專(zhuān)利名稱(chēng)：基因重組體的定量檢測(cè)方法和用于該方法的標(biāo)準(zhǔn)分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))檢測(cè)基因重組體的方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種應(yīng)用PCR檢測(cè)對(duì)基因重組體特異的DNA序列的分子生物學(xué)方法。更具體而言，本發(fā)明涉及一種方法，用來(lái)檢測(cè)在含有攜帶不同重組DNA序列的多種基因重組體的群體中可能存在的各種基因重組系的含量比。此外，本發(fā)明還涉及在這種檢測(cè)基因重組體的分子生物學(xué)方法中使用的標(biāo)準(zhǔn)分子。
背景技術(shù)：
利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的基因重組體在全世界的實(shí)際應(yīng)用正在進(jìn)行。作為已經(jīng)實(shí)際應(yīng)用的基因重組體，已知例如以產(chǎn)干擾素細(xì)菌為代表的基因重組微生物和以昆蟲(chóng)抗性玉米為代表的基因重組作物。例如，在以前培育的基因重組作物中曾經(jīng)使用昆蟲(chóng)抗性基因，如來(lái)自蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)的CryIA(b)蛋白編碼區(qū)(下文稱(chēng)為cryIA(b))，或除草劑抗性基因，如膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)蛋白編碼區(qū)(下文稱(chēng)為pat)。在這些情況中，這些轉(zhuǎn)基因作為與各種DNA序列結(jié)合的表達(dá)單位被導(dǎo)入，使得該轉(zhuǎn)基因能在作物中表達(dá)。
能夠使用的DNA序列包括來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(下文稱(chēng)為CaMV35S啟動(dòng)子)，來(lái)自玉米的磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPC)基因啟動(dòng)子，來(lái)自玉米的鈣依賴(lài)蛋白激酶(CDPK)啟動(dòng)子；內(nèi)含子，如含有玉米乙醇脫氫酶1S基因第6個(gè)內(nèi)含子(Adh1-S IVS6)的區(qū)域，含有玉米乙醇脫氫酶1S基因第2個(gè)內(nèi)含子(Adh1-S IVS2)的區(qū)域，PEPC的第9個(gè)內(nèi)含子(PEPC#9)，或來(lái)自玉米的熱休克蛋白70(hsp70)的內(nèi)含子區(qū)；以及終止子，如來(lái)自根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂氨酸合成酶終止子(下文稱(chēng)為NOS終止子)或來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S終止子。對(duì)于玉米，實(shí)際商業(yè)銷(xiāo)售的基因重組作物包括，例如Novartis的Bt11系的子代品種、Novartis的Event176的子代品種、Monsanto的MON810系的子代品種、Monsanto的GA21系的子代品種，和Aventis的T25系的子代品種。對(duì)于大豆，包括，例如Roundup ReadySoy系的子代品種。向這些品種內(nèi)導(dǎo)入的DNA的構(gòu)建如
圖1所示。
通常研制一種基因重組體，是為了與初始生物相比，給初始生物賦予工業(yè)優(yōu)選的特性。用于這一目的的主要方法是從固有地顯示該特性的生物中分離表達(dá)該特性的基因，并將該基因?qū)肽康纳镏?，使得該基因能在該生物中表達(dá)。因此，來(lái)自基因重組體的DNA包括已經(jīng)導(dǎo)入該重組體內(nèi)的這些重組DNA序列。
例如，已經(jīng)培育了基因重組作物，它們被賦予作為農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)選特性，如昆蟲(chóng)抗性和除草劑抗性等，這些作物的生產(chǎn)方法是，以基因能夠在作物中表達(dá)的形式將負(fù)責(zé)昆蟲(chóng)抗性或除草劑抗性等的基因?qū)朐魑镏?。因此，?lái)自基因重組體的DNA包括已經(jīng)導(dǎo)入該重組體內(nèi)的這些重組DNA序列。
然而，在這些作物實(shí)際商品化時(shí)，這些作物可能是基因重組作物的子代雜種。因此，應(yīng)當(dāng)證實(shí)導(dǎo)入的DNA序列在這些作物中穩(wěn)定存在。
另外，歐盟(EU)已經(jīng)頒布了關(guān)于標(biāo)注基因重組體和由它們生產(chǎn)的加工食品的法規(guī)(法規(guī)(EC)號(hào)EC/258/97，委員會(huì)法規(guī)(EC)號(hào)1139/98)，日本也頒布了關(guān)于標(biāo)注基因重組體和由它們生產(chǎn)的加工食品的法規(guī)，這使得食品工業(yè)及其相關(guān)領(lǐng)域需要關(guān)于作物或食品中重組體的存在及含量的信息。
因此需要一種技術(shù)，它可測(cè)定食品、飼料及其來(lái)源作物中基因重組體的存在或含量，特別是在原料中的含量比。當(dāng)預(yù)計(jì)含有多種基因重組系時(shí)，希望有一種技術(shù)能分別檢測(cè)它們，并能確定每個(gè)系的含量比，也就是說(shuō)，希望發(fā)展一種高靈敏度的實(shí)用定量技術(shù)，來(lái)檢測(cè)基因重組體的各個(gè)系。
雖然有許多報(bào)告表明，為了檢測(cè)基因重組體，使用應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的分子生物學(xué)技術(shù)是有利的(Science Vol.230，1350-1354(1985)，Science Vol.239，487-491(1988))，但是這些技術(shù)只能定性地確定基因重組體的存在與否，而無(wú)法獲得關(guān)于樣品中所含基因重組體的含量比的信息(參見(jiàn)，例如Z.Lebensm Unters Forsch A.，Vol.203，339-344(1996)，Mitt.Gebiete Lebensm.Hyg.，Vol.87，307-367(1996)，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.93，Jahrg.，Heft2，35-38(1997)，Z.Lebensm Unters Forsch A.，Vol.205，442-445(1997)，Zeitschrift fur Ernahrungwissenscaft Vol.36，155-160(1997)、BGVV Hefte 1，115-117(1997)、Mitt.Gebiete Lebensm.Hyg.，Vol.88，164-175(1997)，Mitt.Gebiete Lebensm.Hyg.，Vol.88，515-524(1997)、Food Additives and Contaminants，Vol.15，No.7，767-774(1998)、Lebensm.-Wiss.u.-Technol.，Vol.31，664-667(1998)、Z.Lebensm Unters Forsch A.，Vol.206，203-207(1998)、Z.Lebensm Unters Forsch A.，Vol.206，237-242(1998)，Z.LebensmUnters Forsch A.，Vol.207，264-267(1998)、BioSci.Biotecnol.Biochem.Vol.62，No.7，1461-1464(1998)，DeutscheLebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft 2，44-48(1999)，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft 2，48-51(1999)，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft2，52-56(1999)，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft 7，275-278(1999)，Journal of AOAC InternationalVol.82，No.4，923-928(1999)，GIT Labor-Fachzetschrift，2/99，156-160(1999)、Bio Industry Vol.16，No.4，17-21(1999)，Eur.Food Res.Technol.Vol.209，77-82(1999)，Analytica Chimica ActaVol.393，177-179(1999)，F(xiàn)ood Control Vol.10，339-349(1999)，Journal of Agricultural and Food Chemistry，Vol.47，No.12，5038-5043(1999)，Journal of Food Hygienic Society of Japan，Vol.41，No.2，137-143(2000))。
也有幾篇報(bào)道是關(guān)于能夠提供樣品中所含各基因重組體的含量比的信息的已知技術(shù)，例如關(guān)于定量測(cè)定大豆和玉米的重組DNA序列的技術(shù)的報(bào)道。
例如，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft2，57-59(1999)和Eur.Food.Res.Technol，Vol.209，83-87(1999)報(bào)道了應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性PCR對(duì)大豆的定量檢測(cè)技術(shù)。然而，這些技術(shù)只限于基因重組大豆的一個(gè)系。而且，由于采用競(jìng)爭(zhēng)性PCR，定量的精確度相對(duì)較低，因?yàn)樗鼈儾皇褂脙?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，從樣品中提取的DNA溶液的純度和產(chǎn)量影響了定量結(jié)果。
Z.Lebensm Unters Forsch A，Vol.207，No.3，207-213(1998)也報(bào)道了應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性PCR對(duì)基因重組玉米的定量檢測(cè)技術(shù)，但是檢測(cè)的目標(biāo)也只限于基因重組玉米的一個(gè)系，這與上述情況類(lèi)似。此外，與上述情況類(lèi)似，競(jìng)爭(zhēng)性PCR和缺乏內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)也使得定量結(jié)果的可靠性不夠。
Food Control Vol.10，353-358(1999)報(bào)道了應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性PCR對(duì)基因重組玉米和基因重組大豆的定量檢測(cè)技術(shù)，但是這兩種技術(shù)分別只限于一個(gè)系。而且，如上所述，使用競(jìng)爭(zhēng)性PCR和缺乏內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)使得定量結(jié)果的可靠性不夠。
眾所周知使用熒光探針等的定量PCR(也稱(chēng)為實(shí)時(shí)PCR或在線PCR等)是在定量精確度上優(yōu)于競(jìng)爭(zhēng)性PCR的一種定量分析。有幾篇報(bào)道是關(guān)于應(yīng)用定量PCR對(duì)重組DNA序列的定量檢測(cè)技術(shù)。
例如，Journal of Agricultural and Food Chemistry，Vol.47，No.12，5261-5266(1999)報(bào)道，重組大豆和玉米的定量能用熒光探針通過(guò)定量PCR進(jìn)行。在該報(bào)道中采用了內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)程序，這提高了定量結(jié)果的可靠性。然而，檢測(cè)目標(biāo)只是基因重組大豆的一個(gè)系，也是基因重組玉米的一個(gè)系。
Food Control Vol.10，385-389(1999)也報(bào)道了兩種技術(shù)利用熒光探針的定量PCR對(duì)基因重組大豆的定量檢測(cè)技術(shù)，和利用競(jìng)爭(zhēng)性PCR對(duì)基因重組大豆的定量檢測(cè)技術(shù)。在這些報(bào)道中也采用了內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)程序，這提高了定量結(jié)果的可靠性。與上述報(bào)道不同，用含有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)DNA序列的質(zhì)粒DNA和含有待測(cè)靶DNA序列的質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)分子。然而，由于這兩種質(zhì)粒DNA是分開(kāi)提供的，因此稀釋質(zhì)粒DNA的方法和加入反應(yīng)系統(tǒng)中的質(zhì)粒DNA的量仍有可能影響定量結(jié)果。檢測(cè)目標(biāo)也僅限于基因重組大豆的一個(gè)系。Chemie in Labor und Biotechnik.Vol.50，Jahrg.，Heft 1，6-8(1999)類(lèi)似于上述報(bào)道。
此外，由于可購(gòu)到的作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基因重組體只是玉米的兩個(gè)系和大豆的一個(gè)系，所以分析者分析其它系非常困難。
也曾經(jīng)報(bào)道了一種定量測(cè)定基因重組體含量的技術(shù)，它是利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定由重組DNA序列表達(dá)的蛋白質(zhì)，但是該技術(shù)也是對(duì)一種特定系的定量技術(shù)。
發(fā)明概述如上所述，以前報(bào)道的對(duì)基因重組體的定量檢測(cè)技術(shù)只能定量檢測(cè)有限的系，或者缺乏定量精確性。
另一方面，當(dāng)只用該技術(shù)檢測(cè)這些系中的特定一種時(shí)，定量測(cè)定樣品中基因重組體的含量比非常困難，因?yàn)槌Ｒ?guī)銷(xiāo)售的作物在銷(xiāo)售過(guò)程中不同品種混合在一起。例如，日本銷(xiāo)售的基因重組玉米系到2000年7月為止多達(dá)7個(gè)系。因此，如果只能定量測(cè)定樣品中基因重組玉米的一個(gè)特定系，這種分析是不夠的。因此，可以認(rèn)為，應(yīng)該注意，作為一種定量分析方法，只能檢測(cè)一個(gè)特定系的技術(shù)以及缺乏定量精確性的技術(shù)是不夠的，缺乏實(shí)用價(jià)值。
限制可檢測(cè)目標(biāo)系數(shù)量的因素之一是試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)供應(yīng)不足。獲得只含有基因重組體一個(gè)特定系而不含其它任何系的純標(biāo)準(zhǔn)樣品非常困難。當(dāng)前作為標(biāo)準(zhǔn)樣品提供給分析者的基因重組體只是玉米的兩個(gè)系和大豆的一個(gè)系。實(shí)際上，在以上提到的關(guān)于定量檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道中，所有靶標(biāo)只限于能夠獲得各自標(biāo)準(zhǔn)樣品的靶標(biāo)(在上述參考文獻(xiàn)中也已提到，例如，F(xiàn)ood Control Vol.10，385-389(1999))。也就是說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)樣品可獲得性差使上述檢測(cè)技術(shù)的適用性受到限制。
另外，由于在基因重組體的每個(gè)系中，每個(gè)基因組導(dǎo)入的重組DNA序列的類(lèi)型和拷貝數(shù)在系與系之間不同，如果假定樣品中只含有特定的系進(jìn)行分析，而不考慮這些差異的影響，則有可能獲得與基因重組體的實(shí)際含量比相距甚遠(yuǎn)的結(jié)果。因此，即使提供所有基因重組系作為分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品，也不能認(rèn)為這些技術(shù)是對(duì)基因重組體的有效定量檢測(cè)技術(shù)，除非找到方法來(lái)考慮系與系之間重組DNA序列的多樣性。
如上所述，希望開(kāi)發(fā)一種對(duì)基因重組體的靈敏、定量的有效檢測(cè)技術(shù)，已在積極嘗試這種開(kāi)發(fā)，但是由于常規(guī)的銷(xiāo)售方式、標(biāo)準(zhǔn)樣品的可獲得性差和系與系之間重組DNA序列的多樣性，對(duì)重組DNA序列和/或基因重組體的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和普及比較困難。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)基因重組體的分子生物學(xué)方法，其中，通過(guò)嚴(yán)格考慮多種基因重組系之間重組DNA序列的多樣性，能定量測(cè)定含有多系基因重組體的群體中基因重組體的精確總含量比。
