專利名稱：細菌脂多糖的包被方法、檢測特定脂多糖的試劑盒和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的包被方法，進一步涉及使用這種方法提供的檢測細菌特定脂多糖的試劑盒及使用這種試劑盒快速檢測細菌特定LPS的方法。
本發(fā)明的主要原理是細菌LPS單克隆抗體與細菌的LPS有特異的抗原抗體免疫結(jié)合反應(yīng)，用一定量的LPS包埋酶標反應(yīng)孔，加入要檢測LPS的溶液和一定量的LPS單克隆抗體，溶液中的LPS與包埋孔中固定化的LPS競爭結(jié)合LPS單克隆抗體，使得與固定于酶標孔中的LPS結(jié)合的辣根過氧化物酶標記的LPS單克隆抗體的數(shù)量減少，辣根過氧化物酶與底物反應(yīng)顯示的溶液顏色變淺直至無色，由此可以定性或半定量檢測LPS。
本發(fā)明的一種細菌LPS的包被方法包括下列步驟(a)0.2-2μg LPS溶解于50-300μl pH9.6含0.02-2％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(包被液)中，并加到預先用殺菌紫外燈照射過10-60分鐘的酶標測定孔中；(b)35-39℃溫浴30分鐘-3小時；(c)4℃放置2-48小時；(d)甩干溶液，加入脫脂奶粉或白蛋白封閉液，35-39℃溫浴封閉；
(e)甩干溶液，洗滌液洗滌(三次)，置于4℃中保存。
上述細菌LPS的包被方法中，(a)的優(yōu)選方案為0.5-1.2μg LPS溶解于80-180μl pH9.6含0.3-1％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(包被液)中，并加到預先用殺菌紫外燈照射過20-50分鐘的酶標測定孔中；(b)的優(yōu)選方案為35-39℃溫浴1-2小時；(c)的優(yōu)選條件為4℃放置12-24小時。
使用上述方法提供的一種快速檢測細菌特定LPS的試劑盒，其溶劑和材料包括(a)保存于含0.01-1％疊氮鈉、30-80％甘油的磷酸氫二鈉溶液中的細菌LPS單克隆抗體；(b)過氧化物酶標記的抗LPS單克隆抗體的免疫球蛋白(酶標二抗)；(c)溶解于pH7.4磷酸鹽緩沖液中的標準LPS；(d)稀釋液即含0.05-0.5％明膠和0.01-0.1％吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液；(e)已包被好LPS的酶標測定條。
上面所述試劑盒的(a)中，疊氮鈉和甘油優(yōu)選含量分別為0.05-0.3％和45-60％。上面所述試劑盒的(d)中明膠的優(yōu)選含量為0.1-0.3％。
使用試劑盒時需另行配制的試劑包括(1)洗滌液(pH7.4 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液-0.05％吐溫20)，它含磷酸二氫鉀0.2克磷酸氫二鈉2.9克氯化鈉8.0克吐溫200.5克加雙蒸水至1000毫升(2)pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液甲液檸檬酸(無水)19.2克溶于1000毫升雙蒸水中乙液磷酸氫二鈉(12H2O) 71.6克溶于1000毫升雙蒸水中取甲液24.3毫升，乙液25.7毫升，雙蒸水50毫升混合即成pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液。
(3)底物應(yīng)用液(用時現(xiàn)配)，由下列三種試劑混合而成鄰苯二胺40毫克pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液100毫升30％過氧化氫0.15毫升(4)終止液30毫升濃硫酸加到70毫升雙蒸水中混合而成。
