專利名稱：含治療性蛋白混合物的組合物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由人細(xì)胞系產(chǎn)生的組合物，它包括用于治療病毒感染、癌癥、炎癥性疾病、其它細(xì)胞因子反應(yīng)性疾病的選擇的細(xì)胞因子混合物，以及制造該組合物的方法。
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背景技術(shù)：
細(xì)胞因子被用于治療許多人類病態(tài)，包括癌癥、病毒感染和炎癥。典型地，細(xì)胞因子治療涉及給予單一的、分離的且通常是重組的細(xì)胞因子，如干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)或組織壞死因子(TNF)等。盡管觀察到了一些治療效果，但改善的程度不是最滿意的，且細(xì)胞因子通常與一個或多個另外的治療方法聯(lián)合用藥。
體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、TH1和TH2、肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞，通常產(chǎn)生細(xì)胞因子的復(fù)合混合物。因而，當(dāng)單獨給予單一細(xì)胞因子時沒有最佳的效果是不奇怪的。
因此可能需要制備臨床使用的含有細(xì)胞因子混合物的細(xì)胞因子組合物，它與體內(nèi)產(chǎn)生的天然細(xì)胞因子混合物相似。在產(chǎn)生和分泌高水平細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)這種細(xì)胞因子混合物將是特別需要的。
母案申請序列號09/595,338和其臨時先前申請公開了一種產(chǎn)生高水平細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)方法，通過在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)條件下生長產(chǎn)生細(xì)胞因子的人細(xì)胞。本申請涉及通過相關(guān)方法產(chǎn)生的細(xì)胞因子混合物，這些方法是獲得改善的細(xì)胞因子組合物的方法、以及應(yīng)用含細(xì)胞因子混合物組合物的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了含有人細(xì)胞因子混合物的組合物，它通過以下步驟制備培養(yǎng)能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物并以細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和/或抗凋亡蛋白過度表達(dá)為特征的人細(xì)胞系，處理細(xì)胞系以有效增強細(xì)胞因子混合物的產(chǎn)生，并收集由該細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。細(xì)胞系可通過激發(fā)或激發(fā)和誘導(dǎo)來處理。
可以用編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和/或抗凋亡蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化、或通過亞克隆和選擇來產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)細(xì)胞系。
在一種方法中，細(xì)胞因子通過選擇的細(xì)胞因子的共純化而被收集。
在本發(fā)明一個用于癌癥治療的方面，細(xì)胞因子混合物包括選自以下的兩種或更多種細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、干擾素-ω(IFN-ω)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、自然殺傷增強因子(NKEF)、自然殺傷細(xì)胞刺激因子(NKSF)、TNF-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在本發(fā)明另一個用于病毒感染治療的方面，細(xì)胞因子混合物包括選自以下的兩種或更多種細(xì)胞因子干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、干擾素-ω(IFN-ω)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白介素-8(IL-8)、白介素-12(IL-12)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在本發(fā)明另一個用于炎癥狀態(tài)治療的方面，細(xì)胞因子混合物包括選自以下的兩種或更多種細(xì)胞因子白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了在細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)人細(xì)胞因子混合物的方法，它包括以下步驟培養(yǎng)能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物并以細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和/或抗凋亡蛋白過度表達(dá)為特征的人細(xì)胞系，處理細(xì)胞系以有效增強細(xì)胞因子混合物的產(chǎn)生，并收集由該細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。細(xì)胞系可通過激發(fā)或激發(fā)和誘導(dǎo)來處理。
在本發(fā)明的實施過程中，可以使用此方法生產(chǎn)上面列出的選擇的細(xì)胞因子混合物以用于癌癥的治療、病毒感染的治療和/或炎癥狀態(tài)的治療。