特別是，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)基因重組體的分子生物學(xué)方法，其中，通過(guò)嚴(yán)格考慮多種基因重組體之間重組DNA序列的多樣性，能定量測(cè)定含有多個(gè)系的基因重組體的群體中每種基因重組體的分別的精確含量比。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種重組DNA分子作為上述定量檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)樣品，該分子尤其具有能夠無(wú)限供應(yīng)的特性，其中設(shè)計(jì)該分子，使得通過(guò)嚴(yán)格考慮多種基因重組系之間重組DNA序列的多樣性，能夠進(jìn)行定量測(cè)定。
本發(fā)明的發(fā)明人生產(chǎn)了一種在單個(gè)分子上含有5條基因重組玉米系特異的DNA序列、兩條常用于基因重組體但不是系特異的DNA序列和另外一條內(nèi)源玉米基因的DNA序列的分子，一種在單個(gè)分子上含有一條基因重組大豆系特異的DNA序列和一條內(nèi)源大豆基因的DNA序列的分子，和一種在單個(gè)分子上含有一條基因重組大豆系特異的DNA序列、一條內(nèi)源大豆基因的DNA序列和兩條常用于基因重組體但不是系特異的DNA序列的分子，并且發(fā)現(xiàn)，在PCR中使用這些分子作為標(biāo)準(zhǔn)分子能顯著改進(jìn)以前的定性和定量檢測(cè)方法，這使得發(fā)明人能夠建立本發(fā)明。
因此，本發(fā)明是一種定量檢測(cè)方法，用于定量測(cè)定至少含有一種基因重組系的樣品中基因重組體的含量比，該方法包括(i)對(duì)來(lái)源于樣品中基因重組體的DNA樣品中可能存在的基因重組體特異的DNA序列進(jìn)行定量PCR，并對(duì)對(duì)應(yīng)于該基因重組體的物種所共有的內(nèi)源DNA序列進(jìn)行定量PCR，其中使用一種在單個(gè)分子上含有該基因重組體特異的DNA序列和該內(nèi)源DNA序列的分子作為標(biāo)準(zhǔn)分子。
(ii)根據(jù)定量PCR的結(jié)果，確定樣品中基因重組體特異的DNA序列的數(shù)量；(iii)根據(jù)定量PCR的結(jié)果，確定樣品中內(nèi)源DNA序列的數(shù)量；和(iv)根據(jù)式(I)確定基因重組體的含量比(樣品中基因重組體的含量比)＝100×[(樣品中基因重組體特異的DNA序列的分子數(shù))/(樣品中內(nèi)源DNA序列的分子數(shù))]/(定量比)(％)(I)其中，定量比是根據(jù)式(II)預(yù)先計(jì)算的值中的任何一種(定量比)(％)＝(來(lái)自單個(gè)基因重組系的基因重組體特異的DNA序列的分子數(shù))/(該基因重組體中所述內(nèi)源DNA序列的分子數(shù))(II)更具體而言，本發(fā)明是一種定量檢測(cè)方法，用于定量測(cè)定至少含有一種基因重組系的樣品中各基因重組體的分別的含量比，該方法包括(i)對(duì)來(lái)自樣品中基因重組體的DNA樣品中可能存在的單個(gè)基因重組系特異的DNA序列進(jìn)行定量PCR，并對(duì)對(duì)應(yīng)于基因重組體的物種所共有的內(nèi)源DNA序列進(jìn)行定量PCR，其中利用一種在單個(gè)分子上含有該單個(gè)基因重組系特異的DNA序列和該內(nèi)源DNA序列的分子作為標(biāo)準(zhǔn)分子；(ii)根據(jù)所述定量PCR的結(jié)果，確定樣品中該單個(gè)基因重組系特異的DNA序列的數(shù)量；(iii)根據(jù)定量PCR的結(jié)果，確定樣品中所述內(nèi)源DNA序列的數(shù)量；和(iv)根據(jù)式(III)確定該基因重組體的含量比(樣品中單個(gè)基因重組系的含量比)＝100×[(樣品中對(duì)應(yīng)于每種基因重組體的DNA序列的分子數(shù))/(樣品中所述內(nèi)源DNA序列的分子數(shù))]/(定量比)(％) (III)其中，定量比根據(jù)上述式(II)計(jì)算。
本發(fā)明的重組DNA分子是這樣一種重組DNA分子，其特征在于，它在單個(gè)分子上含有一條基因重組系特異的DNA序列和至少一條對(duì)應(yīng)于基因重組體的物種所共有的內(nèi)源DNA序列。本發(fā)明的DNA分子尤其是這樣一種重組DNA分子，其特征在于，它在單個(gè)分子上含有兩條或兩條以上分別對(duì)于基因重組體的各個(gè)系特異的DNA序列，和至少一條對(duì)應(yīng)于所述基因重組體的兩種或多種非重組體所共有的內(nèi)源DNA序列。
附圖簡(jiǎn)述圖1分別顯示導(dǎo)入各基因重組系內(nèi)的重組DNA序列的構(gòu)建，以及為分子生物學(xué)分析設(shè)計(jì)的引物的位置。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增各基因重組系特異的DNA序列的引物對(duì)，使其能擴(kuò)增涵蓋多個(gè)DNA序列的區(qū)域。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增不是系特異的但是常用于基因重組體的DNA序列的引物對(duì)，使其能與所有相應(yīng)的系反應(yīng)。
圖2顯示使用為檢測(cè)T25系子代品種設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行特異性驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果。除了T25系的子代品種之外，從其他樣品中提取的DNA未觀察到擴(kuò)增反應(yīng)，只有從T25系的子代品種中提取的DNA觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量與設(shè)計(jì)分子量一致。
圖3顯示使用為檢測(cè)NOS終止子設(shè)計(jì)的引物對(duì)和探針進(jìn)行特異性驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)用11種DNA模板進(jìn)行。如從圖1中所見(jiàn)，向Bt11系的子代品種、Event176系的子代品種、Roundup Ready Soy系的子代品種中導(dǎo)入了NOS終止子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有從這3個(gè)品種中提取的模板DNA才觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)其它模板DNA進(jìn)行反應(yīng)時(shí)未觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物，這證實(shí)了設(shè)計(jì)的特異性。
圖4顯示組合PCR產(chǎn)物的方法的圖示。
圖5顯示用于玉米的標(biāo)準(zhǔn)分子的核苷酸序列。圖中顯示了每個(gè)擴(kuò)增靶標(biāo)在組合的DNA序列中的位置。圖中也顯示了實(shí)驗(yàn)中使用的引物和探針的結(jié)合區(qū)。
圖6顯示用于玉米的另一種標(biāo)準(zhǔn)分子的核苷酸序列。圖中顯示了每個(gè)擴(kuò)增靶標(biāo)在組合的DNA序列中的位置。圖中也顯示了實(shí)驗(yàn)中使用的引物和探針的結(jié)合區(qū)。
圖7顯示質(zhì)粒pMul4和pMul5的圖示。對(duì)于pMul4，將圖5所示的DNA插入載體中。對(duì)于pMul5，將圖6所示的DNA序列插入載體中。
圖8顯示用于大豆的標(biāo)準(zhǔn)分子的核苷酸序列。圖中顯示了每個(gè)擴(kuò)增靶標(biāo)在組合的DNA序列中的位置。圖中也顯示了實(shí)驗(yàn)中使用的引物和探針的結(jié)合區(qū)。
圖9顯示用于大豆的另一種標(biāo)準(zhǔn)分子的核苷酸序列。圖中顯示了每個(gè)擴(kuò)增靶標(biāo)在組合的DNA序列中的位置。圖中也顯示了實(shí)驗(yàn)中使用的引物和探針的結(jié)合區(qū)。
圖10顯示質(zhì)粒pMulSL的圖示。導(dǎo)入載體中的序列是圖8所示的DNA序列。
圖11顯示質(zhì)粒pMulSL2的圖示。導(dǎo)入載體中的序列是圖9所示的DNA序列。
圖12證實(shí)了雙盲玉米樣品中所含的基因重組玉米。檢測(cè)到了Bt11系的子代品種(A)和GA21系和MON810系的子代品種(B)。用pMul4的BamHI消化產(chǎn)物作為對(duì)照。
圖13顯示證實(shí)定量比的結(jié)果，方法包括用從一種玉米種子中提取的DNA進(jìn)行PCR，并根據(jù)式(II)計(jì)算定量比。圖中箭頭所指為可以顯示T25系子代品種的F1種子的預(yù)測(cè)值。
圖14顯示定量PCR期間玉米標(biāo)準(zhǔn)重組DNA序列的圖(循環(huán)次數(shù)-熒光強(qiáng)度)。
圖15顯示通過(guò)對(duì)玉米標(biāo)準(zhǔn)重組DNA序列進(jìn)行定量PCR獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)源于圖14。
圖16顯示證實(shí)定量比的結(jié)果，方法包括用從一種大豆種子中提取的DNA進(jìn)行PCR，并根據(jù)式(II)計(jì)算定量比。
發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案在下列描述中以基因重組作物作為基因重組體的例子說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明的應(yīng)用不只限于作物，本發(fā)明不排除其它基因重組體，包括基因重組動(dòng)物、植物、微生物等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用來(lái)自待測(cè)植物的核酸通過(guò)PCR方法檢測(cè)重組DNA序列，以特異地檢測(cè)不同基因重組體。因此，需要設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)基因重組系特異的DNA序列的引物對(duì)、用來(lái)檢測(cè)不是系特異的但常用于基因重組體的DNA序列的引物對(duì)和用來(lái)檢測(cè)作物(可以是基因重組體或是非重組體)特異的DNA序列的引物對(duì)。
待測(cè)植物樣品可以是可從中提取核酸(如基因組DNA)的任何樣品，包括原種、干種、加工的物質(zhì)，如粗玉米粉和大豆粉。這些樣品必要時(shí)可在磨碎后使用。
根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)重組DNA序列的分子數(shù)、內(nèi)源基因的分子數(shù)和計(jì)算的樣品中單種基因重組體的定量比，能測(cè)定可能含有一種或兩種或兩種以上基因重組系的樣品中基因重組體的含量比，特別是單種基因重組體的含量比。
根據(jù)本發(fā)明，基因重組體的含量比按下列程序計(jì)算(i)用一種在單個(gè)分子上含有樣品中可能存在的基因重組體特異的DNA序列和對(duì)應(yīng)于該基因重組體的物種所共有的內(nèi)源DNA序列的分子作為標(biāo)準(zhǔn)分子，進(jìn)行定量PCR；(ii)根據(jù)定量PCR的結(jié)果，確定樣品中基因重組體特異的DNA序列的數(shù)量；(iii)根據(jù)定量PCR的結(jié)果，確定樣品中所述內(nèi)源DNA序列的數(shù)量；和(iv)根據(jù)式(I)確定基因重組體的含量比(樣品中基因重組體的含量比)＝100×[(樣品中基因重組體特異的DNA序列的分子數(shù))/(樣品中所述內(nèi)源DNA序列的分子數(shù))]/(定量比)(％) (I)其中，定量比是根據(jù)式(II)預(yù)先計(jì)算的值中的任何一種(定量比)(％)＝100×(對(duì)來(lái)自單個(gè)基因重組系的基因重組體特異的DNA序列的分子數(shù))/(該基因重組體中所述內(nèi)源DNA序列的分子數(shù))(II)
特別是，當(dāng)確定每種基因重組體的分別的含量比時(shí)，可以用式(III)代替式(I)(樣品中單個(gè)基因重組系的含量比)＝100×[(樣品中對(duì)該單種基因重組體特異的DNA序列的分子數(shù))/(樣品中所述內(nèi)源DNA序列的分子數(shù))]/(定量比)(％) (III)本文中術(shù)語(yǔ)“DNA序列”和“DNA序列或其部分區(qū)域”可互換使用。因此，例如，“基因重組系特異的DNA序列”是指均對(duì)所述基因重組系特異的全長(zhǎng)DNA或者至少是它的一個(gè)部分區(qū)域。在本文其它部分同樣如此。這也適用于“基因序列”的含意。
術(shù)語(yǔ)“基因重組體”包括已經(jīng)導(dǎo)入外源基因的整個(gè)生物，或已經(jīng)導(dǎo)入外源基因的生物的一部分，例如這些生物的器官、組織外植體、細(xì)胞(包括培養(yǎng)細(xì)胞)、種子、花粉或胚。
術(shù)語(yǔ)“定量PCR”通常是指利用PCR定量測(cè)定在擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的模板DNA的一系列反應(yīng)。定量PCR包括使用內(nèi)源序列作為標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法和使用與擴(kuò)增反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)的分子的競(jìng)爭(zhēng)法。在本發(fā)明中使用內(nèi)部法和PCR，在反應(yīng)過(guò)程中隨時(shí)監(jiān)測(cè)稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)分子并作為精確、容易地測(cè)定每種序列分子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)的模板DNA，和反應(yīng)的進(jìn)展，即擴(kuò)增程度。因此，本文中“定量PCR”是指用于定量測(cè)定在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的模板DNA含量的PCR，其中在反應(yīng)中能隨時(shí)監(jiān)測(cè)被擴(kuò)增靶分子的擴(kuò)增。為了定量，通常將這種PCR與標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合，標(biāo)準(zhǔn)曲線能將反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的DNA分子數(shù)與表明分子擴(kuò)增程度的信號(hào)相關(guān)聯(lián)。利用含量已知的標(biāo)準(zhǔn)分子能生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在本發(fā)明中可以使用的樣品DNA、引物、探針、PCR條件和重組DNA分子數(shù)、內(nèi)源基因分子數(shù)和計(jì)算定量比的方法將在下文詳細(xì)描述。
來(lái)自待測(cè)植物的核酸優(yōu)選地是來(lái)自待測(cè)植物的基因組DNA。從待測(cè)植物中提取核酸的方法沒(méi)有限制，可采用從待測(cè)植物樣品中提取核酸的任何方法，只要能夠獲得用于PCR的足夠的質(zhì)量。例如，可以使用市售的試劑盒，如QIAGEN Plant Maxi試劑盒(QIAGEN GmbH)。另外，這些方法必要時(shí)也可加以修改。
利用這些方法提取的核酸優(yōu)選地以適于在PCR中作為模板的形式保存，例如，以溶于緩沖液的溶液形式保存。獲得的核酸的純度可用已知的方法估計(jì)，例如測(cè)定230nm、260nm和280nm的吸光度。這樣，為進(jìn)行PCR方法，260nm/230nm比大于2且260nm/280nm比為1.8-2是優(yōu)選的。
為了證實(shí)制備的DNA溶液純化到足以進(jìn)行PCR并且不被降解，可以利用對(duì)應(yīng)于內(nèi)源基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
利用從待測(cè)植物中這樣獲得的核酸進(jìn)行PCR。PCR中使用的引物是能夠擴(kuò)增含有完整重組DNA序列或其部分的區(qū)域的引物對(duì)。應(yīng)用這些引物，根據(jù)重組DNA序列的結(jié)構(gòu)特異地檢測(cè)重組DNA序列是可能的?？梢愿鶕?jù)將要檢測(cè)的基因重組體如下所述設(shè)計(jì)這些引物對(duì)。
將要檢測(cè)的靶基因重組體可以是上述任何基因重組體，其類(lèi)型沒(méi)有限制。任何一種基因重組體都有可能是檢測(cè)的靶標(biāo)，只要導(dǎo)入的DNA序列的結(jié)構(gòu)確定。這種基因重組體可以不只限于進(jìn)行基因?qū)氲囊淮?，而可能是其子代的一個(gè)品種。
首先，應(yīng)當(dāng)獲得待測(cè)基因重組體中所含的重組DNA的核苷酸序列。該核苷酸序列不必是重組DNA的完整序列，也可以是位于目標(biāo)區(qū)附近的核苷酸序列。這些核苷酸序列中的許多可以在已知的文獻(xiàn)中獲得。即使該核苷酸序列不能從已知的文獻(xiàn)中獲得，只要可以得到部分核苷酸序列的信息，也能通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得該序列。在設(shè)計(jì)系特異的引物對(duì)時(shí)，通過(guò)選擇涵蓋多種DNA序列的區(qū)域(例如，從CaMV 35S啟動(dòng)子延伸到cryIA(b)的區(qū)域)，可以容易地選擇高特異性的引物對(duì)。每個(gè)引物對(duì)可以是如下任何一種引物對(duì)，只要它能特異地?cái)U(kuò)增靶DNA序列，但是優(yōu)選的是，擴(kuò)增的片段為80bp-200bp，每條引物的GC含量為40％-60％，更加優(yōu)選的是，每條引物不形成分子內(nèi)高等級(jí)結(jié)構(gòu)，并且不形成3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)核苷酸的堿基配對(duì)。
例如，當(dāng)旨在特異、分別地檢測(cè)Bt11系的子代品種、Event176系的子代品種、MON810系的子代品種、GA21系的子代品種、T25系的子代品種或Roundup Ready Soy系的子代品種時(shí)，可以根據(jù)圖1所示的區(qū)域設(shè)計(jì)引物。