使用上述快速檢測細菌特定脂多糖的試劑盒及另配試劑快速檢測細菌特定脂多糖的方法包括(a)在每測定孔中加入細菌LPS單克隆抗體；(b)將待檢測樣品用稀釋液進行適當?shù)南♂尯蠹尤朊笜藴y定條中，使每孔加入溶液的體積為100μl，對照孔加入細菌LPS單克隆抗體和稀釋液使其體積為100μl，充分混勻；(c)35-39℃溫浴1-2小時；(d)洗滌液洗滌(3-4)次；(e)加入用稀釋液適當稀釋的酶標二抗100μl；(f)35-39℃溫浴0.5-2小時；(g)洗滌液洗滌(3-4)次；(h)加入底物應(yīng)用液100μl，避光顯色15-30分鐘；(I)當對照孔出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)時，加入終止液50μl，立即用酶標儀測定各孔的光吸收值即OD值；(j)結(jié)果判斷各測定孔顯色的顏色深度與待測液中抗原的含量成反比，若待測孔OD值比對照孔的小，則可判定待測孔結(jié)果為陽性；反之則陰性；對檢測樣品進行定量時，取梯度濃度的標準細菌LPS進行檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果，按各測定孔OD值與對照孔OD值的比值繪制標準曲線，根據(jù)測定比值查找待測樣品的抗原含量。
測定中可調(diào)整檢測樣品的濃度，使待測孔OD值與對照孔的OD值比值在0.3-0.8為宜。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁必需的成分，又是重要的致病因子，用免疫學方法對LPS展開研究和進行檢測是一種很常用的方法，應(yīng)用簡便的方法將LPS包埋于酶標測定孔中，會給研究和檢測帶來很大的便利。而LPS檢測試劑盒既可以用于有關(guān)LPS的科學研究中，又可以用于患病動物的檢測中，還可以檢測某些生物制品中，是否污染有特定細菌的LPS。本試劑盒有一定的市場應(yīng)用前景。
細菌LPS的包被方法為(a)0.8μg LPS溶解于100μl pH9.6含1％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(包被液)中，并加到預先用殺菌紫外燈照射過30分鐘的酶標測定孔中；(b)37℃溫浴1時；(c)4℃放置12小時；(d)甩干溶液，加入脫脂奶粉或白蛋白封閉液，37℃溫浴封閉；(e)甩干溶液，洗滌液洗滌三次，置于4℃中保存。
試劑盒包括
(a)保存于含0.1％疊氮鈉、50％甘油的磷酸氫二鈉溶液中的細菌LPS單克隆抗體；(b)過氧化物酶標記的抗LPS單克隆抗體的免疫球蛋白(酶標二抗)；(c)溶解于pH7.4磷酸鹽緩沖液中的標準LPS；(d)稀釋液即含0.3％明膠和0.05％吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液；(e)已包被好LPS的酶標測定條。
另配試劑與技術(shù)內(nèi)容中的一致。
應(yīng)用本試劑盒研究溶藻弧菌在一定的培養(yǎng)條件下LPS是否分泌到細菌培養(yǎng)上清中，應(yīng)用情況如下將溶藻弧菌接種于2.5％NaCl營養(yǎng)培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)，在48小時內(nèi)每隔4小時取樣，離心分離細菌培養(yǎng)上清。取各時期的細菌培養(yǎng)上清50μl，加入溶藻弧菌LPS檢測試劑盒提供的酶標條孔中，每孔再加入50μl稀釋液和1μl鼠抗溶藻弧菌LPS單克隆抗體，充分混勻，按試劑盒使用方法進行檢測，每個測定都作一個平行測定，最后測定出細菌培養(yǎng)上清中沒有可測出的LPS，表明溶藻弧菌在2.5％NaCl營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下其LPS不分泌到細菌培養(yǎng)上清中。
權(quán)利要求
1.一種細菌脂多糖的包被方法，其特征是包括下列步驟(a)0.2-2μg LPS溶解于50-300μl pH9.6含0.02-2％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(包被液)中，并加到預先用殺菌紫外燈照射過10-60分鐘的酶標測定孔中；(b)37℃溫浴30分鐘-4小時；(c)4℃放置2-48小時；(d)甩干溶液，加入脫脂奶粉或白蛋白封閉液，35-39℃溫浴封閉；(e)甩干溶液，洗滌液洗滌，置于4℃中保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細菌脂多糖的包被方法，其特征是(a)的優(yōu)選條件為0.5-1.2μg LPS溶解于80-180μl