從以下發(fā)明的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將更明顯。
附圖描述

圖1顯示了親代野生型(WT)和表達(dá)CrmA的(Crma-#2)MG-63細(xì)胞在超誘導(dǎo)和用仙臺病毒誘導(dǎo)后，檢測細(xì)胞活力的碘化丙啶測定的結(jié)果。
圖2顯示了親代野生型(WT)和表達(dá)CrmA的(Crma-#2)MG-63細(xì)胞在超誘導(dǎo)和仙臺病毒處理后干擾素-β的產(chǎn)生。
圖3顯示了0、2mM、4mM和8mM 2-氨基嘌呤(2-AP；PKR抑制劑)對超誘導(dǎo)后表達(dá)CrmA的(Crma-#2)MG-63細(xì)胞中干擾素-β產(chǎn)生的影響。
圖4A和4B顯示分別被仙臺病毒(4A)和polyIC(4B)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，6A、A9和WT細(xì)胞系的存活百分比。
圖5A和5B顯示分別用仙臺病毒(5A)和polyIC(5B)處理后，Namalwa細(xì)胞轉(zhuǎn)化體6A、A9和WT細(xì)胞系中產(chǎn)生的IFN-α的水平。
圖6顯示了Namalwa野生型(WT)和Namalwa PKR-過度表達(dá)細(xì)胞系Namalwa PKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D1.G7.C1.A9.的細(xì)胞培養(yǎng)中，TNF-β、IL-6和IL-8細(xì)胞因子的共表達(dá)。
發(fā)明的詳細(xì)說明I.定義除非另有所指，這里所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有對本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員而言相同的含意。從業(yè)人員對于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，特別指定Sambrook等人，1989和Ausubel FM等人，1993?？梢岳斫猓景l(fā)明不限于描述的特定方法學(xué)、方案和試劑，因為這些可以變化。
在此所用，術(shù)語“載體”指被設(shè)計用于在不同宿主細(xì)胞間傳遞的核酸構(gòu)建物?！氨磉_(dá)載體”指能夠在外源細(xì)胞中摻入并表達(dá)異種DNA片段的載體。許多原核和真核表達(dá)載體可從商業(yè)渠道獲得。對合適表達(dá)載體的選擇在本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員知識范圍內(nèi)?？寺』虮磉_(dá)載體可含有另外的組成部分，如表達(dá)載體可有兩個復(fù)制系統(tǒng)，因而使其被保留在兩個生物體中，如在人細(xì)胞中表達(dá)，而在原核宿主中克隆和擴(kuò)增?？寺『捅磉_(dá)載體典型地還含有一個可篩選的標(biāo)記。
在此所用，術(shù)語“編碼可篩選標(biāo)記的核苷酸序列”指能夠在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的核苷酸編碼序列，其中可篩選標(biāo)記的表達(dá)使含有表達(dá)基因的細(xì)胞具有在篩選試劑存在的情況下生長的能力。
在此所用，術(shù)語“啟動子”指具有引導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄功能的核酸序列。啟動子通常會適合于要表達(dá)靶基因的宿主細(xì)胞。對于表達(dá)特定的基因，啟動子與其它轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸序列(“調(diào)控序列”)結(jié)合在一起是必要的。通常，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列包括但不限于啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄啟始和終止序列、翻譯啟始和終止序列、和增強子或活化子序列。啟動子可是構(gòu)成性的或可誘導(dǎo)的，可以是天然存在的、生物工程的或雜交的啟動子。雜交啟動子結(jié)合多個啟動子的元件，通常為本領(lǐng)域已知，并被用于實施本發(fā)明。
術(shù)語“調(diào)控序列”指在特定宿主有機(jī)體中，對于表達(dá)可有效連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合于原核細(xì)胞的調(diào)控序列典型地包括啟動子，任選地是操縱基因序列和核糖體結(jié)合位點。已知真核細(xì)胞使用啟動子、多聚腺苷信號和增強子。
“異源”核酸構(gòu)建體或序列包括在其表達(dá)的細(xì)胞中的非本身具有的序列部分。對于調(diào)控序列而言，異源指對其目前調(diào)節(jié)的相同的基因表達(dá)實質(zhì)上沒有作用的調(diào)控序列(即啟動子或增強子)。通常，異源核酸序列不是它們所存在的細(xì)胞或部分基因組的內(nèi)源性序列，并已經(jīng)通過感染、轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔等被加入細(xì)胞中。“異種”核酸構(gòu)建物可含有調(diào)控序列/DNA編碼序列聯(lián)合，與天然細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控序列/DNA編碼序列聯(lián)合相同或不同。
在此所用，相對于重組DNA構(gòu)建物或載體，術(shù)語“可有效連接的”指為有效的控制所選擇的編碼序列，直接相互連接的重組DNA構(gòu)建物或載體的核苷酸組分。通常，“可有效連接的”DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是相鄰的并在閱讀框架內(nèi)。但是，增強子不是一定要相鄰的。連接是通過在合適的限制性位點的連接實現(xiàn)的。如果這種位點不存在，根據(jù)慣例使用合成的寡核苷酸接頭或連接子。