同樣眾所周知，在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在、用引物擴(kuò)增的擴(kuò)增區(qū)域的數(shù)量能用定量PCR方法定量。已知幾種定量PCR方法，但在許多情況下需要制備與引物對(duì)所包括的區(qū)域互補(bǔ)的探針。該探針可以是產(chǎn)生與擴(kuò)增產(chǎn)生的分子數(shù)相應(yīng)的信號(hào)的任何一種探針，例如，在PCR中適于檢測(cè)DNA雙鏈形成或從雙鏈到單鏈的解離反應(yīng)或核酸延伸反應(yīng)的物質(zhì)。熒光標(biāo)記的核酸通常用作探針。具體而言，優(yōu)選地，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，在聚合酶延伸反應(yīng)采用的條件下，探針可以與模板DNA特異雜交，并且可導(dǎo)致熒光強(qiáng)度根據(jù)DNA鏈的延伸(即模板DNA的擴(kuò)增)而改變，這些變化優(yōu)選地表明擴(kuò)增的程度，更優(yōu)選地，根據(jù)模板DNA的擴(kuò)增，探針降解，釋放出熒光團(tuán)，這使得反應(yīng)混合物中的熒光強(qiáng)度增加，而且熒光強(qiáng)度的增加優(yōu)選地是擴(kuò)增程度的指標(biāo)。利用這些探針，可以容易地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR中擴(kuò)增的進(jìn)展。這些熒光標(biāo)記的探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的，也可以合成具有這種性質(zhì)的合適的熒光探針。另外，該探針優(yōu)選地具有比相應(yīng)引物對(duì)約高10℃的Tm值，探針的全長(zhǎng)優(yōu)選地為約18個(gè)核苷酸至約25個(gè)核苷酸，并且該探針在其末端不含G。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，使用這樣一種探針，該探針隨著擴(kuò)增的進(jìn)展而降解，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加，熒光強(qiáng)度的增加是擴(kuò)增的指示。
可以用來(lái)自待測(cè)植物樣品的核酸作為模板，使用如上所述設(shè)計(jì)的引物對(duì)，進(jìn)行定量PCR。此外，也能用來(lái)自待測(cè)植物樣品的核酸作為模板，使用這樣設(shè)計(jì)的引物對(duì)和探針，進(jìn)行定量PCR。對(duì)反應(yīng)混合物沒(méi)有任何限制，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員能容易地制備反應(yīng)混合物。例如，可用適量的模板核酸、引物對(duì)、PCR緩沖溶液、dNTP、氯化鎂、DNA聚合酶等制備反應(yīng)混合物。例如，可使用從樣品中提取的約50ng DNA，在25μl總體積中以約0.2-0.5μM的終引物濃度進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)PCR條件也沒(méi)有限制，可如下進(jìn)行在95℃下保持10分鐘，95℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒共40個(gè)循環(huán)，在40個(gè)循環(huán)后在72℃下保持7分鐘，然后保持于4℃。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地優(yōu)化該條件，可任選地改變溫度和每個(gè)步驟的時(shí)間。而且，這種反應(yīng)可用眾所周知的設(shè)備進(jìn)行。
通過(guò)進(jìn)行定量PCR能獲得樣品中重組DNA的分子數(shù)。對(duì)于定量PCR，眾所周知，通過(guò)測(cè)定將要擴(kuò)增的靶DNA序列的初始含量獲得的數(shù)值不總是直接說(shuō)明基因重組體的含量。例如，如圖1所示，由于導(dǎo)入基因重組體內(nèi)的DNA序列在系與系之間高度不同，而且每種基因重組體的每個(gè)植物基因組的拷貝數(shù)具有多樣性，因此不能簡(jiǎn)單地計(jì)算含量比。例如，cryIA(b)的編碼區(qū)被導(dǎo)入了Event176系和Bt11系以及MON810系中，研究者報(bào)道，已經(jīng)將2個(gè)或多個(gè)拷貝導(dǎo)入Event176中，將1個(gè)拷貝導(dǎo)入了Bt11中，至少1個(gè)拷貝導(dǎo)入了MON810中。另外，PCR可能被反應(yīng)系統(tǒng)中的污染物所抑制。
根據(jù)本發(fā)明，重組DNA序列的分子數(shù)如下確定通過(guò)用已知含量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量PCR以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品進(jìn)行類(lèi)似的定量PCR，用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定分子數(shù)。
內(nèi)源序列的分子數(shù)可以用類(lèi)似的方法確定。另一方面，對(duì)于純基因重組體，通過(guò)定量PCR預(yù)先測(cè)定基因重組體中DNA序列的分子數(shù)和內(nèi)部DNA序列的分子數(shù)，以將這些測(cè)定值之比定義為“定量比”。由于定量比代表取決于已經(jīng)導(dǎo)入每種基因重組體內(nèi)的重組DNA序列的數(shù)量和類(lèi)型的唯一值，通過(guò)用式(1)將定量值轉(zhuǎn)化為基因重組體的含量比，嚴(yán)格考慮系與系之間重組DNA序列的多樣性。根據(jù)本發(fā)明，例如，由于反應(yīng)系統(tǒng)本身的干擾因素(如樣品DNA溶液中可能含有的PCR抑制劑和DNA提取過(guò)程中產(chǎn)量的差異)引起的測(cè)定值的誤差將有可能避免。
優(yōu)選地對(duì)樣品中可能含有的所有基因重組體的每一種計(jì)算定量比，但是只獲得其中一部分的定量比也是可以接受的。一旦獲得定量比值，即能利用定量比值作為系數(shù)，根據(jù)將要擴(kuò)增的靶DNA序列的初始含量，和反應(yīng)開(kāi)始時(shí)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)序列的初始含量，獲得初始樣品中基因重組體的含量比，因?yàn)槎勘戎祵?duì)于將要PCR擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)和基因重組系是唯一的。
這種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)可以是，例如玉米共有的特定內(nèi)部DNA序列，特別是內(nèi)部基因序列，大豆共有的特定內(nèi)部DNA序列，特別是內(nèi)部基因序列或人工構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子。
適用于本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)分子是如下的重組DNA分子，它在單個(gè)分子上含有至少一種對(duì)至少一種、優(yōu)選地兩種或兩種以上的基因重組系特異的重組DNA序列，和至少一種對(duì)應(yīng)于該重組體的物種所共有的內(nèi)部DNA序列。本發(fā)明也可以使用這樣的重組DNA分子，它在單個(gè)分子上含有至少一種對(duì)各基因重組系非特異的但是常用于基因重組體的重組DNA，和至少一種相應(yīng)的物種所共有的內(nèi)部DNA序列。該重組DNA分子除上述序列外，還可含有用于在合適宿主中復(fù)制的不同序列或用于篩選攜帶標(biāo)準(zhǔn)分子的宿主的標(biāo)記基因。利用合適的限制酶或通過(guò)PCR擴(kuò)增分子的一部分，也能從重組DNA分子中獲得可用作標(biāo)準(zhǔn)分子的最小區(qū)。然而，根據(jù)本發(fā)明的重組DNA分子應(yīng)當(dāng)具有易于控制進(jìn)行PCR的分子數(shù)的特征。例如，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的完整核苷酸序列已知或者分子量已知時(shí)，能夠控制用于進(jìn)行PCR的分子數(shù)。必要時(shí)可測(cè)定重組DNA分子的核苷酸序列或分子量。
如上所述，例如，可使用玉米共有的特異內(nèi)部基因序列或其部分，或大豆共有的特異內(nèi)部基因序列或其部分，作為內(nèi)部DNA序列。例如，可以使用CaMV 35S啟動(dòng)子序列、Nos終止子序列及其部分作為基因重組體所共有的重組DNA序列。例如，可以使用來(lái)自已導(dǎo)入每個(gè)系中的單個(gè)基因的DNA序列作為單個(gè)重組系特異的DNA序列。
這種標(biāo)準(zhǔn)分子可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建。例如，通過(guò)用具尾引物連續(xù)克隆限制片段或重復(fù)組合PCR產(chǎn)物，可以構(gòu)建該分子。該分子優(yōu)選地構(gòu)建為一種能夠在合適的宿主(如微生物、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞)中自主復(fù)制的重組DNA分子。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建為質(zhì)粒時(shí)，優(yōu)選地使用限制酶切割后的線性分子，因?yàn)槌菪男纬煽梢允筆CR反應(yīng)系統(tǒng)不穩(wěn)定。在這些情況中，可用任何限制酶酶切，只要該酶不切割將要擴(kuò)增的靶DNA序列。
具體而言，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)分子含有大豆le1基因序列的一部分作為內(nèi)部DNA序列，并且含有Roundup Ready Soy系特異的DNA序列作為待測(cè)重組DNA。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)分子含有玉米zSSIIb基因的一部分作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，并且分別含有對(duì)GA21、T25、MON810、Event176和Bt11系特異的DNA序列，即，m-epsps-NOS終止區(qū)、pat-35S終止區(qū)、adh1-1S-cryIA(b)區(qū)、cryIA(b)-PEPC#9區(qū)和cryIA(b)-NOS終止區(qū)。在這些實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)分子是能夠在大腸桿菌中自主復(fù)制的DNA分子。
具體而言，根據(jù)本發(fā)明的定量PCR和目的DNA序列分子數(shù)的測(cè)定例如可以按照下列方法進(jìn)行。
(i)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在可根據(jù)內(nèi)部DNA序列擴(kuò)增或基因重組體特異的DNA序列擴(kuò)增的進(jìn)展提高熒光強(qiáng)度的探針存在下，用不同數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)分子、用于擴(kuò)增基因重組系特異性DNA序列或?qū)?yīng)于該重組體的物種所共有的內(nèi)部DNA序列的引物，進(jìn)行PCR。每隔預(yù)定的循環(huán)次數(shù)，監(jiān)測(cè)每次反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，反應(yīng)中用數(shù)量確定的標(biāo)準(zhǔn)分子作為反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的模板DNA(圖14(A)，(B))。同步測(cè)定熒光增強(qiáng)的閾值(ΔRn)，在熒光強(qiáng)度和循環(huán)數(shù)之間觀察到指數(shù)關(guān)系。例如，在圖14中ΔRn設(shè)為10-1。以PCR循環(huán)次數(shù)作為縱軸，以反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的模板DNA的分子數(shù)作為橫軸，可將達(dá)到閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)對(duì)反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的DNA模板的分子數(shù)作圖，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖15)。
(ii)樣品DNA的PCR關(guān)于樣品中可能含有的基因重組系特異的DNA序列和對(duì)應(yīng)于該基因重組體的物種所共有的內(nèi)部DNA序列，分別對(duì)樣品中基因重組體特異的DNA序列和內(nèi)部DNA序列進(jìn)行定量PCR。基因重組體特異的DNA序列可以是對(duì)每種基因重組系特異的序列，或者可以是兩種或多種基因重組系通常共有的序列。對(duì)每種基因重組體特異的DNA序列和內(nèi)部DNA序列的PCR可以在同一反應(yīng)中進(jìn)行，或在分開(kāi)的反應(yīng)中進(jìn)行，但要保證在兩個(gè)反應(yīng)中模板DNA分子相同。
(iii)基因重組體特異的DNA序列的分子數(shù)和內(nèi)部DNA序列的分子數(shù)的測(cè)定可以對(duì)上述每種個(gè)別序列進(jìn)行PCR，監(jiān)測(cè)作為擴(kuò)增指示的信號(hào)，以確定信號(hào)達(dá)到步驟(i)所定義的閾值的循環(huán)數(shù)。然后利用步驟(i)中生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將獲得的循環(huán)數(shù)轉(zhuǎn)化為在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的分子數(shù)。
當(dāng)已經(jīng)獲得(i)中定義的標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，可將此標(biāo)準(zhǔn)曲線用于步驟(ii)之后的程序。
一旦獲得樣品中重組體特異的DNA序列的分子數(shù)、內(nèi)部DNA序列的分子數(shù)和各重組體的定量比，即能根據(jù)上述式(I)或式(III)計(jì)算出樣品中所含基因重組體的總含量比或每個(gè)系的分別的含量比。在式(I)或式(III)中，可以選擇對(duì)每種基因重組系特異的DNA序列或非系特異的但是常用于基因重組體的DNA序列作為待定量的重組DNA序列。
當(dāng)選擇前者時(shí)，可以在重復(fù)分析所有基因重組系之后將樣品中每個(gè)系的含量比相加，準(zhǔn)確定量樣品中基因重組體的總含量比，因?yàn)闃悠分懈鱾€(gè)系的分別的含量比能夠準(zhǔn)確確定。這種方法在許多情況下可能適用于在銷(xiāo)售渠道中所分析的樣品是多個(gè)系混合物的銷(xiāo)售模式。
當(dāng)選擇后者時(shí)，由于能同時(shí)測(cè)定多個(gè)系的近似含量比，因此可能是一種適于方便地定量樣品中全部基因重組體的近似總含量比的標(biāo)準(zhǔn)樣品。在這些情況中，可選擇經(jīng)計(jì)算的多個(gè)基因重組系的定量比值中的任一個(gè)作為式(I)中的定量比，但是在這些數(shù)值中使用最小定量比是優(yōu)選的。這將使得估計(jì)基因重組體含量比的最大可能值成為可能。
(實(shí)施例)下列實(shí)施例可以說(shuō)明本發(fā)明，但是這些實(shí)施例只是為了說(shuō)明，本發(fā)明的范圍不只限于這些實(shí)施例。
在下列實(shí)施例中使用下列樣品、試劑和設(shè)備。
(1)樣品對(duì)于玉米(Zea mays)使用下列6個(gè)品種的干種子基因重組玉米BT11系、Event176系、MON810系、T25系和GA21系的子代品種。
非重組玉米Dairyland 1412對(duì)于大豆(Glycine max)使用下列2個(gè)品種的干種子
基因重組大豆Roundup Ready Soy的子代品種非重組大豆Murayutaka種對(duì)于水稻(Oryza sativa)使用下列品種的干種子非重組水稻Kinuhikari種對(duì)于小麥(Triticum aestivum)使用下列品種的干種子非重組小麥Haruyutaka種對(duì)于大麥(Hordeum vulgare)使用下列品種的干種子非重組大麥Harrington種(2)試劑DNA提取使用下列試劑十二烷基硫酸鈉(SDS)(保證試劑)(Sigma Chemical Co.)QIAGEN DNeasy Plant Maxi試劑盒(QIAGEN GmbH)QIAGEN DNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN GmbH)電泳使用下列試劑乙酸(保證試劑)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)三[羥甲基]氨基甲烷(Tris)(保證試劑)(Sigma Chemical Co.)乙二胺四乙酸(EDTA)(保證試劑)(Sigma Chemical Co.)瓊脂糖粉“LO3「TaKaRa」”(TaKaRa Shuzo Co.，Ltd.)溴化乙錠(Sigma Chemical Co.)Ficoll 400(Sigma Chemical Co.)溴酚藍(lán)(Sigma Chemical Co.)二甲苯腈藍(lán)(Sigma Chemical Co.)DNA標(biāo)記物“l(fā)ambda的HindIII化產(chǎn)物”(New England BiolabsInc.)DNA標(biāo)記物“1kb ladder”(New England Biolabs Inc.)
