專利名稱：轉(zhuǎn)基因植物及其制品的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物安全管理技術(shù)領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)基因植物及其制品的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
1、轉(zhuǎn)基因植物的安全管理轉(zhuǎn)基因植物(transgenic plant)是指人為地通過一定方法將外源基因轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，并遺傳、表達的植物變異體，被轉(zhuǎn)入植物基因組的外源基因稱為轉(zhuǎn)化基因(transgene)。
1983年人類首次報道轉(zhuǎn)基因煙草誕生，到2000全球轉(zhuǎn)基因植物種植面積達4420萬公頃。轉(zhuǎn)基因植物從誕生之日起，就有人擔心它們可能存在的生態(tài)和食品安全問題，這些擔心曾受到一些研究結(jié)果的支持。為了加強對轉(zhuǎn)基因生物的管理，避免其可能帶來的生態(tài)、食品威脅，保護消費者權(quán)益，保證轉(zhuǎn)基因植物研究正常發(fā)展，許多國際組織、國家和地區(qū)都制定了相應(yīng)的法律、法規(guī)。這些法律、法規(guī)的實施，首先要求相關(guān)職能部門、研究機構(gòu)在實施管理時，對有關(guān)植物及其產(chǎn)品進行檢測、鑒定。建立一套通用的，快速、準確、經(jīng)濟、方便地檢測鑒定技術(shù)，是當前國內(nèi)外的一個研究熱點。
2、轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)的發(fā)展和存在的問題迄今，轉(zhuǎn)基因植物的檢測主要限于目的基因檢測，報告或標記基因檢測。目的基因即賦予植物有用性狀的功能基因，如抗病、抗蟲、抗除草劑基因等，目前在研的目的基因數(shù)以萬計，而且每天都在增加，涉及植物種類超過100種。截止2001年12月，僅美國FDA批準產(chǎn)業(yè)化的51種轉(zhuǎn)基因植物所含目的基因就超過65種；截止1999年12月，我國農(nóng)業(yè)部共批準150多項轉(zhuǎn)基因植物進入商品化生產(chǎn)、環(huán)境釋放或中間試驗，涉及基因約103種。報告或標記基因是為了方便篩選和鑒別轉(zhuǎn)基因植物而采用的植物基因組沒有的外源基因，常用的報告或標記基因約20種，如nos、NPTII、GUS、GFP、bar基因等。在具體檢測方法上，又有四個層次(1)DNA的分子雜交(Southern雜交)、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等分析技術(shù)，用以探測目標基因存在狀況，PCR技術(shù)因簡便易行而用得最多。但過去人們主要針對目的基因、報告或標記基因，其局限性是，如果一個具體植物不知道研究者導(dǎo)入何種基因，如果一種制品含有多種植物成分，用上述方法將帶有很大的盲目性，要花較長的時間才能確定它(們)是否轉(zhuǎn)基因植物或制品。
(2)RNA的分子雜交(Northern雜交)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)等分析技術(shù)，用以探測目標基因在RNA水平的表達狀況，其缺陷與上述相同，而且檢測樣品必需是鮮活的植物材料，無法檢測干枯、死亡材料和以植物為原料各種制品。
(3)蛋白質(zhì)的ELISA、Western blot等分析技術(shù)，利用抗體-抗原之間的免疫反應(yīng)來分析基因在蛋白質(zhì)水平上的表達狀況，其不足是，如果一個具體植物不知道研究者導(dǎo)入何種基因，如果一種制品含有多種植物成分，將難以確定選用何種基因產(chǎn)物的抗體進行檢測。
(4)基因功能分析技術(shù)，一些轉(zhuǎn)化基因產(chǎn)物(酶或蛋白質(zhì))的功能可用轉(zhuǎn)基因植物的活體、活組織、蛋白粗提液與底物反應(yīng)來觀察；而另一些基因編碼抗生素抗性、除草劑抗性等，則可以通過簡單的種子萌發(fā)等活體試驗加以分析。不難看出，它們都必須用活體或活組織，且在結(jié)果的判斷上容易出現(xiàn)誤差。
國內(nèi)外均未見利用T-DNA左右邊界序列、CaMV 35S polyA、nos啟動子、nos終止序列設(shè)計合成引物進行PCR檢測轉(zhuǎn)基因植物及其制品的報道。雖有幾篇利用CaMV 35S啟動子檢測轉(zhuǎn)植物及其制品的報道，但對于易感染CaMV的十字花科植物，單獨使用CaMV 35S啟動子檢測有可能造成重要誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因植物及其制品的檢測方法。該方法根據(jù)轉(zhuǎn)基因植物最普遍的特征序列T-DNA左右邊界序列、CaMV 35S polyA、nos啟動子、nos終止序列設(shè)計合成引物，進行PCR檢測轉(zhuǎn)基因植物及其制品，從而克服上述現(xiàn)有檢測方法所存在的問題。