在此所用，術(shù)語“基因”是指參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA片段，它可以包括或不包括編碼區(qū)的前導(dǎo)和后續(xù)區(qū)，如5’非翻譯(5’UTR)或“前導(dǎo)”序列和3’UTR或“尾”序列，以及在各個編碼片段(外顯子)間的插入序列(內(nèi)含子)。
“用載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞”指已經(jīng)與載體接觸并已吸收載體的細(xì)胞，或者作為自我復(fù)制的基因組分或通過整合進(jìn)細(xì)胞基因組，以這種方式使載體編碼的蛋白表達(dá)。表達(dá)可在載體中構(gòu)成性啟動子控制之下，此時蛋白在沒有誘導(dǎo)劑存在的情況下發(fā)生表達(dá)，或在可誘導(dǎo)的啟動子的控制之下，為獲得載體基因的表達(dá)或高水平表達(dá)需要在培養(yǎng)基中存在誘導(dǎo)劑。
在此所用，“重組”包括細(xì)胞或載體，它們已經(jīng)通過導(dǎo)入異種核酸序列而被修飾，或該細(xì)胞來源于如此修飾的細(xì)胞。因此，作為故意的人為干預(yù)的結(jié)果，重組細(xì)胞具有修飾的基因表達(dá)，如在天然(非重組)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)相同形式的基因表達(dá)，或表達(dá)了另外異常表達(dá)的、低表達(dá)的或完全不表達(dá)的天然基因。
在此所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)基因的”，就哺乳動物細(xì)胞而言是指在其基因組中整合進(jìn)了非本身的(異源的)核酸序列的哺乳動物細(xì)胞，此基因組保持2或多代。
在此所用，術(shù)語“表達(dá)”指根據(jù)基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過程。此過程典型地包括轉(zhuǎn)錄和翻譯，但在某些情況下可指沒有翻譯的轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)”指細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)物包括RNA前體、mRNA、多肽、翻譯后加工的多肽、及其衍生物，并包括來自其它種屬的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如鼠或猿的酶類。
由此得出結(jié)論，術(shù)語“PKR表達(dá)”指編碼PKR的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)物包括RNA前體、mRNA、多肽、翻譯后加工的多肽、及其衍生物，并包括來自其它種屬的PKRs如鼠或猿的酶類。
在此所用，術(shù)語“生物學(xué)活性”和“生物學(xué)活性的”指由培養(yǎng)的細(xì)胞系中特定蛋白引起的活性。應(yīng)當(dāng)理解，這種蛋白的“生物學(xué)活性”可依培養(yǎng)條件而有些不同并通常報告為活動的范圍。因此，“生物學(xué)無活性”形式的蛋白指一種以干擾蛋白已知活性的方式已經(jīng)修飾了的蛋白形式。
在此所用，術(shù)語“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的生物學(xué)活性”和“生物學(xué)活性的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子”指與特定細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子或其任何片斷、衍生物或類似物相關(guān)的任何生物學(xué)活性，如酶活性，等。
在此所用，術(shù)語“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性的正常水平”和“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)的正常水平”指細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)的水平，是在存在的未修飾的、未誘導(dǎo)的、非激發(fā)的或未感染的特定類型細(xì)胞，如特定類型的親代細(xì)胞系中測定的。應(yīng)當(dāng)理解，這種“正常的”細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)被報告為細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)的范圍，它通常是對特定類型細(xì)胞的觀察，該細(xì)胞尚未通過導(dǎo)入編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列而被修飾或因細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)而被篩選。
由此得出結(jié)論，術(shù)語“PKR的生物學(xué)活性”和“PKR的生物學(xué)活動”指與PKR或PKR的片斷、衍生物或類似物相關(guān)的任何生物學(xué)活性，如酶活性，特別包括自動磷酸化和涉及底物磷酸化的激酶活性，底物例如真核細(xì)胞翻譯啟動因子2(eIF-2)和轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB。