DNA標(biāo)記物“100bp ladder”(New England Biolabs Inc.)定量PCR使用下列試劑DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PE Biosystems)×10PCR緩沖液II(PE Biosystems)生產(chǎn)和純化質(zhì)粒使用下列試劑DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PE Biosystems)×10PCR緩沖液II(PE Biosystems)DNA聚合酶“KOD”(TOYOBO Co.，Ltd.)×10PCR緩沖液II(TOYOBO Co.，Ltd.)TOPO TA克隆試劑盒，帶有TOP10F′細(xì)胞(Invitrogen Co.)酵母提取物(Difco Laboratories)胰蛋白胨(Difco Laboratories)NaCl(保證試劑)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)瓊脂粉(Syoei Kanten Ltd.)D[-]-α-氨芐青霉素(氨芐西林)鈉鹽(Sigma Chemical Co.)QIAGEN Plasmid Maxi試劑盒(QIAGEN GmbH)乙醇(保證試劑)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)2-丙醇(保證試劑)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)三[羥甲基]氨基甲烷(Tris)(保證試劑)(Sigma Chemical Co.)乙二胺四乙酸(EDTA)(保證試劑)(Sigma Chemical Co.)限制酶“HindIII”(TaKaRa Shuzo Co.，Ltd.)限制酶“BamHI”(TOYOBO Co.，Ltd.)限制酶“SmaI”(New England Biolabs Inc.)限制酶“SrfI”(New England Biolabs Inc.)苯酚(保證試劑)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)氯仿(保證試劑)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)異戊醇(保證試劑)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
定量PCR使用下列試劑TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Biosystems)(3)設(shè)備從樣品中提取DNA使用下列設(shè)備成粒機(jī)″Multi Beads Shocker MB301″(Yasui Kikai Co.)成粒機(jī)″DM-6″(Yu Chi Machinery Co.，Ltd.)輕觸式混合器″Tube mixer″(Yama to Scientific Co.，Ltd.)超級(jí)脫鹽機(jī)″CPW-200″(ADVANTEC Toyo Kaisya Ltd.)孵箱″Thermo Minder SD mini″(TAITEC Co.)離心機(jī)″himac CT13″(Hitachi Koki Co.，Ltd.)離心機(jī)″himac CF15D2″(Hitachi Koki Co.，Ltd.)離心機(jī)″AllegraTM 6KR″(Beckman Coulter，Inc.)分光光度計(jì)″DU7400″(Beckman Coulter，Inc.)DNA電泳使用下列設(shè)備電泳裝置″Mupid 2″(Advance Co.，Ltd.)成像分析儀″Molecular ImagerRFX″(BioRad Laboratories Inc.)定量PCR使用下列設(shè)備熱循環(huán)儀″PTC-200″(MJ Research Inc.)熱循環(huán)儀″PCR System 9700″(PE Biosystems)生產(chǎn)和純化質(zhì)粒使用下列設(shè)備搖床孵箱“Thermostat Shaking Incubator AT24R″(Thomas KagakuCo.，Ltd.)熱循環(huán)儀″PTC-200″(MJ Research Inc.)熱循環(huán)儀″PCR System 9700″(PE Biosystems)
離心機(jī)″himac CT13″(Hitachi Koki Co.，Ltd.)離心機(jī)″himac CF15D2″(Hitachi Koki Co.，Ltd.)定量PCR使用下列設(shè)備定量PCR儀″ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)″(PE Biosystems)定量PCR儀″ABI PRISM 5700序列檢測(cè)系統(tǒng)″(PE Biosystems)(4)其它引物合成委托Greiner Japan K.K.
探針合成委托PE Biosystems Japan K.K.
DNA序列驗(yàn)證委托Greiner Japan K.K.
實(shí)施例1 DNA的提取從玉米、大豆、水稻、小麥、大麥中提取DNA按照下列程序進(jìn)行。首先，用成粒機(jī)“DM-6”(Yu Chi Machinery Co.，Ltd.)將樣品研磨成粉末，然后從磨碎的產(chǎn)物中稱(chēng)取500-1000mg，用QIAGEN DNeasy PlantMaxi試劑盒(QIAGEN GmbH)，按照廠商推薦方案從中提取DNA。
為了從一個(gè)玉米?；虼蠖沽Ｖ刑崛NA，首先用1％SDS充分洗滌粒表面，之后用成粒機(jī)“Multi Beads Shocker MB301”(Yasui Kikai Co.)碾碎，然后全部研磨產(chǎn)物都進(jìn)行DNA提取。
實(shí)施例12、13、14描述的從雙盲樣品中提取DNA按照下列方法進(jìn)行。以下以玉米為例描述，但是對(duì)于大豆也能使用類(lèi)似的方法。首先，用1％SDS溶液分別洗滌基因重組玉米和非重組玉米，之后干燥。然后用成粒機(jī)“DM-6”(Yu Chi Machinery Co.，Ltd.)分別研磨，每種研磨產(chǎn)物稱(chēng)取1g，用成粒機(jī)“DM-6”(Yu Chi Machinery Co.，Ltd.)混合基因重組玉米和非重組玉米。從混合樣品中稱(chēng)取500-1000mg，用QIAGEN DNeasy Plant Maxi試劑盒(QIAGEN GmbH)按照廠商推薦方案從研磨產(chǎn)物中提取DNA。提取的所有DNA溶液各1μL與1μL 10x加樣緩沖液(20％Ficoll 400，0.1M EDTA，1.0％SDS，0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯腈藍(lán))混合后進(jìn)行電泳，以證實(shí)在提取過(guò)程中未發(fā)生降解。即，使用電泳裝置“Mupid 2”(Advance Co.，Ltd.)和含有溶于TAE緩沖液(0.04M Tris，0.04M乙酸，0.001M EDTA)的50μg溴化乙錠(SigmaChemical Co.)的0.8％瓊脂糖凝膠，在100V下電泳15分鐘。凝膠中的DNA用成像分析儀“Molecular ImagerRFX”(BioRad LaboratoriesInc.)證實(shí)。
另外，也對(duì)提取的所有DNA溶液各1μL進(jìn)行分光光度測(cè)定，以測(cè)定其濃度和純度。即，測(cè)定用49μL TE緩沖液稀釋50倍的樣品在230nm、260nm、280nm下的吸光度并根據(jù)1A260單位＝50μg計(jì)算其濃度和純度。
提取的所有DNA都于-20℃貯存。
實(shí)施例2檢測(cè)區(qū)的選擇(設(shè)計(jì)引物對(duì)和探針)用從多個(gè)基因重組系的每個(gè)子代品種中提取的DNA測(cè)定重組DNA序列，測(cè)序引物如表1所示。
表1.測(cè)序引物
表1.(續(xù)表)
<序列表>
SEQ ID NO1-14PCR引物為了擴(kuò)增涵蓋所導(dǎo)入DNA序列含有的多個(gè)DNA序列的區(qū)域，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增基因重組系特異的DNA序列的引物對(duì)。即，設(shè)計(jì)引物對(duì)，用來(lái)對(duì)Bt11系的子代品種擴(kuò)增cryIA(b)-Nos終止子和adh1-S-cryIA(b)，對(duì)Event176系的子代品種擴(kuò)增cryIA(b)-PEPC#9，對(duì)MON810系的子代品種擴(kuò)增hsp70-cryIA(b)，對(duì)T25系的子代品種擴(kuò)增pat-35S，對(duì)GA21系的子代品種擴(kuò)增m-epsps-NOS和OPT-m-epsps，對(duì)RoundupReady Soy系的子代品種擴(kuò)增CPT4-CP4-epsps。
為了擴(kuò)增CaMV 35S啟動(dòng)子序列的內(nèi)部序列或NOS終止子序列的內(nèi)部序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增不是系特異的但是常用于基因重組體的DNA序列的引物對(duì)。
另外，選擇玉米zSSIIb基因的內(nèi)部序列或大豆le1基因的內(nèi)部序列作為生物具有的特異內(nèi)源基因的DNA序列。為了設(shè)計(jì)這些引物，通過(guò)檢索基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得這些序列。
在引物之間，設(shè)計(jì)Tm值比引物的Tm值大約高10℃的探針(表2A和2B)。
表2A.用于玉米的引物/探針
表2A.續(xù)表
<序列表>
SEQ ID NOs15、16、18、19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、77、78、79、80PCR引物SEQ ID NO17用于玉米zSSIIB的探針SEQ ID NO20用于CaMV 35S啟動(dòng)子的探針SEQ ID NO23用于NOS終止子的探針SEQ ID NO26用于Event176的探針SEQ ID NO29用于Bt11的探針SEQ ID NO32用于GA21的探針
SEQ ID NO35用于T25的探針SEQ ID NO38用于MON810的探針SEQ ID NO41用于Bt11的探針SEQ ID NO44用于GA21的探針表2B.用于大豆的引物/探針
表2B.(續(xù)表)
<序列表>
SEQ ID NO45，46、48、49PCR引物SEQ ID NO47用于大豆le1的探針SEQ ID NO50用于Roundup Ready Soy的探針實(shí)施例3引物對(duì)特異性的證實(shí)(定量PCR)證實(shí)實(shí)施例2設(shè)計(jì)的引物對(duì)在定量PCR中是否能夠只特異檢測(cè)其靶序列。
用Bt11系、Event176系、MON810系、GA21系和T25系的子代品種和非重組玉米Dairyland 1412作為玉米樣品。用Roundup Ready Soy系的子代品種和非重組大豆Murayutaka作為大豆樣品。使用與實(shí)施例1相同的方法從各種樣品中提取總共8種DNA。
由于在實(shí)測(cè)樣品中具有污染玉米和大豆之外的其它主要作物的可能性，所以也利用與實(shí)施例1相同的方法，分別從水稻(Kinuhikari種)、小麥(Haruyutaka種)和大麥(Harrington種)中提取3種DNA。
在定量PCR中，用以上提取的總共11種DNA作為PCR模板，用蒸餾水作為陰性對(duì)照。用熱循環(huán)儀“PTC-200”(MJ Research Inc.)進(jìn)行反應(yīng)。在該實(shí)驗(yàn)中，每條引物均在PCR溶液中以0.5μM的終濃度使用。從各樣品(模板)中提取的DNA以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)25ng的量使用。DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PE Biosystems)以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)0.625單位的量使用，作為PCR酶。x10 PCR緩沖液II(PE Biosystems)以2.5μL的體積使用，作為反應(yīng)緩沖液，MgCl2和dNTP分別以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)1.5mM和200μM的濃度使用。反應(yīng)系統(tǒng)用蒸餾水補(bǔ)充至20μL。
采用的反應(yīng)條件如下95℃下保持10分鐘，95℃ 30秒、58℃30秒、72℃ 30秒共40個(gè)循環(huán)，隨后在72℃下保持7分鐘，并保持于4℃。
反應(yīng)完成后，從反應(yīng)溶液中取樣5μL，與1μL 10x加樣緩沖液混合，然后利用電泳裝置″Mupid 2″(Advance Co.，Ltd.)，在溶于TAE緩沖液的3％瓊脂糖凝膠上以100V電泳15分鐘。凝膠用溴化乙錠(SigmaChemicals Co.)染色15分鐘后，利用成像分析儀“Molecular ImagerRFX”(BioRad Laboratories Inc.)證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)例子如圖2所示。從而證實(shí)，為檢測(cè)T25系的子代品種而設(shè)計(jì)的引物對(duì)能夠只特異檢測(cè)T25系的子代品種，顯示與其它樣品無(wú)交叉反應(yīng)。
表3總結(jié)了以同一方法證實(shí)的所有結(jié)果。如表3所示，證實(shí)所有引物對(duì)都能只分別特異檢測(cè)不同基因重組系的靶子代品種。
表4
<p>表3.(續(xù)表)
*1Roundup Ready Soy，+陽(yáng)性，-陰性實(shí)施例4引物對(duì)和探針特異性的證實(shí)(定量PCR)證實(shí)實(shí)施例2設(shè)計(jì)的引物對(duì)和探針在定量PCR中是否能夠只特異檢測(cè)其靶序列。
如同實(shí)施例3一樣，用Bt11系、Event176系、MON810系、GA21系和T25系的子代品種和非重組玉米Dairyland 1412作為玉米樣品；用Roundup Ready Soy系的子代品種和非重組大豆Murayutaka作為大豆樣品。利用與實(shí)施例1相同的方法從各種樣品中提取總共8種DNA。
由于在實(shí)測(cè)樣品中具有污染玉米和大豆之外的其它主要作物的可能性，所以也利用與實(shí)施例1相同的方法，分別從水稻(Kinuhikari種)、小麥(Haruyutaka種)和大麥(Harrington種)中提取3種DNA。
在定量PCR中，用以上提取的總共11種DNA作為PCR模板，用蒸餾水作為陰性對(duì)照。用定量PCR裝置“ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)”(PE Biosystems)進(jìn)行反應(yīng)。在該實(shí)驗(yàn)中，每種引物以0.5μM的終濃度使用，探針在反應(yīng)溶液中以0.2μM的終濃度使用。從各個(gè)樣品(模板)中提取的DNA以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)50ng的量使用，TaqMan Universal PCRMaster Mix(PE Biosystems；下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“Master Mix”)以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)12.5μL的體積使用。反應(yīng)系統(tǒng)補(bǔ)充為25μL。
采用的反應(yīng)條件如下反應(yīng)溶液在50℃下保持2分鐘，然后在95℃下10分鐘，95℃ 30秒和59℃ 1分鐘共40個(gè)循環(huán)，隨后保持于25℃。
在反應(yīng)過(guò)程中，隨時(shí)間變化測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔的熒光強(qiáng)度。在反應(yīng)完成后，通過(guò)分析每孔中熒光強(qiáng)度變化的時(shí)程，能確定熒光強(qiáng)度增加的孔。熒光強(qiáng)度的增加是由于與PCR擴(kuò)增相關(guān)的探針降解的結(jié)果。因此，在觀察到熒光強(qiáng)度增加的孔中，可以認(rèn)為發(fā)生了PCR擴(kuò)增，并且探針降解。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)例子如圖3所示。可以證實(shí)，為檢測(cè)NOS終止子而設(shè)計(jì)的引物對(duì)和探針能夠只特異檢測(cè)Bt11系、Event176系和RoundupReady Soy系的子代品種，顯示與其它樣品無(wú)交叉反應(yīng)。
表4總結(jié)了用同一方法證實(shí)的所有結(jié)果。如表4所示，可以證實(shí)，所有引物對(duì)和探針都能夠只分別特異檢測(cè)其基因重組系的靶子代品種。
表4.探針和引物對(duì)的特異性
表4.(續(xù)表)
*1Roundup Ready Soy，+陽(yáng)性，-陰性實(shí)施例5標(biāo)準(zhǔn)分子的制備(玉米)實(shí)施例2選擇的待測(cè)區(qū)域的整合按照?qǐng)D4所示的方法進(jìn)行。
即，利用表5所示的具尾引物，用從相應(yīng)多種基因重組系中提取的DNA作為模板，連續(xù)進(jìn)行PCR，獲得在其末端含有與其它待測(cè)靶區(qū)互補(bǔ)的序列的多種PCR產(chǎn)物。
用如下反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行PCR，其含有10ng玉米DNA作為模板，各0.5μM具尾引物，0.156單位DNA聚合酶“KOD”(TOYOBO Co.，Ltd.)，160μM dNTP，1.5mM MgCl2和2.5μl x10 PCR緩沖液II(TOYOBO Co.，Ltd.)，用蒸餾水補(bǔ)充至25μL的總體積。
采用的反應(yīng)條件如下在98℃下保持1分鐘，然后98℃ 30秒、54℃ 30秒、74℃ 1分鐘共35個(gè)循環(huán)，隨后在74℃下保持2分鐘，并保持于4℃。
得到的每種PCR產(chǎn)物，與欲鄰接的區(qū)域的擴(kuò)增的一種PCR產(chǎn)物一起，利用PCR進(jìn)行整合反應(yīng)。即，預(yù)先擴(kuò)增的0.25μL各種PCR產(chǎn)物與0.156單位DNA聚合酶“KOD”(TOYOBO Co.，Ltd.)、160μM dNTPs、1.5mMMgCl2和2.5μL x10 PCR緩沖液II(TOYOBO Co.，Ltd.)混合，用蒸餾水補(bǔ)充至24.5μL的總體積。首先，不使用任何引物對(duì)該反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
采用的反應(yīng)條件如下在98℃下保持1分鐘，然后98℃ 30秒、56℃ 30秒、74℃ 1分鐘共8個(gè)循環(huán)，此時(shí)終止反應(yīng)。
然后，以0.5μM的量向反應(yīng)系統(tǒng)中加入各遠(yuǎn)端引物，進(jìn)一步進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得兩個(gè)區(qū)域結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在第二次反應(yīng)中采用的反應(yīng)條件如下在98℃下保持1分鐘，然后98℃ 30秒、56℃ 30秒、74℃ 1分鐘共30個(gè)循環(huán)，隨后在74℃下保持2分鐘，并保持于4℃。