為了獲得轉(zhuǎn)基因植物，通常將外源基因構(gòu)建到由農(nóng)桿菌(Agrobacterium)Ti質(zhì)粒(tumer-inducingplasmid)或Ri質(zhì)粒(root-inducing plasmid)衍生而來的載體T-DNA區(qū)構(gòu)成植物表達載體，在這種載體上總是存在25bp的T-DNA左右邊界序列(right border sequence，RB；left border sequence，LB)，以及與外源基因配合使用的CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子、nos終止序列，植物表達載體通過農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法(co-cultivation)、基因槍法(gene gun，particle bombardment)等方法導(dǎo)入植物細胞，使外源基因整合到植物基因組并在轉(zhuǎn)基因植物中表達。
本發(fā)明方法是采用常規(guī)方法提取被測樣品的DNA，根據(jù)T-DNA左右邊界序列、CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子、nos終止序列設(shè)計合成一對或多對引物，進行PCR，得到相應(yīng)的DNA擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物的信號。
本發(fā)明方法具體包括以下步驟(1)合成2條以上引物，其中一條為T-DNA左右邊界序列引物，長度18-25nt，其它為CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子和nos終止序列中任意一段或多段序列，長度≥18nt；(2)取T-DNA左右邊界序列引物，與一條或多條其它引物配成一對或多對PCR引物，按常規(guī)方法對樣品DNA進行PCR擴增反應(yīng)，以pBI121或pCAMBIA1300等質(zhì)粒DNA作正對照，以未轉(zhuǎn)基因植物或制品DNA作負對照，PCR反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性5分鐘，反應(yīng)25-35循環(huán)，每循環(huán)包括94℃變性1分鐘，45-65℃退火1分鐘，72℃延伸反應(yīng)30秒-10分鐘，循環(huán)結(jié)束后，追加72℃延伸反應(yīng)5分鐘；(4)PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察到大小50-10000bp的DNA擴增片段。
按照上述本發(fā)明方法，還可進行實時定量PCR，具體是在步驟(2)的PCR反應(yīng)管中加入與雙鏈DNA特異結(jié)合的SYBR熒光染料，或者特異的TaqMan熒光探針；PCR擴增產(chǎn)物通過熒光掃描儀觀測到相應(yīng)熒光信號，或者按步驟(3)觀察結(jié)果。
按照上述本發(fā)明方法，還可進行PCR-ELISA，具體是在步驟(1)中，用生物素標記合成的引物；PCR擴增產(chǎn)物與固定在微板上的鏈親和素(streptavidin)-蛋白A結(jié)合，再與堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標生物素抗體進行ELISA反應(yīng)，用微板讀數(shù)儀(酶標儀)讀取405-410nm的吸光值，或者按步驟(3)觀察結(jié)果。
本發(fā)明方法具有以下有益效果(1)廣泛性。T-DNA左右邊界序列、nos啟動子和nos終止序列存在于絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物中，CaMV35S啟動子和/或CaMV 35S polyA存在于70％以上的轉(zhuǎn)基因植物中，因而具有最廣泛代表性，適用于當前絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物及其制品的檢測。
(2)快速性。大多數(shù)檢測需時約2小時至2天，能保證快速檢測的需要。
(3)準確性。上述幾種序列都是轉(zhuǎn)基因植物的特征序列，檢測結(jié)果準確性強。
(4)靈敏性。只需用極少量樣品，如一粒種子、一塊組織、一片葉子，甚至少到ug(微克)級的樣品。
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1利用T-DNA左右邊界序列和nos終止序列引物進行PCR檢測轉(zhuǎn)基因番木瓜如前面所述，T-DNA左右邊界序列、nos終止序列存在于絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物中，故用這兩種序列合成引物進行PCR，適用于當前絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物及其制品的檢測。我們在過去的工作中獲得了轉(zhuǎn)番木瓜環(huán)斑病毒(PRV)復(fù)制酶(RP)基因的抗病毒番木瓜品系，用PCR方法對其進行了轉(zhuǎn)基因檢測。
(1)用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因番木瓜葉片DNA。
