL-1β和TNF-α.并能與THP-1細(xì)胞有一定的結(jié)合力。最近,Hzamas等分離和克隆了一種新的IL-17相似的細(xì)胞因子,命名為IL-17D/IL-27,該細(xì)胞因子優(yōu)先表達于骨骼肌、脂肪組織和中樞神經(jīng)組織,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和GM-CSF等細(xì)胞因子,并能抑制造血功能。
曾報道,IL-17A能誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化,另外也有研究結(jié)果表明IL-17A所誘導(dǎo)的下游信號事件包括活化胞外調(diào)控激酶(ERK-1/ERK-2),氮末端激酶(JNK,c-Jun),p38有絲分裂原激酶,Raf、Stats等下游信號分子。IL-17AR的敲基因小鼠研究表明,在腫瘤壞死因子-α結(jié)合因子-6(TRAF-6)缺陷的細(xì)胞系,IL-17誘導(dǎo)的下游信號事件明顯阻斷,提示TRAF-6對于IL-17刺激的信號是必要的。由于已知的幾種IL-17受體成員的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域并不含有與Toll/IL-1R相似的結(jié)構(gòu),因此尋找和鑒定未知的IL-17家族成員的潛在受體顯得尤其必要。
一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白,它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白命名為mIL-17RLM-S,是一種單跨膜細(xì)胞因子受體,由594個氨基酸殘基組成。按照NCBI Conserved Domain Database查詢結(jié)果,預(yù)測到mIL-17RLM-S胞內(nèi)區(qū)(V214-M282)與Toll/IL-1R結(jié)構(gòu)域-TIR domain相似的氨基酸殘基序列VFLCYSNKDGQNHMNVVQCFAYFLQDFCGCEVALDLWEDFSLCREGQREWAIQKIHESQFIIVVCSKGM。TIR結(jié)構(gòu)域是IL-1R,TollR和MyD88胞內(nèi)重要的信號結(jié)構(gòu)域,這暗示mIL-17RLM-S是一個重要的新的信號受體。
采用多組織Northern Blot方法,檢測了mIL-17RLM-S的mRNA組織表達分布,結(jié)果表明mIL-17RLM-S mRNA主要在小鼠腎、肺表達,在心、腦表達微弱。
本發(fā)明的第二個目的是提供編碼小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白的基因。
一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白的編碼基因,它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列;2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有95%以上同源性,且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
本發(fā)明小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白mIL-17RLM-S的編碼基因由2134個堿基組成,位于小鼠14號染色體上,共有14個外顯子組成。
研究表明,本發(fā)明的小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白具有使Stat5因子活化、介導(dǎo)細(xì)胞增殖等作用。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例1、mIL-17RLM-S基因的克隆及表達通過蛋白BLAST NCBI小鼠EST數(shù)據(jù)庫,拼接出一個完整開放閱讀框序列(1782bpscomplete cDNA),其編碼594個氨基酸的潛在受體。根據(jù)推測的小鼠mIL-17RLM-S基因序列,設(shè)計引物,將其分子克隆。以小鼠腎總RNA為模板,通過RT-PCR擴增出與預(yù)期大小一致的DNA條帶-1800bps。將其亞克隆于pMD18 T-A克隆載體,酶切鑒定陽性克隆。測序結(jié)果表明所得到的序列由2134個堿基組成,其完整開放閱讀框編碼594個氨基酸組成的受體。
對mIL-17RLM-S在細(xì)胞器的表達定位進行研究。將mIL-17RLM-S構(gòu)建于EGFP-N1真核表達載體,將其瞬時轉(zhuǎn)染于Cos7細(xì)胞,結(jié)果顯示其主要表達在細(xì)胞膜上。為了進一步檢測mIL-17RLM-S在細(xì)胞的內(nèi)源性表達定位,進行了免疫熒光染色實驗。借助mIL-17RLM-S兔多克隆抗血清,選擇兩種腎癌細(xì)胞系786-O和GRC-1,進行免疫染色研究,以檢測mIL-17RLM-S在細(xì)胞的內(nèi)源性表達定位。結(jié)果清楚表明mIL-17RLM-S主要定位在細(xì)胞膜。
實施例2、mIL-17RLM-S胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的功能——活化Stat5和介導(dǎo)細(xì)胞增殖本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建了一系列嵌合受體,通過對mIL-17RLM-S胞內(nèi)區(qū)人工二聚化,證實了其傳遞信號的能力。