通過(guò)以類(lèi)似的方法重復(fù)該整合反應(yīng)，產(chǎn)生圖5和圖6所示的分子。圖5所示的分子在核苷酸1-151之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的zSSIIb(GENBANK登記號(hào)AF019297)DNA序列，在核苷酸152-252之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的CaMV 35S啟動(dòng)子DNA序列，在核苷酸275-425之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的NOS終止子DNA序列，在核苷酸441-581之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的GA21系特異的DNA序列，在核苷酸582-730之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的T25系特異的DNA序列，在核苷酸731-843之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的MON810系特異的DNA序列，在核苷酸844-951之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的Event176系特異的DNA序列，在核苷酸952-1102之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的Bt11系特異的DNA序列。該區(qū)的序列如SEQ ID NO57所示。圖5的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO73所示。
圖6所示的分子在核苷酸1-151之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的zSSIIb DNA序列，在核苷酸152-252之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的CaMV 35S啟動(dòng)子DNA序列，在核苷酸275-425之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的NOS終止子DNA序列，在核苷酸441-573之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的GA21系特異的DNA序列，在核苷酸574-722之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的T25系特異的DNA序列，在核苷酸723-835之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的MON810系特異的DNA序列，在核苷酸836-943之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的Event176系特異的DNA序列，在核苷酸944-1071之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的Bt11系特異的DNA序列。圖6的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO74所示。
表5.
Pro啟動(dòng)子表5.(續(xù)表)
<序列表>
SEQ ID NO51-72PCR引物；SEQ ID NO73-74用于定量檢測(cè)玉米基因重組體的標(biāo)準(zhǔn)分子的擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)；和SEQ ID NO75用于定量檢測(cè)大豆基因重組體的標(biāo)準(zhǔn)分子的擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)。
以上制備的每種整合分子用DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PEBiosystems)再次擴(kuò)增，用帶有TOP 10F′細(xì)胞的TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Co.)連接到質(zhì)粒載體中。使用大腸桿菌宿主載體系統(tǒng)，以便能容易、無(wú)限地提供該分子。
即，在與實(shí)施例3相同的條件下，對(duì)以上制備的各1μL整合分子(模板)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)后，1μL反應(yīng)溶液與1μL質(zhì)粒載體pCR2.1TOPO和1μL鹽緩沖液混合，將該混合液置于室溫下5分鐘。2μL反應(yīng)溶液與試劑盒中提供的大腸桿菌TOP 10F′細(xì)胞株混合，置于冰上5分鐘，然后在42℃下進(jìn)行熱休克處理30秒，以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
含有轉(zhuǎn)化子的100μL溶液平板接種于LB(氨芐西林)平板上[每升組成10g胰蛋白胨(Difco Laboratories)，5g酵母提取物(DifcoLaboratories)，5g NaCl(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，15g瓊脂粉(Syoei Kanten Ltd.)和50mg D[-]-α-氨芐青霉素鈉(Ampicillin)(Sigma Chemical Co.)]，然后置于37℃下過(guò)夜，以獲得轉(zhuǎn)化子。
為了篩選正確的轉(zhuǎn)化子，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子的每個(gè)菌落進(jìn)行直接菌落PCR。即，M13正向引物和M13反向引物(各0.5μM)與0.625單位DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PE Biosystems)和作為反應(yīng)緩沖液的2.5μLx10 PCR緩沖液II(PE Biosystems)混合。每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中還加入濃度分別為1.5mM和200μM的MgCl2和dNTPs。反應(yīng)系統(tǒng)用蒸餾水補(bǔ)充至25μL的總體積。用牙簽挑取菌落，懸浮于反應(yīng)系統(tǒng)中。
采用的反應(yīng)條件如下在95℃下保持5分鐘，95℃ 30秒、50℃30秒、72℃ 90秒共35個(gè)循環(huán)，隨后在72℃下保持90秒，并保持于4℃。
對(duì)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。含有符合預(yù)期設(shè)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的菌落在40mL LB(氨芐西林)液體培養(yǎng)基[每升的組成10g胰蛋白胨(Difco Laboratories)，5g酵母提取物(Difco Laboratories)，5g NaCl(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和50mg D[-]-α-氨芐青霉素鈉(Ampicillin)(Sigma Chemical Co.)]中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
用QIAGEN Plasmid Maxi試劑盒(QIAGEN GmbH)從大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的大規(guī)模培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。質(zhì)粒的提取按照試劑盒所附方案進(jìn)行。
獲得的質(zhì)粒證實(shí)具有正確的核苷酸序列，用作標(biāo)準(zhǔn)分子(pMul4和pMul5圖7)。攜帶質(zhì)粒pMul4的大腸桿菌ASN-pMul4和攜帶質(zhì)粒pMul5的大腸桿菌ASN-pMul5均于2000年10月12日保藏于日本茨城縣筑波市1丁目1-3號(hào)(郵編305-8566)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在稱(chēng)為獨(dú)立行政法人 產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所 國(guó)際專(zhuān)利生物保藏單位，日本國(guó)茨城縣筑波市東1-1-1中央6號(hào)，郵編305-8566)，保藏號(hào)為FERM BP-7319和FERM BP-7320。
當(dāng)在定量PCR中使用這些引物時(shí)，它們以限制酶BamHI消化制備的線性化分子的形式使用。在下列實(shí)施例中，用pMul4的BamHI消化產(chǎn)物(下文稱(chēng)為pMul4 BamHI消化產(chǎn)物)作為標(biāo)準(zhǔn)分子。
實(shí)施例6標(biāo)準(zhǔn)分子的制備(大豆)如同實(shí)施例5一樣，實(shí)施例2選擇的待測(cè)目標(biāo)區(qū)的整合按照?qǐng)D4所示的方法進(jìn)行。
即，用表5所示的具尾引物和從相應(yīng)基因重組系中提取的DNA(模板)進(jìn)行PCR，獲得在其末端含有與其它待測(cè)區(qū)域互補(bǔ)的序列的PCR產(chǎn)物。得到的PCR產(chǎn)物與欲鄰接的區(qū)域的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物一起利用PCR進(jìn)行整合反應(yīng)。
上述實(shí)驗(yàn)中采用的詳細(xì)條件與實(shí)施例5中采用的條件相同。
通過(guò)整合反應(yīng)獲得圖8和圖9所示的分子。圖8所示的分子在核苷酸1-121之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的Roundup Ready Soy系特異的DNA序列，在核苷酸122-239之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的le1(GENBANK登記號(hào)K00821M30884)DNA序列。圖8的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO75所示。
圖9所示的分子在核苷酸1-121之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的RoundupReady Soy系特異的DNA序列，在核苷酸122-239之間整合了待擴(kuò)增的le1 DNA序列，在核苷酸240-419之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的NOS終止子子DNA序列，在核苷酸428-528之間整合了擴(kuò)增靶標(biāo)的CaMV 35S啟動(dòng)子DNA序列。圖9的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO75所示。
<序列表>
SEQ ID NOs75和76用于定量檢測(cè)大豆基因重組體的標(biāo)準(zhǔn)分子的擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)。
用帶有TOP 10F′細(xì)胞的TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Co.)將以上制備的每個(gè)整合分子連接到質(zhì)粒載體中，使用與實(shí)施例5相同的方法，使用一種大腸桿菌宿主載體系統(tǒng)，以便能容易、無(wú)限地供應(yīng)該分子。獲得的質(zhì)粒證實(shí)具有正確的核苷酸序列，用作標(biāo)準(zhǔn)分子(pMulSL和pMulSL2圖10和圖11)。攜帶質(zhì)粒pMulSL的大腸桿菌ASN-pMulSL和攜帶質(zhì)粒pMulSL2的大腸桿菌ASN-pMulSL2于2000年10月12日保藏于日本茨城縣筑波市1丁目1-3號(hào)(郵編305-8566)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在稱(chēng)為獨(dú)立行政法人 產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所 國(guó)際專(zhuān)利生物保藏單位，日本國(guó)茨城縣筑波市東1-1-1中央6號(hào)，郵編305-8566)，保藏號(hào)為FERM BP-7321和FERM BP-7322。
當(dāng)在定量PCR中使用這些引物時(shí)，它們以限制酶BamHI消化制備的線性化分子的形式使用。在下面的實(shí)施例中，用pMulSL的BamHI消化產(chǎn)物(下文稱(chēng)為pMulSL BamHI消化產(chǎn)物)作為標(biāo)準(zhǔn)分子。
實(shí)施例7作為定性分析的陽(yáng)性對(duì)照的用途將從Bt11系、GA21系和MON810系的子代品種各1g中提取的DNA樣品等量混合在一起。以20ng/μL的DNA濃度，用DNA混合物制備DNA溶液。用該DNA溶液作為雙盲玉米樣品，用標(biāo)準(zhǔn)分子作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)定性PCR確定樣品中基因重組玉米的存在。
實(shí)驗(yàn)中使用的設(shè)備和條件(例如反應(yīng)溶液的組成)與實(shí)施例3使用的相同。對(duì)表2所示的所有引物對(duì)進(jìn)行定性PCR。在該實(shí)驗(yàn)中，用以上制備的DNA溶液作為PCR模板，用實(shí)施例5所述的標(biāo)準(zhǔn)分子pMul4 BamHI消化產(chǎn)物作為陽(yáng)性對(duì)照，用蒸餾水作為陰性對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)分子pMul4 BamHI消化產(chǎn)物以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)500個(gè)分子的量使用。
如同實(shí)施例3一樣，在反應(yīng)完成后，從反應(yīng)溶液中取樣5μL，在3％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并用溴化乙錠染色，利用成像分析儀證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，證實(shí)樣品中含有基因重組玉米Bt11系、GA21系和MON810系的子代品種。也已經(jīng)證實(shí)，標(biāo)準(zhǔn)分子pMul4 BamHI消化產(chǎn)物適合作為定性分析的陽(yáng)性對(duì)照。
特別是對(duì)于GA21系和MON810系的子代品種，由于目前還沒(méi)有市售的標(biāo)準(zhǔn)樣品，普通分析者還不能獲得這些系的陽(yáng)性對(duì)照。
實(shí)施例8定量比的測(cè)定(預(yù)試驗(yàn)-玉米)由于玉米是一種雜種，測(cè)定正確的定量比需要遺傳學(xué)均一的F1種群或與之相當(dāng)?shù)姆N群。因此，首先通過(guò)定量PCR證實(shí)種子的遺傳學(xué)均一性作為預(yù)試驗(yàn)。
對(duì)于Bt11系、Event176系、MON810系和GA21系的子代品種，用F1種子作為預(yù)試驗(yàn)的樣品。對(duì)于T25系的子代品種，由于F1種子無(wú)法獲FFVTTR5RRDFCTGFV得，因此用F2種子代替。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)在下文中描述。
從上述5個(gè)品種各8個(gè)種子中提取DNA，用實(shí)施例5中所述的pMul4BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定提取的DNA中待測(cè)目標(biāo)區(qū)(實(shí)施例2選擇的)的分子數(shù)。即，對(duì)于待擴(kuò)增的玉米內(nèi)源基因zSSIIb的DNA序列，用分別從5個(gè)品種提取的DNA作為模板進(jìn)行定量PCR，以測(cè)定樣品中該區(qū)的分子數(shù)。對(duì)于待擴(kuò)增的CaMV 35S啟動(dòng)子的DNA序列，用分別從Bt11系、Event176系、MON810系和T25系的子代品種中提取的DNA作為模板進(jìn)行定量PCR，以測(cè)定樣品中該區(qū)的分子數(shù)。對(duì)于待擴(kuò)增的NOS終止子的DNA序列，用分別從Bt11系和GA21系的子代品種中提取的DNA作為模板進(jìn)行定量PCR，以測(cè)定樣品中該區(qū)的分子數(shù)。對(duì)于每個(gè)系，均根據(jù)式(II)用該實(shí)驗(yàn)獲得的測(cè)定值計(jì)算定量比(圖13)。
這些實(shí)驗(yàn)用定量PCR裝置“ABI PRISM 7700序列測(cè)定系統(tǒng)”(PEBiosystems)進(jìn)行。在該實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于定量測(cè)定CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和zSSIIb的所有引物，每種PCR溶液的終引物濃度為0.5μM；對(duì)于定量CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和zSSIIb的所有探針，終探針濃度為0.2μM。從每種樣品中提取的DNA以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)50ng的量用作為模板，TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Biosystems；下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“Master Mix”)以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)12.5μL的體積使用。每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)均補(bǔ)充至25μL。同一反應(yīng)進(jìn)行三次，求測(cè)定值的平均值。
反應(yīng)中使用的條件如下反應(yīng)溶液在50℃下保持2分鐘，然后在95℃下保持10分鐘，95℃ 30秒、59℃ 1分鐘共40個(gè)循環(huán)，隨后保持于25℃。
為了定量測(cè)定CaMV 35S啟動(dòng)子，向反應(yīng)管中加入12種樣品的每一種，包括以3種濃度(每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)250個(gè)分子、1000個(gè)分子和50000個(gè)分子)制備的標(biāo)準(zhǔn)分子pMul4 BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)重組DNA序列；從單個(gè)種子(每個(gè)品種總共8個(gè)樣品)中提取的DNA溶液作為待測(cè)樣品；鮭精DNA溶液作為陰性對(duì)照。以上述終濃度向每個(gè)待測(cè)試管中加入用于定量測(cè)定CaMV 35S啟動(dòng)子的引物對(duì)和探針和Master Mix，獲得反應(yīng)溶液。
同樣，為了定量測(cè)定NOS終止子，向反應(yīng)管中加入12種樣品的每一種，包括以3種濃度(每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)250個(gè)分子、1000個(gè)分子和50000個(gè)分子)制備的標(biāo)準(zhǔn)分子pMul4 BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)重組DNA序列；從單個(gè)種子(每個(gè)品種總共8個(gè)樣品)中提取的DNA溶液作為待測(cè)樣品；鮭精DNA溶液作為陰性對(duì)照。以上述終濃度向每個(gè)待測(cè)試管中加入用于定量測(cè)定NOS終止子的引物對(duì)和探針和Master Mix，獲得反應(yīng)溶液。
同樣，為了定量測(cè)定內(nèi)源基因zSSIIb，向反應(yīng)管中加入12種樣品的每一種，包括以3種濃度(每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)250個(gè)分子、1000個(gè)分子和50000個(gè)分子)制備的標(biāo)準(zhǔn)分子pMul4 BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)重組DNA序列；從單個(gè)種子(每個(gè)品種總共8個(gè)樣品)中提取的DNA溶液作為待測(cè)樣品；鮭精DNA溶液作為陰性對(duì)照。以上述終濃度向每個(gè)待測(cè)試管中加入用于定量測(cè)定zSSIIb的引物對(duì)和探針和Master Mix，獲得反應(yīng)溶液。
