專利名稱：厭氧菌感染的一種快速診斷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種厭氧菌感染的診斷方法，具體地為用常規(guī)采樣，不經(jīng)培養(yǎng)，可直接快速診斷的方法。
背景技術(shù)：
厭氧菌是一類只能在無(wú)氧或低氧分壓、低氧化還原電位(Eh)、含有一定CO2環(huán)境中才能生長(zhǎng)的細(xì)菌，它只能從無(wú)氧酵解中獲得能量。厭氧菌的種類十分復(fù)雜，有30多個(gè)屬、數(shù)百種，隨厭氧培養(yǎng)、分離、鑒定技術(shù)的快速發(fā)展，還在不斷發(fā)現(xiàn)新種。臨床上感染致病常見(jiàn)的厭氧菌有10個(gè)屬30多種。
厭氧菌作為正常菌群廣泛存在于人體皮膚深部和腔道深部黏膜表面。口、咽腔和腸道是人體內(nèi)最大的厭氧菌的“儲(chǔ)菌庫(kù)”，是由于各種原因引起的菌群失調(diào)、機(jī)體免疫功能下降或細(xì)菌易位導(dǎo)致感染，它是一種十分常見(jiàn)的條件致病菌。臨床標(biāo)本的厭氧菌分離率國(guó)外報(bào)告為51～78％，國(guó)內(nèi)為30～67％。所以，不做厭氧菌診斷幾乎將遺漏掉50％以上的病原菌。很多厭氧菌對(duì)臨床常用抗菌藥物(如磺胺類、氨基糖甙類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和許多頭孢類藥物)不敏感。所以，不做厭氧菌診斷將導(dǎo)致病情延誤和藥物浪費(fèi)。
目前厭氧菌感染的診斷方法包括有以下幾種——1、細(xì)菌學(xué)診斷是一經(jīng)典方法。它的診斷步驟應(yīng)包括三級(jí)——(1)臨床標(biāo)本原代厭氧培養(yǎng)+G+染色厭氧菌初步診斷；(2)分離厭氧培養(yǎng)+G+染色+某些生化實(shí)驗(yàn)；(3)分離厭氧培養(yǎng)+特殊生化實(shí)驗(yàn)和氣-液相色譜對(duì)其終末代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。臨床檢測(cè)基本上停留于一級(jí)。為了保證診斷可靠性，下述每一個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)充分保障(1)標(biāo)本的采集凡可能被正常菌群污染的標(biāo)本，如咳痰、纖支鏡吸出的痰、一般纖支鏡細(xì)胞刷取的分泌物、支氣管-肺灌洗液、流出的膿、鼻-口-咽-肛-陰道-竇道拭子、中段尿或?qū)?、?腸內(nèi)容物等，均無(wú)送檢價(jià)值，即90％以上的臨床常規(guī)采樣標(biāo)本不能用來(lái)進(jìn)行厭氧菌的細(xì)菌學(xué)診斷。以臨床最為常見(jiàn)的下呼吸道厭氧菌感染為例，要求標(biāo)本采用肺穿刺、環(huán)甲膜穿刺、帶特殊保護(hù)套的纖支鏡細(xì)胞刷取的分泌物或氣管切開(kāi)抽取物作標(biāo)本，這不僅對(duì)患者帶來(lái)痛苦、風(fēng)險(xiǎn)，而且還需要一定的設(shè)施條件，故不可能廣泛普及開(kāi)展。
(2)標(biāo)本保送標(biāo)本采集后應(yīng)盡量不接觸空氣。因在空氣中暴露可能引起兼性厭氧菌過(guò)度生長(zhǎng)或標(biāo)本干燥，而影響厭氧菌的生存，甚至造成死亡。通常采用方法為或注射器抽取后針頭橡皮封堵，在20～30min內(nèi)送檢；或立即穿刺注入特制的密封的，預(yù)先充滿純N2的無(wú)氧密封小瓶中，組織標(biāo)本置入特制的厭氧袋或罐在1～2h內(nèi)送檢；或床邊立即接種。這不僅需要特殊裝置，而且稍有不慎即將會(huì)出現(xiàn)假陰性，臨床上難以達(dá)到要求。
(3)厭氧培養(yǎng)采用低氧化還原電位培養(yǎng)基(要求新鮮配制)和嚴(yán)格無(wú)氧環(huán)境(70％N2+20％CO2+10％H2)。經(jīng)常采用的是“厭氧罐”、“生物(厭氧袋)袋”、“厭氧室或厭氧手套箱”，即需要特殊的裝置。原代培養(yǎng)至少2～3天，排除診斷則需2周。診斷周期長(zhǎng)，易貽誤病的治療。