發(fā)明人將EPOR的胞外區(qū)和跨膜區(qū)與mIL-17RLM-S的胞內(nèi)區(qū)構(gòu)建一嵌合受體,借助EPO的刺激,進而檢測mIL-17RLM-S的胞內(nèi)區(qū)傳遞信號的潛力。首先進行了熒光素酶報道分析,瞬時共轉(zhuǎn)染指示的受體表達質(zhì)粒,Stat5應(yīng)答的熒光素酶報道質(zhì)粒4FTKSLN,pRL-TK載體(內(nèi)對照),轉(zhuǎn)染36小時后,使用重組EPO刺激或不刺激(PBS)約30分鐘后,收獲細(xì)胞,進行熒光素酶報道分析。結(jié)果顯示EPOR/mIL-17RLM-S嵌合受體與全長EPOR一樣,在EPO的刺激作用下,能夠介導(dǎo)Stat5的活化;并且當(dāng)共轉(zhuǎn)染Stat5的負(fù)顯性突變體(dominant mutant)-Stat5 CYF時,EPOR/mIL-17RLM-S嵌合受體介導(dǎo)Stat5的活化被明顯抑止;全長mIL-17RLM-S的過表達并不能介導(dǎo)Stat5的活化。這個結(jié)果暗示,mIL-17RLM-S的胞內(nèi)區(qū)具有能夠介導(dǎo)Stat5活化的潛力。
Stat5活化的一個重要標(biāo)志是其在Jak激酶的作用下,Stat5的酪氨酸被磷酸化,然后轉(zhuǎn)位入核,介導(dǎo)下游靶基因的表達。為了進一步檢測mIL-17RLM-S的胞內(nèi)區(qū)介導(dǎo)Stat5活化的潛力,采用免疫沉淀方法,檢測EPOR/mIL-17RLM-S是否能夠介導(dǎo)Stat5酪氨酸磷酸化。向Cos7細(xì)胞共轉(zhuǎn)染嵌合受體-EPORextm/mIL-17RLM-Sicd或全長EPOR或空載體(Mock),Jak2,stat5高純度表達質(zhì)粒。在EPO刺激前30分鐘,培養(yǎng)基中補加NaV3O4以抑制內(nèi)源性磷酸化酶的水解。使用重組EPO刺激或不刺激(PBS)約30分鐘后,收獲細(xì)胞,制備總細(xì)胞裂解液,一部分用于免疫沉淀,另一部分直接用于Western blot以檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的表達情況。結(jié)果表明EPORextm/mIL-17RLM-Sicd嵌合受體同EPOR一樣,在EPO的刺激下,能夠介導(dǎo)Stat5酪氨酸磷酸化;而在EPO未刺激組和空載體組,并未檢測到Stat5酪氨酸磷酸化。這一結(jié)果進一步表明mIL-17RLM-S的胞內(nèi)區(qū)能夠介導(dǎo)Stat5酪氨酸磷酸化。
為了進一步證實mIL-17RLM-S胞內(nèi)區(qū)具有介導(dǎo)Stat5活化的潛力,采用gel shiftassay以分析是否EPOR/mIL-17RLM-S嵌合受體能夠介導(dǎo)細(xì)胞核抽提物Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體的形成,以證實其介導(dǎo)Stat5活化。具體做法是共轉(zhuǎn)染指示的表達質(zhì)粒于Cos7細(xì)胞,在EPO的作用后,制備細(xì)胞核抽提物,進行凝膠電泳阻滯分析實驗。實驗結(jié)果顯示EPORextm/mIL-17RLM-Sicd嵌合受體同EPOR一樣,在EPO的刺激下,能夠介導(dǎo)Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體的形成;而在EPO未刺激組和空載體組,并未檢測到Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體的形成。采用冰冷的未標(biāo)記的特異性結(jié)合Stat5的DNA探針,能夠競爭性抑止Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體的形成。這一結(jié)果表明mIL-17RLM-S胞內(nèi)區(qū)具有介導(dǎo)特異性Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體形成的特性。
為了進一步確定Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體的特異性和Stat5具體成分,分別借助抗Stat5ab,Stat5b,Stat1和Stat3特異性抗體,進行了Supershift分析實驗。結(jié)果顯示抗Stat5ab或Stat5b能夠顯著超遷移這個DNA結(jié)合復(fù)合體,而Stat1或Stat3特異性抗體卻并不能超遷移這個DNA結(jié)合復(fù)合體,暗示EPOR/mIL-17RLM-S嵌合受體所介導(dǎo)的Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體主要為Stat5b-DNA復(fù)合體。這一結(jié)果進一步表明了mIL-17RLM-S胞內(nèi)區(qū)具有活化Stat5信號的潛力。
Supershift分析結(jié)果顯示采用抗Stat5ab或Stat5b,能夠超遷移Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體,然而采用抗Stat5a或Stat1特異性抗體卻并未超遷移Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體。這表明EPOR/mIL-17RLM-S嵌合受體主要介導(dǎo)Stat5b的活化,而不是Stat5a的活化。另外。使用冰冷的未標(biāo)記Stat5 DNA特異性結(jié)合探針,能夠特異地競爭性抑止Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體地形成,而使用無關(guān)的探針卻不能競爭性抑止Stat5-DNA結(jié)合復(fù)合體的形成。這些結(jié)果充分證明了EPOR/mIL-17RLM-S嵌合受體主要介導(dǎo)Stat5b的活化,而不是Stat5a的活化。這一結(jié)果也與通過瞬時過量表達EPOR/mIL-17RLM-S在Cos7細(xì)胞所介導(dǎo)Stat5活化的結(jié)果相吻合。據(jù)此可以得出,mIL-17RLM-S胞內(nèi)區(qū)具有活化轉(zhuǎn)錄因子Stat5的信號潛力。