(2)合成一對引物，其中一條為T-DNA左右邊界序列引物(第4-23nt)5’-caggatatattggcgggtaa-3’，另一條為nos終止序列引物(nos終止序列第81-100nt)5’-catgcttaacgtaattcaac-3’。
(3)按常規(guī)方法對樣品DNA進行PCR擴增反應(yīng)，以pRPTW質(zhì)粒DNA(含T-DNA左右邊界序列、PRV RP基因、nos終止序列等)作正對照，以未轉(zhuǎn)基因的番木瓜DNA作負對照，PCR反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性5分鐘，反應(yīng)30循環(huán)，每循環(huán)包括94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸反應(yīng)4分鐘，循環(huán)結(jié)束后，追加72℃延伸反應(yīng)5分鐘。
(5)PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察，樣品和正對照都有1條大小約2500bp的DNA擴增片段，負對照沒有任何擴增片段。結(jié)果與設(shè)計相符，表明相關(guān)序列和RP基因已整合進番木瓜基因組。
實施例2利用T-DNA左右邊界序列和CaMV35S啟動子引物進行實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因煙草CaMV 35S啟動子具有植物強啟動子功能，無器官特異性，因而廣為采用，迄今70％以上的轉(zhuǎn)基因植物采用這種啟動子。但少數(shù)十字花科植物易感染CaMV，故在檢測這類植物及其制品時，如單獨使用CaMV 35S啟動子引物，可能造成重要誤差，利用分別來自T-DNA左右邊界序列和CaMV 35S啟動子的兩個引物進行PCR則可克服這一問題。采用實時定量PCR法對我們獲得的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦煙草進行了檢測。
(1)用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片DNA。
(2)合成一對引物，其中一條為T-DNA左右邊界序列引物(第4-23nt互補序列)5’-ttacccgccaatatatcctg-3’，另一條為CaMV35S啟動子引物(第325-344 nt)5’-atggtggagcacgacactct-3’。
(3)按常規(guī)方法對樣品DNA進行PCR擴增反應(yīng)，以pM12質(zhì)粒DNA(含T-DNA左右邊界序列、CaMV35S啟動子序列、EPSPS突變體基因等)作正對照，以未轉(zhuǎn)基因的煙草DNA作負對照，向反應(yīng)管中加入與雙鏈DNA特異結(jié)合的SYBR熒光染料，反應(yīng)在ABI Prism7000型熒光定量PCR儀中進行，PCR反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性5分鐘，反應(yīng)35循環(huán)，每循環(huán)包括94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸反應(yīng)2分鐘，循環(huán)結(jié)束后，追加72℃延伸反應(yīng)5分鐘。
(4)隨著循環(huán)數(shù)增加，轉(zhuǎn)基因煙草和正對照PCR擴增產(chǎn)物熒光信號不斷增強，30循環(huán)時熒光強度達到最強，負對照測不到熒光；PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察，轉(zhuǎn)基因煙草和正對照都有1條大小約2000bp DNA擴增片段，負對照沒有任何擴增片段，結(jié)果與設(shè)計相符，表明相關(guān)序列和EPSPS突變體基因已整合進煙草基因組。
實施例3利用CaMV35S啟動子和nos終止序列引物進行PCR-ELISA檢測轉(zhuǎn)基因番茄我們將變形鏈球菌表面蛋白PAC(Streptococcus mutans surface protein)的唾液粘附區(qū)(Saliva-binding region，SBR)基因及其與霍亂弧菌B亞單位(Cholera toxin B subunit，CTB)組成嵌合基因，共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化番茄，獲得轉(zhuǎn)基因植株，用PCR-ELISA方法對其進行了轉(zhuǎn)基因檢測。
(1)用常規(guī)CTAB法提取轉(zhuǎn)基因番茄果實DNA。
(2)合成一對引物，其中一條為CaMV35S啟動子引物(第61-70nt，5’端連接生物素)5’-biotin-cagcaggtctcatcaagacg-3’，另一條為另一條為nos終止序列引物(nos終止序列第81-100nt互補序列)5’-gttgaattacgttaagcatg-3’。