從上述可知，對(duì)于絕大多數(shù)厭氧菌感染的診斷無(wú)論從標(biāo)本采樣、標(biāo)本保送及厭氧培養(yǎng)都相當(dāng)不易，所以，國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院都沒(méi)有將其列為常規(guī)檢測(cè)。
2、免疫學(xué)檢查熒光抗體染色法、酶聯(lián)免疫組化法等都已成功應(yīng)用于厭氧菌感染的診斷，其與細(xì)菌學(xué)診斷符合率很高。但它們專屬性高，不同的厭氧菌要求不同的診斷盒，厭氧菌的科、屬、種如此之多，給配制帶來(lái)一定難度，故臨床實(shí)用價(jià)值不大。
3、厭氧菌的分子生物學(xué)診斷DNA探針、基因擴(kuò)增(PCR)技術(shù)也用于厭氧菌診斷研究。與免疫學(xué)檢測(cè)原因相同，其臨床實(shí)用價(jià)值不大。
4、厭氧菌特殊代謝產(chǎn)物檢測(cè)厭氧菌代謝產(chǎn)生多種揮發(fā)或不揮發(fā)性短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、乳酸、琥珀酸等。不同屬、種的厭氧菌產(chǎn)酸譜不同，以前主要用于厭氧菌屬、種鑒定。少數(shù)需氧菌也可產(chǎn)生乙酸、丙酸和乳酸，但不產(chǎn)生其他短鏈脂肪酸，特別是丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、琥珀酸。上述短鏈脂肪酸可以直接或衍生化后進(jìn)行氣相色譜(GC)分析診斷。采用氣相色譜分析方法對(duì)量大的標(biāo)本(如胸-腹水、膽總管引流液等)直接采用有機(jī)溶劑(如乙醚、氯仿)反復(fù)萃取并濃縮后，或進(jìn)一步衍生化處理(如甲酯化)后進(jìn)行氣相色譜分析；對(duì)量小的標(biāo)本(如支氣管-肺分泌物、抽取的少量膿液等)先行短程(1～3天)厭氧培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)基采用有機(jī)溶劑反復(fù)萃取、濃縮并進(jìn)一步衍生化處理(如甲酯化)后，再進(jìn)行氣相色譜分析，若分析出有相當(dāng)濃度的多種短鏈脂肪酸，特別是異丁酸、戊酸、異戊酸、琥珀酸，即可判斷其為厭氧菌感染。由于這方法(1)標(biāo)本前采用處理采用有機(jī)溶劑反復(fù)萃取、濃縮并進(jìn)行衍生化處理，故仍嫌煩瑣，而且因采用了大量有機(jī)溶劑萃取、濃縮會(huì)造成污染環(huán)境；(2)采用定量診斷標(biāo)準(zhǔn)，可是有機(jī)溶劑萃取、濃縮過(guò)程中短鏈脂肪酸亦將隨溶劑一起揮發(fā)，從定量的角度看，它的回收率不符合要求，重復(fù)性差；(3)臨床絕大多數(shù)標(biāo)本是小量的，仍需預(yù)先厭氧培養(yǎng)。鑒于上述原因，其臨床應(yīng)用價(jià)值不大，所以并未真正用于臨床。
20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的固相微萃取(SPME)技術(shù)遠(yuǎn)比液相萃取法簡(jiǎn)便、快捷、選擇性好、萃取效率高，并且無(wú)污染。SPME+色譜分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、海關(guān)毒品和少數(shù)藥品的監(jiān)測(cè)，迄今尚無(wú)臨床應(yīng)用報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)狀，旨在提供一種對(duì)標(biāo)本無(wú)任何要求，用常規(guī)采樣，不經(jīng)培養(yǎng)，可通過(guò)厭氧菌代謝產(chǎn)生的多種特征性揮發(fā)性短鏈脂肪酸的存在，快速檢測(cè)出厭氧菌感染的快速診斷的方法。