在反應(yīng)過(guò)程中，根據(jù)熒光強(qiáng)度的增加，隨時(shí)間變化測(cè)定PCR擴(kuò)增所致探針降解的程度。因此，通過(guò)生成作為定量標(biāo)準(zhǔn)(x4)的3種樣品的圖(循環(huán)次數(shù)-熒光強(qiáng)度)(見(jiàn)圖14)，能夠獲得待擴(kuò)增的靶DNA序列的分子數(shù)與熒光強(qiáng)度達(dá)到特定值所需時(shí)間之間的關(guān)聯(lián)函數(shù)(見(jiàn)圖15)。用此關(guān)聯(lián)函數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠確定反應(yīng)開(kāi)始時(shí)定量樣品中存在的將要擴(kuò)增的CaMV 35S啟動(dòng)子的DNA序列、待擴(kuò)增的NOS終止子的DNA序列和待擴(kuò)增的zSSIIb的DNA序列的分子數(shù)(表6)。
表6.zSSIIB、CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS各自的分子數(shù)
如圖13所示，對(duì)于Bt11系、Event176系、MON810系和GA21系的子代品種，在來(lái)自8個(gè)種子的DNA樣品中，定量比幾乎不變，證實(shí)種子樣品是遺傳均一的F1群體。然而，由于T25系的子代品種的F1種子無(wú)法獲得，整合的DNA序列如預(yù)期的顯示遵循孟德?tīng)柗▌t的子代分布。因此，對(duì)于T25系的子代品種，只選擇證實(shí)與F1群體基因結(jié)構(gòu)相同的種子(在圖13中用箭頭標(biāo)記的)，在隨后的實(shí)驗(yàn)中用該種子群體作為與遺傳均一的F1種子群體相當(dāng)?shù)姆N子群體。
實(shí)施例9定量比的確定(預(yù)試驗(yàn)-大豆)按照與實(shí)施例8相同的方法對(duì)大豆進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。用Roundup ReadySoy系的子代品種的F1種子作為預(yù)試驗(yàn)的樣品。
按照與實(shí)施例8相同的方法，分別從Roundup Ready Soy系的子代品種的8個(gè)F1種子中提取DNA，用實(shí)施例6所述的pMulSL BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定提取的DNA樣品中待測(cè)目標(biāo)區(qū)(實(shí)施例2中選擇的)的分子數(shù)。
即，對(duì)于擴(kuò)增靶標(biāo)的大豆內(nèi)源基因le1的DNA序列和擴(kuò)增靶標(biāo)的Roundup Ready Soy系特異的DNA序列，分別用提取的DNA作為模板進(jìn)行定量PCR，并測(cè)定樣品中各區(qū)的分子數(shù)。按照式(II)，用該實(shí)驗(yàn)獲得的測(cè)定值計(jì)算定量比(圖16)。
該實(shí)驗(yàn)中使用的設(shè)備和條件(例如反應(yīng)溶液的組成)與實(shí)施例8使用的相同，不同之外在于使用的引物和探針對(duì)應(yīng)于待擴(kuò)增的大豆內(nèi)源基因Le1的DNA序列和待擴(kuò)增的Round Ready Soy系特異的DNA序列。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖16所示，對(duì)于Roundup Ready Soy系的子代品種，計(jì)算的定量比在來(lái)自8個(gè)種子的DNA樣品之間幾乎不變，并且證實(shí)這些種子樣品是遺傳均一的F1群體，在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用。
實(shí)施例10定量比的測(cè)定(玉米)用預(yù)試驗(yàn)中獲得的遺傳均一的F1種子群體和相當(dāng)?shù)姆N子群體進(jìn)行測(cè)定定量比的試驗(yàn)。對(duì)于每個(gè)品種，用從遺傳均一的群體中提取的DNA樣品作為模板，用實(shí)施例5所述的pMul4 BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照與預(yù)試驗(yàn)相同的方法，測(cè)定提取的DNA中待測(cè)目標(biāo)區(qū)(實(shí)施例2中選擇的)的分子數(shù)。
在該試驗(yàn)中，除了在預(yù)試驗(yàn)中定量的擴(kuò)增靶標(biāo)的DNA序列外，也檢測(cè)擴(kuò)增靶標(biāo)的品種特異的DNA序列。對(duì)于擴(kuò)增靶標(biāo)的品種特異的DNA序列，對(duì)相應(yīng)各品種測(cè)定樣品中目標(biāo)區(qū)的分子數(shù)。
如同實(shí)施例9一樣，實(shí)驗(yàn)中使用的設(shè)備和條件(例如反應(yīng)溶液的組成)與實(shí)施例8相同，不同之處在于對(duì)待擴(kuò)增的不同靶標(biāo)使用不同的引物和探針。
同預(yù)試驗(yàn)一樣，按照式(II)用測(cè)定值計(jì)算定量比。即，擴(kuò)增靶標(biāo)的CaMV 35S啟動(dòng)子的DNA序列、擴(kuò)增靶標(biāo)的NOS終止子的DNA序列和品種特異的靶DNA序列的分子數(shù)均除以在同一樣品中分別測(cè)定的擴(kuò)增靶標(biāo)的zSSIIb DNA序列的分子數(shù)，獲得各種DNA序列特有的定量比(表7)。
表7.玉米基因重組系(X)的定量比(Kx)
也使用為擴(kuò)增較短目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的兩組引物(SSIIB 2-5′/SSIB2-3′和SSIIb3-5′/SSIB 3-3′)作為擴(kuò)增內(nèi)源基因zSSIIb的引物。也測(cè)定用這些引物作為擴(kuò)增內(nèi)源基因的引物所測(cè)定的定量比(表8和表9)。
表8.使用SSIIb 2-5’/SSIIb 2-3’時(shí)的定量比
表9.使用SSIIb 3-5’/SSIIb 3-3’時(shí)的定量比
實(shí)施例11定量比的測(cè)定(大豆)對(duì)于大豆，也用預(yù)試驗(yàn)中獲得的遺傳學(xué)均一的種子群體進(jìn)行測(cè)定定量比的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于每個(gè)品種，用從遺傳學(xué)均一的群體中提取的DNA作為模板，用pMulSL BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照與預(yù)試驗(yàn)相同的方法，分別測(cè)定提取的DNA中大豆內(nèi)源基因le1的待擴(kuò)增的靶DNA序列和Roundup Ready Soy系特異的DNA序列的分子數(shù)。
同實(shí)施例9一樣，實(shí)驗(yàn)中使用的設(shè)備和條件(例如反應(yīng)溶液的組成)與實(shí)施例8相同，不同之處在于對(duì)待擴(kuò)增的不同靶標(biāo)使用不同的引物和探針。
按照與預(yù)試驗(yàn)相同的方法，根據(jù)式(II)用測(cè)定值計(jì)算定量比。即，Roundup Ready Soy系特異的DNA序列的分子數(shù)除以在同一樣品中測(cè)定的大豆內(nèi)源基因le1的待擴(kuò)增的DNA序列數(shù)，獲得Roundup Ready Soy系特異的DNA序列的定量比，這是該系所特有的(表8)。
表8.大豆基因重組系(X)的定量比(Kx)
實(shí)施例12使用雙盲樣品的定量每種基因重組系的研磨產(chǎn)物與非重組系的研磨產(chǎn)物混合，制備雙盲樣品。實(shí)際測(cè)定雙盲樣品中各基因重組系的含量比，以估計(jì)該定量分析方法的效能。
即，利用實(shí)施例1所述的基因重組系和非重組系的種子制備雙盲樣品，并從該雙盲樣品中提取DNA。在對(duì)玉米的試驗(yàn)中，總共制備12種混合物作為雙盲樣品，它們分別含有0.1％、1％和5％(重量百分比)的Bt11系、Event176系、MON810系和T25系的子代品種的種子。
使用從每種雙盲樣品中提取的DNA作為模板和經(jīng)限制酶BamHI消化線性化的實(shí)施例5中制備的標(biāo)準(zhǔn)分子(pMul4 BamHI消化產(chǎn)物)進(jìn)行定量PCR，分別測(cè)定雙盲樣品中內(nèi)源基因的待擴(kuò)增DNA序列和重組DNA序列的待擴(kuò)增DNA部分序列的分子數(shù)。根據(jù)實(shí)施例10或11中測(cè)定的定量比的結(jié)果確定樣品中基因重組體的含量比。
在針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)的定量反應(yīng)中，在PCR反應(yīng)溶液中分別以0.5μM和0.2μM的終濃度使用用于定量的每種引物對(duì)和探針。從樣品中提取的DNA(模板)和Master Mix分別以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)50ng和12.5μL的量使用。將該反應(yīng)系統(tǒng)補(bǔ)充至25μL。同一反應(yīng)進(jìn)行三次，求獲得的測(cè)定值的平均值。
采用的反應(yīng)條件如下反應(yīng)溶液在50℃下保持2分鐘，然后在95℃下10分鐘，95℃ 30秒和59℃ 1分鐘40個(gè)循環(huán)，隨后保持于25℃。
在對(duì)待擴(kuò)增的每種靶DNA序列的定量測(cè)定中，向反應(yīng)管中加入9種樣品中的每一種，包括以5種濃度(每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)10、50、250、1000、50000個(gè)分子)制備的標(biāo)準(zhǔn)分子pMul4 BamHI消化產(chǎn)物；從0.1％、1％和5％雙盲樣品中提取的DNA溶液作為待測(cè)樣品；鮭精DNA溶液。以上述終濃度向反應(yīng)管中加入引物對(duì)、定量探針和Master Mix，獲得反應(yīng)溶液。
在反應(yīng)過(guò)程中，根據(jù)熒光強(qiáng)度的增加，隨時(shí)間變化測(cè)定PCR擴(kuò)增所致探針降解的程度。因此，通過(guò)生成作為標(biāo)準(zhǔn)重組DNA序列(x4)的5種樣品的圖(循環(huán)次數(shù)-熒光強(qiáng)度)，能夠獲得待擴(kuò)增的靶DNA序列的分子數(shù)與反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)射的熒光強(qiáng)度達(dá)到特定值所需時(shí)間的關(guān)聯(lián)函數(shù)。用此關(guān)聯(lián)函數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠確定在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)樣品中存在的靶DNA序列的分子數(shù)(表9)。
表9.用于擴(kuò)增的每種靶DNA序列的數(shù)量
表9.(續(xù)表)
用實(shí)施例10和11得出的定量比，根據(jù)式(I)，可將DNA序列分子數(shù)的測(cè)定值轉(zhuǎn)化為各基因重組體的含量比。轉(zhuǎn)化結(jié)果如表8所示。在兩種情況下，都發(fā)現(xiàn)含有含量為0.1％、1％或5％的基因重組系子代品種的雙盲樣品能夠被成功地定量測(cè)定。
實(shí)施例13利用標(biāo)準(zhǔn)分子對(duì)基因重組體含量比的定量(1)制備均含有3種玉米基因重組系的雙盲樣品。為了測(cè)定樣品中玉米基因重組系的含量比，對(duì)雙盲樣品進(jìn)行針對(duì)玉米CaMV 35S啟動(dòng)子和特異內(nèi)源基因zSSIIb的定量PCR。用實(shí)施例5所述的pMul4 BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)材料。
實(shí)驗(yàn)中使用的雙盲玉米樣品如下第一種樣品，其含有含量均為1％(重量百分比)的Bt11系、Event176系和MON810系的子代品種的研磨產(chǎn)物作為玉米基因重組體，含量為97％(重量百分比)的Dairyland 1412的研磨產(chǎn)物作為非重組玉米(1％混合物)；第二種樣品，其含有含量均為5％(重量百分比)的Bt11系、Event176系和MON810系的子代品種的研磨產(chǎn)物作為玉米基因重組體，含量為85％(重量百分比)的Dairyland1412的研磨產(chǎn)物作為非重組玉米(5％混合物)。
在該實(shí)驗(yàn)中，為了模擬分析的實(shí)際情況，假定分析者沒(méi)有任何關(guān)于樣品中所有3種玉米基因重組系的含量的信息。
另外，在PCR反應(yīng)溶液中，用于分析CaMV 35S啟動(dòng)子的引物和分析zSSIIb的引物，終引物濃度均為0.5μM；用于分析CaMV 35S啟動(dòng)子的探針和分析zSSIIb的探針，終探針濃度均為0.2μM。分別以每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)50ng和12.5μL的量加入從各種樣品中提取的DNA(模板)和Master Mix。反應(yīng)系統(tǒng)補(bǔ)充至25μL。同一反應(yīng)進(jìn)行三次，求所獲得的測(cè)定值的平均值。
采用的反應(yīng)條件如下反應(yīng)溶液在50℃下保持2分鐘，然后在95℃下10分鐘，95℃ 30秒和59℃ 1分鐘40個(gè)循環(huán)，隨后保持于25℃。
在CaMV 35S啟動(dòng)子的定量測(cè)定中，向反應(yīng)管中加入7種樣品中的每一種，包括以5種濃度(每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)10、50、250、1000、50000個(gè)分子)制備的標(biāo)準(zhǔn)分子pMul4 BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)重組DNA序列；從每種玉米雙盲樣品中提取的DNA溶液作為待測(cè)樣品；鮭精DNA溶液作為陰性對(duì)照。以上述終濃度向反應(yīng)管中加入用于擴(kuò)增CaMV 35S啟動(dòng)子的引物對(duì)、用于定量測(cè)定CaMV 35S啟動(dòng)子的探針和Master Mix，獲得反應(yīng)溶液。
同樣，在內(nèi)源基因zSSIIb的定量測(cè)定中，向反應(yīng)管中加入7種樣品中的每一種，包括以5種濃度(每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)10、50、250、1000、50000個(gè)分子)制備的標(biāo)準(zhǔn)分子pMul4 BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)重組DNA序列；從每種玉米雙盲樣品中提取的DNA溶液作為待測(cè)樣品；鮭精DNA溶液作為陰性對(duì)照。以上述終濃度向反應(yīng)管中加入用于擴(kuò)增zSSIIb的引物對(duì)、用于定量測(cè)定zSSIIb的探針和Master Mix，獲得反應(yīng)溶液。
在反應(yīng)過(guò)程中，根據(jù)熒光強(qiáng)度的增加，隨時(shí)間變化測(cè)定PCR擴(kuò)增所致探針降解的程度。因此，通過(guò)生成作為標(biāo)準(zhǔn)重組DNA序列(x4)的5種樣品的圖(循環(huán)次數(shù)-熒光強(qiáng)度)，能夠獲得待擴(kuò)增的靶DNA序列的分子數(shù)與反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)射的熒光強(qiáng)度達(dá)到特定值所需時(shí)間的關(guān)聯(lián)函數(shù)。用此關(guān)聯(lián)函數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠確定待擴(kuò)增的CaMV 35S啟動(dòng)子的DNA序列和反應(yīng)開(kāi)始時(shí)樣品中存在的待擴(kuò)增的zSSIIb DNA序列的分子數(shù)(表10)。
用于定量測(cè)定的裝置ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(PE Biosystems)能夠同時(shí)對(duì)96個(gè)樣品進(jìn)行反應(yīng)。因此，利用該裝置能夠在一次定量PCR中進(jìn)行上述檢測(cè)方法。
利用實(shí)施例10獲得的定量比，根據(jù)式(I)，可以將DNA序列的分子數(shù)的測(cè)定值轉(zhuǎn)化為攜帶CaMV 35S啟動(dòng)子的各基因重組體的含量比。在該實(shí)驗(yàn)中，由于沒(méi)有得到關(guān)于樣品中任何基因重組系的含量的信息，所以必須對(duì)所有3種基因重組系計(jì)算定量比，并將其表示為轉(zhuǎn)化值。然而，能夠在一次定量PCR中方便地測(cè)定樣品中基因重組系的含量比(表10)。
表10.基因重組體含量比的定量(1)
*1分別含有1％Bt11、Event176和MON810的雙盲樣品(共含有3％的基因重組玉米)*2分別含有5％Bt11、Event176和MON810的雙盲樣品(共含有15％的基因重組玉米)實(shí)施例14利用標(biāo)準(zhǔn)分子對(duì)基因重組體含量比的定量(2)如實(shí)施例13制備的相同的雙盲樣品，分別針對(duì)3種基因重組玉米系特異的DNA序列和玉米的特異內(nèi)源基因zSSIIb進(jìn)行定量PCR，測(cè)定樣品中各基因重組玉米系的含量比。用獲得的定量比的結(jié)果和總和確定樣品中基因重組體的定量比。同實(shí)施例13一樣，用實(shí)施例5所述的pMul4BamHI消化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)材料。
在該實(shí)驗(yàn)中，為了模擬分析的實(shí)際情況，假定分析者沒(méi)有任何關(guān)于樣品中3種玉米基因重組系的含量的信息。
反應(yīng)溶液的組成、反應(yīng)條件和分析方法與實(shí)施例13相同，不同之處在于分別定量測(cè)定對(duì)Bt11系、Event176系和MON810系的子代品種特異的序列而非測(cè)定CaMV 35S啟動(dòng)子。即，在該實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)包括zSSIIb在內(nèi)的總共4種待擴(kuò)增靶DNA序列進(jìn)行定量PCR。因此，在該實(shí)驗(yàn)中，ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(PE Biosystems)一共運(yùn)行3次。
在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的待擴(kuò)增的各種靶DNA序列的分子數(shù)與反應(yīng)管發(fā)出的熒光強(qiáng)度達(dá)到特定值所需的時(shí)間之間的相關(guān)性繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線能確定反應(yīng)開(kāi)始時(shí)試驗(yàn)樣品中各個(gè)待擴(kuò)增的系特異性靶DNA序列的數(shù)量和zSSIIb的待擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)的數(shù)量(表11)。
同實(shí)施例13一樣，利用實(shí)施例10測(cè)定的定量比，根據(jù)式(I)，可以將DNA序列的分子數(shù)的測(cè)定值轉(zhuǎn)化為樣品中各基因重組玉米系的含量比。在該實(shí)驗(yàn)中，由于是對(duì)基因重組系特異的DNA序列進(jìn)行定量測(cè)定，所以不用擔(dān)心象實(shí)施例13中發(fā)現(xiàn)的那樣，測(cè)定值可能變化。上述方法能更精確地測(cè)定樣品中各基因重組體的含量比，盡管為了進(jìn)行測(cè)定定量PCR裝置必須運(yùn)行多次(表11)。
表11.基因重組體含量比的定量(2)