“正常”細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)的范圍可依培養(yǎng)條件而有些不同。例如，U937細(xì)胞系可以有與Namalwa細(xì)胞系的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性正常范圍不同的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性正常范圍。由此得出結(jié)論，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過度表達(dá)是指高于通常對特定類型細(xì)胞所觀察到的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)正常范圍的表達(dá)水平，該種細(xì)胞未通過導(dǎo)入編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列而被修飾或因細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)而被篩選，是未刺激的(沒有激發(fā)或誘導(dǎo)的)和非感染的。
因此，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的“過度表達(dá)”是指細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的活性、表達(dá)或產(chǎn)生的范圍超過通常對特定類型細(xì)胞所觀察的范圍，該細(xì)胞未通過導(dǎo)入含有PKR編碼序列的載體而被修飾或因PKR的過度表達(dá)而被篩選，是未刺激的(沒有激發(fā)或誘導(dǎo)的)和非感染的。
在一個優(yōu)選的方面，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)是指，在使用的特定培養(yǎng)條件下，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性、表達(dá)或產(chǎn)生的水平比相同細(xì)胞系的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性、表達(dá)或產(chǎn)生的正常水平至少超過125％(1.25倍或1.25×)，優(yōu)選地至少150％、200％、300％或400％、或500％或以上。換言之，過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系典型地具有一定的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生或表達(dá)水平，該水平超過相同類型細(xì)胞所通常具有的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)生水平至少1.25-倍，并優(yōu)選1.5-倍(1.5×)、2倍(2×)、3倍(3×)、4倍(4×)、5倍(5×)或更高水平，該細(xì)胞未被以有效導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的方法選擇、修飾、激發(fā)或處理。
在某些情況下，過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如PKR的細(xì)胞系具有的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)生水平超過相同類型細(xì)胞所通常具有的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)生水平10倍(10×)或以上，后者在所用的特定培養(yǎng)條件下并未被以有效導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的方法選擇、修飾、激發(fā)或處理。
在此所用，就活性、表達(dá)和產(chǎn)生而言時，術(shù)語“細(xì)胞因子的正常水平”和“蛋白的正常水平”，指在特定類型親代細(xì)胞中存在的細(xì)胞因子或其它蛋白活性、表達(dá)或產(chǎn)生的水平，該親代細(xì)胞未被以有效導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的方法選擇、修飾、激發(fā)或處理。實例包括，未被以導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性、表達(dá)或產(chǎn)生增加的方法選擇、激發(fā)或處理的野生型(“親代”)細(xì)胞系，和不含導(dǎo)入的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼序列的細(xì)胞系。應(yīng)當(dāng)理解，這種“正常的”細(xì)胞因子或其它蛋白活性、表達(dá)或產(chǎn)生被報告為活性、表達(dá)或產(chǎn)生的范圍，通常是對特定類型細(xì)胞的觀察并可依培養(yǎng)條件不同而有些變化。
相對于細(xì)胞因子或蛋白活性、表達(dá)和產(chǎn)生而言時，術(shù)語“增加的水平”和“超過正常水平”可以互換使用。該術(shù)語指細(xì)胞因子或蛋白活性、表達(dá)或產(chǎn)生的水平，在使用的特定培養(yǎng)條件下，比相同細(xì)胞系的親代細(xì)胞所具有的細(xì)胞因子或蛋白活性、表達(dá)或產(chǎn)生水平至少超過125％(1.25倍或1.25×)，優(yōu)選地至少150％、200％、300％或400％、或500％或以上，該親代細(xì)胞未被以有效導(dǎo)致細(xì)胞因子或蛋白活性、表達(dá)、或產(chǎn)生增加的方法選擇、修飾、激發(fā)或處理。在某些情況下，細(xì)胞因子或蛋白活性、表達(dá)、或產(chǎn)生，比親代細(xì)胞系增加10倍(10×)或以上。
在此所用，術(shù)語“抑制凋亡的細(xì)胞死亡”是指在以細(xì)胞因子或其它蛋白表達(dá)或產(chǎn)生為目的的細(xì)胞系培養(yǎng)期內(nèi)部分或完全地抑制細(xì)胞死亡過程。這種抑制通常是指凋亡細(xì)胞死亡的數(shù)量相對于未以有效抑制凋亡的方法修飾的細(xì)胞系中所觀察到的凋亡細(xì)胞死亡數(shù)量至少下降20％，優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地80％或以上。