本發(fā)明的目的的實(shí)現(xiàn)方式為，厭氧菌感染的一種快速診斷的方法，其具體步驟為1)標(biāo)本采集用臨床普通常規(guī)方法采集標(biāo)本2)標(biāo)本的預(yù)處理(1)液體標(biāo)本直接加飽和氯化鈉成飽和溶液后鹽析，(2)粘稠標(biāo)本，如痰、膿類，加酸如2～10％鹽酸+次氯酸(1∶2～6)或酶震蕩消化數(shù)分鐘，充分溶解后，再加飽和氯化鈉鹽析，酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶，(3)固體標(biāo)本，如組織塊，先剪碎研磨成勻漿，再加酸或酶震蕩消化成溶液，后加飽和氯化鈉鹽析，酸與酶如上，3)標(biāo)本的固相微萃取(SPME)萃取針頭采用有聚乙烯乙二醇/二乙烯苯、聚乙烯乙二醇/陰離子樹(shù)脂或聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯復(fù)合涂層的針頭，萃取方式采用密封瓶離取樣液面1公分左右頂空萃取法，萃取1分鐘以上，或液中萃取5分鐘以上，6)氣相色譜分析色譜柱——彈性石英毛細(xì)管色譜柱或填充柱，固定相為聚乙二醇20M和2-硝基對(duì)苯二甲酸的反應(yīng)物，簡(jiǎn)稱FFAP，載氣——N2，檢測(cè)器——?dú)浠鹧鏅z測(cè)器或熱導(dǎo)池類檢測(cè)器，汽化室溫度——200～250℃，脫附時(shí)間——5～10以上秒，柱溫——90～150℃下恒溫，為理想分離各成分峰，或在60～220℃分二階或多階程序升溫，靈敏度——102～3，衰減1/1～8，7)診斷采用定性診斷，以明確、清晰檢出以下成分峰為陽(yáng)性，即為厭氧菌感染
(1)明確、清晰檢出有異丁酸、戊酸、異戊酸峰中之一者，(2)明確、清晰檢出有乙酸、丙酸及另外一種短鏈脂肪酸峰中之一者，(3)明確、清晰檢出有二種非異丁酸、戊酸、異戊酸、乙酸、丙酸的短鏈脂肪峰者。
本發(fā)明的萃取采用圖1中所示的固相萃取裝置，圖中1為萃取頭，2為手柄。采用頂空萃取時(shí)，為提高陽(yáng)性率，宜在超聲震蕩、加溫或攪拌下進(jìn)行。
由于正常寄居與感染灶的厭氧菌密度及繁殖-代謝率有很大差異，口-咽腔-皮膚表面正常寄居的厭氧菌密度及繁殖-代謝率低，正常產(chǎn)生的短鏈脂肪酸量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于感染灶，本發(fā)明選擇國(guó)產(chǎn)氣相色譜儀SP-520型或其他型號(hào)的國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口氣相色譜儀，其靈敏度足以在測(cè)出臨床各種標(biāo)本中的各種短鏈脂肪酸時(shí)不受正常菌群污染的的影響，所以，臨床感染標(biāo)本的固相微萃取+氣相色譜分析SPME+GC檢測(cè)，不必憂慮正常寄居菌群的污染，又由于SPME+GC檢測(cè)的是厭氧菌代謝產(chǎn)物而非活菌，所以采用本發(fā)明，對(duì)標(biāo)本采集無(wú)特殊要求，標(biāo)本保送無(wú)特殊條件要求及時(shí)間限制，不需培養(yǎng)。
采用本發(fā)明方法對(duì)含有10-5的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、異己酸、庚酸的混合標(biāo)準(zhǔn)短鏈脂肪酸溶液進(jìn)行檢測(cè)，采用頂空超聲震蕩下萃取1分鐘，脫附10秒，60～200℃二階程序升溫，大口徑彈性石英毛細(xì)管FFAP色譜柱，檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖2)，圖中的A、P、IB、B、IV、V、C、IC、E峰即為上述各短鏈脂肪酸的峰，可見(jiàn)本發(fā)明確實(shí)能檢測(cè)出厭氧菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性短鏈脂肪酸。