*1分別含有1％Bt11、Event176和MON810的雙盲樣品(共含有3％的基因重組玉米)*2分別含有5％Bt11、Event176和MON810的雙盲樣品(共含有15％的基因重組玉米)根據(jù)本發(fā)明的方法，可以確定懷疑至少含有一種基因重組系的樣品中可能的基因重組系的存在與否；以簡(jiǎn)單的方式確定含量比未知的樣品中基因重組體的含量比；能夠精確測(cè)定群體中基因重組體的含量比；特別是，能夠精確測(cè)定系含量比未知的樣品中特定基因重組系的含量比。具體而言，本發(fā)明的方法采用一種標(biāo)準(zhǔn)分子，該分子中含有用于定量測(cè)定重組DNA序列和對(duì)應(yīng)于重組DNA序列的物種所共有的內(nèi)源基因的DNA序列的區(qū)域。由于標(biāo)準(zhǔn)分子根據(jù)所導(dǎo)入?yún)^(qū)域的模式通常以整數(shù)比含有用于定量測(cè)定的區(qū)域，因此能夠以良好的重復(fù)性測(cè)定式(II)代表的定量比。因此，本發(fā)明的方法能夠精確地測(cè)定樣品中各種特定基因重組系的含量比。
由于在確定定量比之后純化形式的基因重組體變得不再是必需的，所以能夠消除分析者獲得標(biāo)準(zhǔn)分子的困難。
而且，通過(guò)提供本發(fā)明的用于檢測(cè)基因重組體的標(biāo)準(zhǔn)分子，提高了針對(duì)基因重組體的分子生物學(xué)試驗(yàn)的實(shí)際用途，由此，具有廣泛適用性的精確分析方法可廣泛應(yīng)用。
序列表<110>朝日啤酒株式會(huì)社日本制粉株式會(huì)社獨(dú)立行政法人 食品綜合研究所<120>轉(zhuǎn)化子的定量檢測(cè)方法和用于該方法的標(biāo)準(zhǔn)分子<130>Y1I0978<140>
<141>
<150>JP 2000-326738<151>2000-10-26<160>80<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>1tggacaacaa cccaaacatc aa 22<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>2tggattttgg ttttaggaat tagaaa 26<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>3gcactgaatt tgtgaaccc 19<210>4
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>4ctatattttg ttttctatcg c21<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>5attgatgtga tatctccact gacgt25<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>6ttatcctagt ttgcgcgcta 20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>7atctttggcc ttggtagttt g21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>8attgcgggac tctaatcata a21
<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>9attgatgtga tatctccact gacgt25<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>10actaagggtt tcttatatgc tcaaca 26<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>11cactacaaat gccatcattg cgata25<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>12gatgtttggg ttgttgtcca t 21<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>13
ccttcgcaag acccttcctc tata 24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>14atcctggcgc ccatggcctg catg 24<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>15ctcccaatcc tttgacatct gc 22<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>16tcgatttctc tcttggtgac agg 23<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述玉米的探針SSIIb<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-a<220>
<221>修飾的堿基<222>(25)<223>a-Tamra
<400>17ngcaaagtca gagcgctgca atgcn25<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>18attgatgtga tatctccact gacgt25<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>19cctctccaaa tgaaatgaac ttcct25<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述CaMV35S啟動(dòng)子的探針<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-c<220>
<221>修飾的堿基<222>(27)<223>t-Tamra<400>20nccactatcc ttcgcaagac ccttccn 27<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物
<400>21gtcttgcgat gattatcata taatttctg29<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>22cgctatattt tgttttctat cgcgt25<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述NOS終止子的探針<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-a<220>
<221>修飾的堿基<222>(30)<223>a-Tamra<400>23ngatgggttt ttatgattag agtcccgcan 30<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>24tgttcaccag cagcaaccag 20<210>25<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物
<400>25actccacttt gtgcagaaca gatct25<210>26<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Event176的探針<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-c<220>
<221>修飾的堿基<222>(25)<223>a-Tamra<400>26ncgacgtgac cgactaccac atcgn25<210>27<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>27ttagcgctca tgtgttcaat tct 23<210>28<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>28cggcaacagg attcaatctt aa 22<210>29<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Bt11的探針
<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-a<220>
<221>修飾的堿基<222>(29)<223>c-Tamra<400>29ncattgaccg tattgagttt gtgcctgcn29<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>30gaccttcccc gactacttcg a21<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>31atcgcaagac cggcaaca18<210>32<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述GA21的探針<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-c<220>
<221>修飾的堿基<222>(27)<223>t-Tamra<400>32ngaatttccc cgatcgttca aacattn 27
<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>33gccagttagg ccagttaccc a21<210>34<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>34tgagcgaaac cctataagaa ccct 24<210>35<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述T25的探針<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-c<220>
<221>修飾的堿基<222>(26)<223>t-Tamra<400>35natgcccgct gaaatcacca gtctcn 26<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>36gatgccttct ccctagtgtt ga 22
<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>37ggatgcactc gttgatgttt g21<210>38<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述MON810的探針<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-a<220>
<221>修飾的堿基<222>(26)<223>a-Tamra<400>38ngataccaag cggccatgga caacan 26<210>39<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>39caatgcgttc tccaccaagt act 23<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>40aaaagaccac aacaagccgc 20
<210>41<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Bt11的探針<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-c<220>
<221>修飾的堿基<222>(27)<223>a-Tamra<400>41ngaccatgga caacaaccca aacatcn 27<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>42atccggttgg aaagcgactt 20<210>43<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>43gaagcctcgg caacgtca18<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述GA21的探針<220>
<221>修飾的堿基
<222>(1)<223>Fam-a<220>
<221>修飾的堿基<222>(20)<223>g-Tamra<400>44naggatccgg tgcatggccn 20<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>45gccctctact ccaccccca 19<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>46gcccatctgc aagccttttt 20<210>47<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述大豆le1的探針<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-a<220>
<221>修飾的堿基<222>(26)<223>c-Tamra<400>47ngcttcgccg cttccttcaa cttcan 26
<210>48<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>48cctttaggat ttcagcatca gtgg 24<210>49<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>49gacttgtcgc cgggaatg18<210>50<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Roundup Reay Soy的探針<220>
<221>修飾的堿基<222>(1)<223>Fam-a<220>
<221>修飾的堿基<222>(19)<223>c-Tamra<400>50ngcaaccgcc cgcaaatcn 19<210>51<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>51catttggaga ggtcgatttc tctcttg 27
<210>52<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>52gagagaaatc gacctctcca aatgaaa 27<210>53<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>53tatcacatca atgcccgggc gaatcctgtt gccgg 35<210>54<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>54ggcaacagga ttcgcccggg cattgatgtg atatct36<210>55<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>55aaactaggat aaatcgcaag accggca 27<210>56<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>56tcggggaagc tctgagcgaa accctat 27
<210>57<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>57ggcctaactg gcggatgcac tcgttga 27<210>58<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>58acgagtgcat ccgccagt ta ggccagt 27<210>59<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>59ggagaaggca tcgactgact actccac 27<210>60<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>60gagtagtcag tcgatgcctt ctcccta 27<210>61<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物
<400>61tgctggtgaa cacggcaaca ggattca 27<210>62<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>62atcctgttgc cgtgttcacc agcagca 27<210>63<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>63cggcgacaag tcgcccatct gcaagcc 27<210>64<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>64ttgcagatgg gcgacttgtc gccggga 27<210>65<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>65aaactaggat aaatccggtt ggaaagc 27<210>66<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>66ttccaaccgg atttatccta gtttgcg 27<210>67<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>67tgccgaggct tctgagcgaa accctat 27<210>68<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>68gggtttcgct cagaagcctc ggcaacg 27<210>69<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>69tgctggtgaa catcaatgcg ttctcca 27<210>70<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>70agaacgcatt gatgttcacc agcagca 27<210>71<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>71ggagtagagg gcttatccta gtttgcg 27<210>72<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>72aaactaggat aagccctcta ctccacc 27<210>73<211>1102<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于定量檢測(cè)玉米轉(zhuǎn)化子的標(biāo)準(zhǔn)分子的擴(kuò)增區(qū)<400>73ctcccaatcc tttgacatct gctccgaagc aaagtcagag cgctgcaatg caaaacggaa 60cgagtggggg cagcagcgcg agcaccgccg cgccggtgtc cggacccaaa gctgatcatc 120catcagctcc tgtcaccaag agagaaatcg acctctccaa atgaaatgaa cttccttata 180tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 240tatcacatca atgcccgggc gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 300ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 360tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 420tagcgcgcaa actaggataa atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 480attgccaaat gtttgaacga tcggggaaat tcgtcgaagc ttcttctaga gcttaattct 540tgacgaaagt gctcagcaca tcgaagtagt cggggaaggt ctgagcgaaa ccctataaga 600accctaattc ccttatctgg gaactactca cacattatta tagagagaga tagatttgta 660gagagagact ggtgatttca gcgggcatgc ctgcaggtcg actcagatct gggtaactgg 720cctaactggc ggatgcactc gttgatgttt gggttgttgt ccatggccgc ttggtatctg 780cattacaatg aaatgagcaa agactatgtg agtaacactg gtcaacacta gggagaaggc 840atcgactgac tactccactt tgtgcagaac agatctagag ctcctacacc tgatcgatgt 900ggtagtcggt cacgtcggtc ttcaggccga tctggttgct gctggtgaac acggcaacag 960gattcaatct taagaaactt tattgccaaa tgtttgaacg atcctgatct tcagtactca 1020gcctcgaagg taacttcggc aggcacaaac tcaatacggt caatgtacac ttcattgcca 1080gaattgaaca catgagcgct aa 1102<210>74<211>1071<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于定量檢測(cè)玉米轉(zhuǎn)化子的標(biāo)準(zhǔn)分子的擴(kuò)增區(qū)