pH9.6含0.3-1％三氯乙酸的0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(包被液)中，并加到預先用殺菌紫外燈照射過20-50分鐘的酶標測定孔中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細菌脂多糖的包被方法，其特征是(b)的優(yōu)選方案為35-39℃溫浴1-2小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細菌脂多糖的包被方法，其特征是(c)的優(yōu)選條件為4℃放置12-24小時。
5.使用權(quán)利要求1中所述的細菌脂多糖的包被方法提供的檢測細菌特定脂多糖的試劑盒，其特征是溶劑和材料包括(a)保存于含0.01-1％疊氮鈉、30-80％甘油的磷酸氫二鈉溶液中的細菌LPS單克隆抗體；(b)過氧化物酶標記的抗LPS單克隆抗體的免疫球蛋白(酶標二抗)；(c)溶解于pH7.4磷酸鹽緩沖液中的標準LPS；(d)稀釋液即含0.05-0.5％明膠和0.01-0.1％吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液；(e)已包被好LPS的酶標測定條。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的試劑盒，其特征是(a)中，疊氮鈉和甘油優(yōu)選含量分別為0.05-0.3％和45-60％。
7.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的試劑盒，其特征是(d)中明膠的優(yōu)選含量為0.1-0.3％。
8.使用權(quán)利要求5-7中所述的的試劑盒及另配試劑快速檢測細菌特定脂多糖的方法，其特征包括下列步驟(a)在每測定孔中加入細菌LPS單克隆抗體；(b)將待檢測樣品用稀釋液進行適當?shù)南♂尯蠹尤朊笜藴y定條中，使每孔加入溶液的體積為100μl，對照孔加入細菌LPS單克隆抗體和稀釋液使其體積為100μl，充分混勻；(c)35-39℃溫浴1-2小時；(d)洗滌液洗滌；(e)加入用稀釋液適當稀釋的酶標二抗100μl；(f)35-39℃溫浴1-2小時；(g)洗滌液洗滌；(h)加入底物應(yīng)用液100μl，避光顯色15-30分鐘；(I)當對照孔出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)時，加入終止液50μl，立即用酶標儀測定各孔的光吸收值即OD值；(j)結(jié)果判斷各測定孔顯色的顏色深度與待測液中抗原的含量成反比，若待測孔OD值比對照孔的小，則可判定待測孔結(jié)果為陽性；反之則陰性；對檢測樣品進行定量時，取梯度濃度的標準細菌LPS進行檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果，按各測定孔OD值與對照孔OD值的比值繪制標準曲線，根據(jù)測定比值查找待測樣品的抗原含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細菌脂多糖的包被方法,包括:(a)LPS溶解于pH9.6含0.02－2%三氯乙酸的0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(包被液)中,并加到預先用殺菌紫外燈照射過的酶標測定孔中;(b)35－39℃溫浴;(c)4℃放置;(d)甩干溶液,加入脫脂奶粉或白蛋白封閉液,35－39℃溫浴封閉;(e)甩干溶液,洗滌液洗滌,置于4℃中保存。進一步涉及使用這種方法提供的檢測細菌特定脂多糖的試劑盒及使用這種試劑盒快速檢測細菌特定LPS的方法。試劑盒包括(a)細菌LPS單克隆抗體;(b)酶標二抗;(c)標準LPS;(d)稀釋液;(e)已包被好LPS的酶標測定條。本發(fā)明的優(yōu)點是LPS包埋方法和試劑盒簡單,檢測方便。
文檔編號C12Q1/02GK1374526SQ02115040
公開日2002年10月16日 申請日期2002年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月5日
發(fā)明者陳曉燕, 胡超群, 任春華 申請人:中國科學院南海海洋研究所