用上述同樣的方法對(duì)臨床常見(jiàn)的需氧菌，金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、鏈球菌、奈瑟氏菌、李斯特桿菌、志賀氏痢疾桿菌、沙門氏菌、埃希氏痢疾桿菌、枸櫞酸桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、變形桿菌、腸桿菌、產(chǎn)堿桿菌、不動(dòng)桿菌、摩根氏菌、嗜血流感桿菌、銅綠假單胞桿菌、莫拉氏菌、放線菌、諾卡氏菌等19屬47種52株；臨床常見(jiàn)的厭氧菌，有類桿菌、普氏菌、梭桿菌、韋榮氏菌、消化鏈球菌、消化球菌、優(yōu)桿菌、梭狀芽孢桿菌、纖毛菌、放線菌10屬23種的標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示需氧菌培養(yǎng)液中僅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單苞桿菌、普通變形桿菌、枯草桿菌、放線菌、摩根氏桿菌的培養(yǎng)液可以檢出微量的乙酸及丙酸(見(jiàn)圖4)，全部需氧菌培養(yǎng)液均未檢出除乙酸、丙酸外的其他揮發(fā)性短鏈脂肪酸；而全部厭氧菌的培養(yǎng)液中均清晰、明確檢出有多種揮發(fā)性短鏈脂肪酸，特別是異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸等(見(jiàn)圖3)。檢測(cè)結(jié)果與權(quán)威的“厭氧菌實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(VPI)基本一致(見(jiàn)表1)。
表1 臨床常見(jiàn)的厭氧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液中短鏈脂肪酸的GC分析結(jié)果

注A-乙酸、P-丙酸、IB-異丁酸、B-丁酸、IV-異戊酸、V-戊酸、C-己酸、IC-異己酸、E-庚酸；小寫字母表示為微量成分。
由上可見(jiàn)需氧菌對(duì)本發(fā)明無(wú)影響。
采用本發(fā)明方法對(duì)臨床220例下呼吸道感染住院患者(老年患者155例；中青年患者65例)采集的晨痰進(jìn)行了檢測(cè)，其中108例老年患者、28例中青年患者檢有厭氧菌感染，其厭氧菌感染率分別為69.68％和43.08％，與文獻(xiàn)報(bào)告相似，但它的診斷時(shí)間僅需30～40分鐘。對(duì)其中80例患者的晨痰、嗽口水同步進(jìn)行厭氧培養(yǎng)、溶劑萃取+色譜GC、氣相色譜SPME/GC檢測(cè)，結(jié)果——痰培養(yǎng)的陽(yáng)性率100％、嗽口水培養(yǎng)的陽(yáng)性率97.5％(見(jiàn)圖5)；痰的溶劑萃取+GC陽(yáng)性率18.75％；痰的SPME/GC檢測(cè)陽(yáng)性率63.75％，嗽口水的檢測(cè)陽(yáng)性率為0％(見(jiàn)表2)。
表2 80例下呼吸道感染患者同步進(jìn)行痰和嗽口水厭氧菌培養(yǎng)、乙醚萃取/GC、SPME/GC檢測(cè)結(jié)果

這表明，普通采集的痰厭氧培養(yǎng)存在很高的假陽(yáng)性率，故不能用于厭氧菌診斷；痰的直接溶劑萃取+GC陽(yáng)性率太低，此法也不能用于厭氧菌診斷；痰的SPME/GC檢測(cè)陽(yáng)性率高，并不受正常寄居菌的影響，由此可見(jiàn)本發(fā)明臨床診斷價(jià)值高。
采用本發(fā)明方法對(duì)臨床20例用廣譜強(qiáng)效抗生素治療效果差的下呼吸道感染住院患者，對(duì)采集的晨痰進(jìn)行了檢測(cè)，17例檢出合并有厭氧菌感染(見(jiàn)圖6)，患者加用替硝唑治療后病情顯著緩解，SPME/GC監(jiān)測(cè)表明檢出的短鏈脂肪酸的種類及峰面積隨病情緩解而減少(小)，甚至消失(見(jiàn)圖7)。這不僅表明本發(fā)明診斷可靠，而且可用于病情監(jiān)測(cè)，對(duì)厭氧菌感染性疾病的診治有很高價(jià)值。
采用本發(fā)明方法對(duì)臨床其他懷疑厭氧菌感染的標(biāo)本，包括感染性腹水、胸水、膽總管引流液、闌尾炎穿孔的膿、瘺管的膿、膿腫抽出的膿、燒傷感染的膿液、尿液等進(jìn)行了檢測(cè)，也均可成功檢出。
采用本發(fā)明，標(biāo)本采集無(wú)特殊要求，標(biāo)本保送無(wú)特殊條件要求及時(shí)間限制，不需培養(yǎng)，能快檢測(cè)出速患者是否有厭氧菌感染情況，診斷時(shí)間僅需30～40分鐘。本發(fā)明不受正常寄居菌的影響，檢測(cè)陽(yáng)性率高，診斷可靠。不僅可用于厭氧菌感染的診斷，而且可用于病情監(jiān)測(cè)。