<400>74ctcccaatcc tttgacatct gctccgaagc aaagtcagag cgctgcaatg caaaacggaa 60cgagtggggg cagcagcgcg agcaccgccg cgccggtgtc cggacccaaa gctgatcatc 120catcagctcc tgtcaccaag agagaaatcg acctctccaa atgaaatgaa cttccttata 180tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 240tatcacatca atgcccgggc gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 300ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 360tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 420tagcgcgcaa actaggataa atccggttgg aaagcgactt ggaccccggc agcttgacgg 480tgccggagat ctccttgatg ggctgcagca cgatctcctc ggcgccggcc atgcaccgga 540tccttccgcc gttgctgacg ttgccgaggc ttctgagcga aaccctataa gaaccctaat 600tcccttatct gggaactact cacacattat tatagagaga gatagatttg tagagagaga 660ctggtgattt cagcgggcat gcctgcaggt cgactcagat ctgggtaact ggcctaactg 720gcggatgcac tcgttgatgt ttgggttgtt gtccatggcc gcttggtatc tgcattacaa 780tgaaatgagc aaagactatg tgagtaacac tggtcaacac tagggagaag gcatcgactg 840actactccac tttgtgcaga acagatctag agctcctaca cctgatcgat gtggtagtcg 900gtcacgtcgg tcttcaggcc gatctggttg ctgctggtga acatcaatgc gttctccacc 960aagtacttca acttctgggt tactcaagca gttgtatgga atgcattcgt tgatgtttgg 1020gttgttgtcc atggtcgact ctagaggatc cgcggcttgt tgtggtcttt t 1071<210>75<211>239<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于定量檢測(cè)玉米轉(zhuǎn)化子的標(biāo)準(zhǔn)分子的擴(kuò)增區(qū)<400>75cctttaggat ttcagcatca gtggctacag cctgcatgct tcacggtgca agcagccggc 60ccgcaaccgc ccgcaaatcc tctggccttt ccggaaccgt ccgcattccc ggcgacaagt 120cgcccatctg caagcctttt tgtgtcaggg gcatagaagg tgaagttgaa ggaagcggcg 180aagctggcaa cgctaccggt ttctttgtcc caaatgtgga tgggggtgga gtagagggc 239<210>76<211>528<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于定量檢測(cè)大豆轉(zhuǎn)化子的標(biāo)準(zhǔn)分子的擴(kuò)增區(qū)<400>76cctttaggat ttcagcatca gtggctacag cctgcatgct tcacggtgca agcagccggc 60ccgcaaccgc ccgcaaatcc tctggccttt ccggaaccgt ccgcattccc ggcgacaagt 120cgcccatctg caagcctttt tgtgtcaggg gcatagaagg tgaagttgaa ggaagcggcg 180aagctggcaa cgctaccggt ttctttgtcc caaatgtgga tgggggtgga gtagagggct 240tatcctagtt tgcgcgctat attttgttt tctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga 300ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata acgtcatgca ttacatgtta attattacat 360gcttaacgta attcaacaga aattatatga taatcatcgc aagaccggca acaggattcg 420cccgggcatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct 480tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagagg 528<210>77<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>77tcccaatcct ttgacatctg ct<210>78<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>8gacaggagct gatggatgat cag<210>79<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>79ccaatccttt gacatctgct cc<210>80<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>80gatcagcttt gggtccgga
權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)方法，用于定量測(cè)定至少含有一種基因重組系的樣品中基因重組體的含量比，該方法包括(i)對(duì)來(lái)源于樣品中基因重組體的DNA樣品中可能存在的基因重組體特異的DNA序列進(jìn)行定量PCR，并對(duì)對(duì)應(yīng)于該基因重組體的物種所共有的內(nèi)源DNA序列進(jìn)行定量PCR，其中使用一種在單個(gè)分子上含有所述基因重組體特異的DNA序列和該內(nèi)源DNA序列的分子作為標(biāo)準(zhǔn)分子；(ii)根據(jù)定量PCR的結(jié)果，確定樣品中基因重組體特異的DNA序列的數(shù)量；(iii)根據(jù)定量PCR的結(jié)果，確定樣品中內(nèi)源DNA序列的數(shù)量；和(iv)根據(jù)式(I)確定基因重組體的含量比(樣品中基因重組體的含量比)＝100×[(樣品中基因重組體特異的DNA序列的分子數(shù))/(樣品中內(nèi)源DNA序列的分子數(shù))]/(定量比)(％)(I)其中，定量比是根據(jù)式(II)預(yù)先計(jì)算的值中的任何一種(定量比)(％)＝(來(lái)自單個(gè)基因重組系的基因重組體特異的DNA序列的分子數(shù))/(該基因重組體中所述內(nèi)源DNA序列的分子數(shù))(II)
2.一種定量檢測(cè)方法，用于定量測(cè)定至少含有一種基因重組系的樣品中各基因重組體的分別的含量比，該方法包括(i)對(duì)來(lái)自樣品中基因重組體的DNA樣品中可能存在的單個(gè)基因重組系特異的DNA序列進(jìn)行定量PCR，并對(duì)對(duì)應(yīng)于基因重組體的物種所共有的內(nèi)源DNA序列進(jìn)行定量PCR，其中使用一種在單個(gè)分子上含有該單個(gè)基因重組系特異的DNA序列和該內(nèi)源DNA序列的分子作為標(biāo)準(zhǔn)分子；(ii)根據(jù)所述定量PCR的結(jié)果，確定樣品中該單個(gè)基因重組系特異的DNA序列的數(shù)量；(iii)根據(jù)定量PCR的結(jié)果，確定樣品中所述內(nèi)源DNA序列的數(shù)量；和(iv)根據(jù)式(III)確定該基因重組體的含量比(樣品中單個(gè)基因重組系的含量比)＝100×[(樣品中對(duì)應(yīng)于每種基因重組體的DNA序列的分子數(shù))/(樣品中所述內(nèi)源DNA序列的分子數(shù))]/(定量比)(％)(III)其中，定量比是根據(jù)式(II)預(yù)先計(jì)算的值(定量比)(％)＝(來(lái)自所述單個(gè)基因重組系的基因重組體特異的DNA序列的分子數(shù))/(該基因重組體中所述內(nèi)源DNA序列的分子數(shù)) (II)
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中對(duì)樣品中基因重組系特異的DNA序列的數(shù)量和內(nèi)源DNA序列的數(shù)量的測(cè)定包括(i)對(duì)樣品中可能存在的基因重組系特異的DNA序列進(jìn)行定量PCR，對(duì)對(duì)應(yīng)于基因重組體的物種所共有的內(nèi)源DNA序列進(jìn)行定量PCR；和(ii)監(jiān)測(cè)作為PCR中擴(kuò)增指示的信號(hào)，確定信號(hào)達(dá)到預(yù)定閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線將此循環(huán)數(shù)轉(zhuǎn)化為反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的分子數(shù)，其中，該標(biāo)準(zhǔn)曲線代表待擴(kuò)增的DNA序列數(shù)與作為擴(kuò)增指示的信號(hào)之間的關(guān)系。
4.權(quán)利要求3的方法，其中作為擴(kuò)增指示的信號(hào)是熒光，該熒光來(lái)源于熒光標(biāo)記的探針，該熒光能夠根據(jù)因DNA序列PCR擴(kuò)增引起的探針降解而改變。
5.權(quán)利要求3的方法，其中該標(biāo)準(zhǔn)曲線按如下獲得(a)在可根據(jù)內(nèi)部DNA序列擴(kuò)增或基因重組體特異的DNA序列擴(kuò)增的進(jìn)展提高熒光強(qiáng)度的探針存在下，用擴(kuò)增基因重組系特異的DNA序列或?qū)?yīng)于該重組體的物種所共有的內(nèi)部DNA序列的引物，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行PCR；(b)每隔預(yù)定的循環(huán)次數(shù)，監(jiān)測(cè)每個(gè)反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，反應(yīng)中用數(shù)量確定的標(biāo)準(zhǔn)分子作為反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的模板DNA；(c)同步測(cè)定熒光增強(qiáng)的閾值(ΔRn)，在熒光強(qiáng)度和循環(huán)數(shù)之間觀察到指數(shù)關(guān)系；和(d)以PCR循環(huán)數(shù)作為縱軸，以反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的模板DNA的分子數(shù)作為橫軸，將達(dá)到閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)對(duì)反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的DNA模板分子數(shù)作圖。
6.一種重組DNA分子，其特征在于，它在單個(gè)分子上含有對(duì)一個(gè)或多個(gè)基因重組系特異的一種DNA序列和對(duì)應(yīng)于該基因重組體的物種所共有的至少一種內(nèi)源DNA序列。
7.一種重組DNA分子，其特征在于，它在單個(gè)分子上含有兩種或多種分別對(duì)各基因重組系特異的DNA序列，和兩種或多種對(duì)應(yīng)于所述基因重組體的非重組體所共有的至少一種內(nèi)源DNA序列。
8.一種重組DNA分子，它在宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制，并且含有根據(jù)權(quán)利要求6或7的重組分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的重組DNA分子，它是大腸桿菌FERM BP-7319所含的質(zhì)粒pMu14。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的重組DNA分子，它是大腸桿菌FERM BP-7320所含的質(zhì)粒pMu15。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的重組DNA分子，它是大腸桿菌FERM BP-7321所含的質(zhì)粒pMu1SL。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的重組DNA分子，它是大腸桿菌FERM BP-7322所含的質(zhì)粒pMu1SL2。
13.權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)準(zhǔn)分子是根據(jù)權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的重組DNA分子。
14.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO15或NO16的序列作為3’-端序列。
15.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO18或NO19的序列作為3’-端序列。
16.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO21或NO22的序列作為3’-端序列。
17.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO24或NO25的序列作為3’-端序列。
18.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO27或NO28的序列作為3’-端序列。
19.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO30或NO31的序列作為3’-端序列。
20.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO33或NO34的序列作為3’-端序列。
21.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO36或NO37的序列作為3’-端序列。
22.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO39或NO40的序列作為3’-端序列。
23.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO42或NO43的序列作為3’-端序列。
24.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO45或NO46的序列作為3’-端序列。
25.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO48或NO49的序列作為3’-端序列。
26.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO17的序列。
27.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO20的序列。
28.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO23的序列。
29.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO26的序列。
30.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO29的序列。
31.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO32的序列。
32.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO35的序列。
33.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO38的序列。
34.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO41的序列。
35.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO44的序列。
36.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO47的序列。
37.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO50的序列。
38.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO77或NO78的序列作為3’-端序列。
39.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO79或NO80的序列作為3’-端序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用PCR方法檢測(cè)基因重組體的方法。提供了一種定量檢測(cè)方法，利用該方法能夠定量測(cè)定含有多種基因重組系的群體中基因重組體的總含量比和各基因重組體的分別的含量比。本發(fā)明的方法包括用一種在單個(gè)分子上含有重組體特異的DNA序列和該重組體相應(yīng)的種共有的內(nèi)源DNA序列的分子作為標(biāo)準(zhǔn)分子，對(duì)重組體特異的DNA序列和對(duì)應(yīng)于該重組體的物種所共有的內(nèi)源DNA序列進(jìn)行PCR，并確定其分子數(shù)的含量比。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1623002SQ0181807
公開(kāi)日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2001年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月26日
發(fā)明者日野明寬, 松岡猛, 栗原秀夫, 吉村倫彰, 進(jìn)藤洋一郎, 布藤聰, 小川真智子 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人食品綜合研究所, 朝日啤酒株式會(huì)社