實施例3、mIL-17RLM-S胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)細(xì)胞增殖通常,I型細(xì)胞因子受體應(yīng)答其偶連配體具有傳遞細(xì)胞增殖的信號能力。借助[3H]-Thymidine整合,進行了細(xì)胞增殖分析實驗。結(jié)果表明EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌和受體穩(wěn)定表達的細(xì)胞系和EPOR穩(wěn)定表達的細(xì)胞系一樣,能夠應(yīng)答EPO的刺激,出現(xiàn)細(xì)胞增殖現(xiàn)象,并且這種增殖效應(yīng)為EPO濃度依賴的方式和刺激時間依賴的方式。這暗示mIL-17RLM-S的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有傳遞細(xì)胞增殖的信號潛力。
序列表<160>2<210>1<211>2134<212>DNA<213>小鼠屬小鼠種BALB/c品系(Mus musculus strain BALB/c)<400>1agctcccagg ctcagtactg atgtgccgtg gctttcctat ccaagaagag acagcactct 60ccttctgtag catctgggat ttgaaaccta agctaagtcc atcaagtgga cctggctttc120tgctttcctg ggctttgcct ggccctggaa ttatgtctca gtgacagtgt ggagtgcggg180tcttttgtag gtggtggggt ggacagttct ctacaccatg tgtgtctttg ttccctttta240gggaatggaa tctcagcctt tcctgaatat gaaatttgag acggattact ttgtaaagat300tgtccctttc ccttccatta aaaatgaaag caattaccat cccttcttct tcagaacacg360ggcctgtgac ctgttgttac aacctgacaa cttggcctgt aagcctttct ggaagcctcg420aaacctgaat atcagccagc atggttctga catgcacgtg tccttcgacc atgccccgca480gaacttcggc ttccgtggct tccatgttct ctataagctc aagcacgaag gccccttcag540gcggaggact tgcaggcagg accagaatac agagacaacc agctgcctcc tccaaaacgt600ttctccaggg gactatatca ttgagctggt ggatgacagc aacaccacca ggaaagctgc660tcagtatgtg gtgaagtcag tgcagtctcc ctgggctgga cccatcagag ctgtggccat720cactgtgcct ctggttgtca tatctgcgtt cgcaaccctg ttcactgtga tgtgcagaaa780gaagcaacaa gaaaatatat 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1.一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白,它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì),其特征在于所述蛋白質(zhì)具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
3.一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白的編碼基因,它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列;2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有95%以上同源性,且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因,其特征在于所述小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.權(quán)利要求1所述的小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白在使Stat5因子活化中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白在介導(dǎo)細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種新的小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白及其編碼基因。一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白,它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。一種小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白的編碼基因,它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列;2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有95%以上同源性,且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的小鼠白細(xì)胞介素-17受體樣蛋白可以使Stat5因子活化并能夠介導(dǎo)細(xì)胞增殖。
文檔編號C12N15/24GK1465593SQ0212354
公開日2004年1月7日 申請日期2002年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月1日
發(fā)明者熊世勤, 常智杰, 傅新元 申請人:清華大學(xué)
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