圖1 固相萃取裝置結(jié)構(gòu)示意2 混合標(biāo)準(zhǔn)短鏈脂肪酸溶液色譜3 厭氧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株色譜4 需氧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株色譜5 同一厭氧菌感染患者的嗽口水色譜6 同一厭氧菌感染患者晨咳痰的色譜7 同一厭氧菌感染患者經(jīng)抗厭氧菌治療后的晨咳痰的色譜圖
權(quán)利要求
1.厭氧菌感染的一種快速診斷的方法，其特征在于其具體步驟為1)標(biāo)本采集用臨床普通常規(guī)方法采集標(biāo)本2)標(biāo)本的預(yù)處理(1)液體標(biāo)本直接加飽和氯化鈉成飽和溶液后鹽析，(2)粘稠標(biāo)本，如痰、膿類，加酸如2～10％鹽酸+次氯酸(1∶2～6)或酶震蕩消化數(shù)分鐘，充分溶解后，再加飽和氯化鈉鹽析，酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶，(3)固體標(biāo)本，如組織塊，先剪碎研磨成勻漿，再加酸或酶震蕩消化成溶液，后加飽和氯化鈉鹽析，酸與酶如上，3)標(biāo)本的固相微萃取(SPME)萃取針頭采用有聚乙烯乙二醇/二乙烯苯、聚乙烯乙二醇/陰離子樹(shù)脂或聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯復(fù)合涂層的針頭，萃取方式采用密封瓶離取樣液面1公分左右頂空萃取法，萃取1分鐘以上，或液中萃取5分鐘以上，4)氣相色譜分析色譜柱——彈性石英毛細(xì)管色譜柱或填充柱，固定相為聚乙二醇20M和2-硝基對(duì)苯二甲酸的反應(yīng)物，簡(jiǎn)稱FFAP，載氣——N2，檢測(cè)器——?dú)浠鹧鏅z測(cè)器或熱導(dǎo)池類檢測(cè)器，汽化室溫度——200～250℃，脫附時(shí)間——5～10以上秒，柱溫——90～150℃下恒溫，為理想分離各成分峰，或在60～220℃分二階或多階程序升溫，靈敏度——102～3，衰減1/1～8，5)診斷采用定性診斷，以明確、清晰檢出以下成分峰為陽(yáng)性，即為厭氧菌感染(1)明確、清晰檢出有異丁酸、戊酸、異戊酸峰中之一者，(2)明確、清晰檢出有乙酸、丙酸及另外一種短鏈脂肪酸峰中之一者，(3)明確、清晰檢出有二種非異丁酸、戊酸、異戊酸、乙酸、丙酸的短鏈脂肪峰者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速診斷的方法，其特征在于頂空萃取宜在超聲震蕩、加溫或攪拌下進(jìn)行。
全文摘要
厭氧菌感染的一種快速診斷的方法,涉及一種厭氧菌感染的診斷方法。其具體步驟為:標(biāo)本采集,標(biāo)本的預(yù)處理,標(biāo)本的固相微萃取(SPME),氣相色譜分析,由檢測(cè)出的厭氧菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性短鏈脂肪酸成分峰,診斷出厭氧菌的存在。采用本發(fā)明,標(biāo)本采集無(wú)特殊要求,標(biāo)本保送無(wú)特殊條件要求及時(shí)間限制,不需培養(yǎng),可以快速檢測(cè)出患者是否有厭氧菌感染情況,診斷時(shí)間僅需30～40分鐘。本發(fā)明不受正常寄居菌的影響,檢測(cè)陽(yáng)性率高,診斷可靠。不僅可用于厭氧菌感染的診斷,而且可用于病情監(jiān)測(cè),對(duì)厭氧菌感染性疾病的診治有很高價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1386863SQ0211590
公開(kāi)日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2002年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月30日
發(fā)明者薛存寬, 王模榮, 蔣鵬, 王玲, 袁彬 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院