術(shù)語“抑制凋亡的蛋白”指，當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時抑制凋亡的蛋白，特別是與細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)和/或細(xì)胞因子誘導(dǎo)相關(guān)的凋亡。有效抑制凋亡的蛋白實例包括但不限于CrmA、Bcl-2a、Bcl-XL、真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eIF-2α)和真核細(xì)胞翻譯起始因子3(eIF-3)的修飾形式、Fas相關(guān)死亡功能區(qū)(FADD)的修飾形式、Bcl-Xs的修飾形式、Bcl-2-同源拮抗劑/扼殺劑(BAK)的修飾形式和BAX的修飾形式，優(yōu)選地Bcl-2a或Bcl-XL。
CrmA、Bcl-2a或Bcl-XL的“過度表達(dá)”分別是指，CrmA、Bcl-2a或Bcl-XL的活性或表達(dá)范圍超過通常在特定類型細(xì)胞中所觀察到的范圍，后者沒有用編碼CrmA、Bcl-2a或Bcl-XL的載體轉(zhuǎn)染，并被刺激以經(jīng)歷凋亡。
“細(xì)胞因子”指一組低分子量調(diào)節(jié)蛋白，它們通過對淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞發(fā)揮的各種作用調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的密度和時間。
“產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞”指在體內(nèi)、也在細(xì)胞培養(yǎng)中分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞，典型地是血液細(xì)胞。這種細(xì)胞包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、TH1和TH2(T-輔助細(xì)胞)、NK(自然殺傷)細(xì)胞、嗜酸性肥大細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、角化細(xì)胞、成骨細(xì)胞衍生的細(xì)胞、黑素細(xì)胞、血小板、各種其它免疫系統(tǒng)細(xì)胞、胰腺基質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和來源自這些細(xì)胞類型的腫瘤細(xì)胞。
在此所用，術(shù)語“修飾”和術(shù)語“細(xì)胞系修飾”就培養(yǎng)的人細(xì)胞系而言時，指在親代人細(xì)胞系中導(dǎo)入編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和/或抗凋亡蛋白的異源核酸序列。在異源核酸構(gòu)建物中的編碼序列可以是異源的或自體來源的。
“選擇”細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的細(xì)胞通常指亞克隆、篩選和選擇過度表達(dá)一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞，并培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的細(xì)胞系。
如下面進(jìn)一步描述的，篩選通常包括生物學(xué)活性的功能檢測、蛋白檢測和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子mRNA檢測。
在此所用，就細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)細(xì)胞系而言時，術(shù)語“激發(fā)”典型地指將細(xì)胞與多種試劑中的任意一種接觸，如佛波醇肉豆蔻酸醋酸酯(PMA)或干擾素-β。
術(shù)語“誘導(dǎo)”或“誘發(fā)”在此所用就細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)細(xì)胞系而言時，典型地指將細(xì)胞與微生物誘導(dǎo)劑接觸，如仙臺病毒、腦心肌炎病毒、單純皰疹病毒或新城疫病毒；或?qū)⒓?xì)胞與至少一種選自如下非微生物誘導(dǎo)劑接觸poly(I)poly(C)(polyIC)、或polyr(I)poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、環(huán)己酰胺、放線菌素D、丁酸鈉、鈣離子載體、植物血凝素(PHA)、脂多糖(LPS)及其衍生物，如3-脫酰LPS和硫酸軟骨素。誘導(dǎo)劑的特殊實施例包括誘導(dǎo)前列腺素E2的表面粗糙度、誘導(dǎo)TGF-β的鈦顆粒、誘導(dǎo)TNF-α的四氮化三硅、誘導(dǎo)EPO和VEGF的低氧、以及誘導(dǎo)osteoprotegerin的IL-1-α、TNF-α和TNF-β。
在此所用，就細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)細(xì)胞系而言時，術(shù)語“處理”和“處理的”通常指誘導(dǎo)，但可用于關(guān)于激發(fā)和/或誘導(dǎo)和/或與附加試劑接觸，如DEAE葡聚糖。
在此所用，術(shù)語“細(xì)胞因子混合物”指由人細(xì)胞系產(chǎn)生的、含有兩種或更多種細(xì)胞因子的組合物。
在此所用，就人受試者或患者而言時，術(shù)語“處理的”、“處理”和“治療”指醫(yī)療性治療、防治性治療和預(yù)防性治療。