(3)按常規(guī)方法對樣品DNA進行PCR擴增反應(yīng)，以pROSB質(zhì)粒DNA(含CaMV35S啟動子、SBR-CTB嵌合基因、nos終止序列等)作正對照，以未轉(zhuǎn)基因的番茄DNA作負對照，PCR反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性5分鐘，反應(yīng)30循環(huán)，每循環(huán)包括94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸反應(yīng)3分鐘，循環(huán)結(jié)束后，追加72℃延伸反應(yīng)5分鐘。
(4)PCR擴增產(chǎn)物與固定在微板上的鏈親和素(streptavidin)-蛋白A結(jié)合，再分別與地高辛探針(CaMV35S啟動子第181-200nt，5’-aagatatattt ctcaagatc-3’-Dig)、酶標地高辛抗體進行ELISA反應(yīng)，用BioRad450酶標儀讀取405-410nm的吸光值，樣品和正對照可見明顯的吸收峰，負對照則沒有；PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察，樣品和正對照都有1條大小約2900bp的DNA擴增片段，負對照沒有任何擴增片段，結(jié)果與設(shè)計相符，表明相關(guān)序列和SBR-CTB嵌合基因已整合進番茄基因組。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物及其制品的檢測方法，其特征是采用常規(guī)方法提取被測樣品的DNA，根據(jù)T-DNA左右邊界序列、CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子和nos終止序列設(shè)計合成一對或多對引物，進行PCR，得到相應(yīng)的DNA擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物的信號。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是具體包括以下步驟(1)合成2條以上引物，其中一條為T-DNA左右邊界序列引物，長度18-25nt，其它為CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子和nos終止序列中任意一段或多段序列，長度≥18nt；(2)取T-DNA左右邊界序列引物，與一條或多條其它引物配成一對或多對PCR引物，按常規(guī)方法對樣品DNA進行PCR擴增反應(yīng)，以pBI121或pCAMBIA1300質(zhì)粒DNA作正對照，以未轉(zhuǎn)基因植物或制品的DNA作負對照；PCR反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性5分鐘，反應(yīng)25-35循環(huán)，每循環(huán)包括94℃變性1分鐘，45-65℃退火1分鐘，72℃延伸反應(yīng)30秒-10分鐘，循環(huán)結(jié)束后，追加72℃延伸反應(yīng)5分鐘；(3)PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，紫外燈下觀察到大小50-10000bp的DNA擴增片段。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征是進行實時定量PCR在步驟(2)的PCR反應(yīng)管中加入與雙鏈DNA特異結(jié)合的SYBR熒光染料，或者特異的TaqMan熒光探針；PCR擴增產(chǎn)物通過熒光掃描儀觀測到相應(yīng)熒光信號，或者按步驟(3)觀察結(jié)果。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征是進行PCR-ELISA在步驟(1)中，用生物素標記合成的引物；PCR擴增產(chǎn)物與固定在微板上的鏈親和素-蛋白A結(jié)合，再分別與特異性地高辛探針、酶標地高辛抗體進行ELISA反應(yīng)，用酶標儀讀取405-410nm的吸光值，或者按步驟(3)觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因植物及其制品的檢測方法。用轉(zhuǎn)基因植物中的特征序列:T－DNA左右邊界序列、CaMV 35S啟動子、CaMV 35S polyA、nos啟動子和nos終止序列,設(shè)計合成引物進行PCR,得到相應(yīng)的DNA擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物的信號,根據(jù)PCR結(jié)果,判斷被測樣品是否為轉(zhuǎn)基因植物及其制品。本發(fā)明具有簡便易行、經(jīng)濟節(jié)時、準確靈敏的優(yōu)點,特別是只需用一至三對引物既可檢測絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物及其制品。
文檔編號C12Q1/68GK1385541SQ0211523
公開日2002年12月18日 申請日期2002年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月17日
發(fā)明者葉長明, 藍崇鈺, 魏祥東, 陳東紅, 林周 申請人:中山大學