II.細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子已知許多因子參與誘導(dǎo)和/或增加細(xì)胞，如人細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)。這些因子包括細(xì)胞因子-和其它蛋白-特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-1、IRF-3和IRF-7)、細(xì)胞因子受體、核因子κB(NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1)、核因子IL-6(NF-IL6)，及特別是PKR。
這些因子中任何因子的表達(dá)或活性增加通常會引起一種或多種編碼細(xì)胞因子的基因高于正常的表達(dá)。在此所用，PKR作為能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子或其它蛋白表達(dá)的一個蛋白實例；但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明考慮多種細(xì)胞因子和蛋白增強因子(在這里定義為“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子”或“CRF”)中的任何一種，如蛋白激酶C(PKC)誘導(dǎo)劑、TNF-α、GM-CSF、EGF和PDGF、G-CSF、TGF、TNF-α或TNF-β、IL-1、IFNs(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)或細(xì)胞因子(IL-8、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白[MIP-1a & -1b]和單核細(xì)胞趨化蛋白[MCPs])；其它細(xì)胞信號傳導(dǎo)因子如PMA、鈣離子載體、丁酸鈉或內(nèi)毒素；polyIC、雙鏈RNA或病毒類似物；PHA，能夠激活PKR的細(xì)胞應(yīng)激信號，包括熱休克、病原體感染如病毒感染；以及增強引起細(xì)胞因子產(chǎn)生增加的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)的任何因子。
通過增加人細(xì)胞中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)/活性，可以增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子較高構(gòu)建物水平的人細(xì)胞培養(yǎng)，或其中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)可被誘導(dǎo)到較高水平者，被用于細(xì)胞因子混合物的生產(chǎn)。
本發(fā)明的方法依賴于使用過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞，而不需要細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的特殊方法。
各種功能已被認(rèn)為是PKR所有，包括真核細(xì)胞啟動因子-2(eIF-2α)的磷酸化，它一旦磷酸化就引起蛋白合成的抑制(Hershey等人，1991)。PKR的此特殊功能被認(rèn)為是解釋IFN-α和IFN-β介導(dǎo)抗病毒和抗增殖活性的機(jī)制之一。PKR的另外生物學(xué)功能是其假定的作為信號轉(zhuǎn)換器的作用，例如通過IκB的磷酸化引起核因子κB(NF-κB)的釋放和活化(Kumar A等人，1994)。
以前已經(jīng)顯示，PKR介導(dǎo)IFN表達(dá)的轉(zhuǎn)錄活化(Der D和Lau AS，1995)。與此觀察一致，通過用反義PKR轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞或表達(dá)PKR缺陷突變體，抑制內(nèi)源性PKR的活性，導(dǎo)致了對病毒感染反應(yīng)的IFN誘導(dǎo)作用減少(Der D和Lau AS，1995)。
還已顯示，用編碼PKR的核酸序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞干擾素產(chǎn)生增加，如共有的美國專利No.6,159,712中所描述的。
還已提示，PKR可作為腫瘤抑制劑和凋亡誘導(dǎo)劑而起作用(見如，Clemens MJ等人，1999；Yeung，Lau等人，1996；Koromilas等人，1992)。最近的結(jié)果表明，PKR活性形式的表達(dá)可能通過上調(diào)Fas受體引發(fā)凋亡(Donze O等人，1999)。
本發(fā)明使用過度產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如PKR的產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞，在產(chǎn)生正常水平的上述一種或多種內(nèi)源性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的條件下，通過導(dǎo)入編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列，或通過培養(yǎng)未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或僅用抑制凋亡的基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞。這可以通過選擇、激發(fā)和/或進(jìn)一步處理如誘導(dǎo)來完成。
關(guān)于PKR，增強產(chǎn)生/表達(dá)的另外方法包括，失活或降低PKR抑制因子p58的水平，p58一般抑制PKR活性。突變、修飾或基因靶向地切除p58已經(jīng)顯示引起PKR活性增強(Barber，G.N.等人，1994)。進(jìn)一步，可以使用能夠增加PKR表達(dá)的天然、合成或重組的PKR激活劑，如PKR活化蛋白、PACT(Patel，R.C.和Sen，G.C.，1998)。
III.本發(fā)明的方法和組合物A.細(xì)胞因子的聯(lián)合細(xì)胞因子通過與其關(guān)聯(lián)的受體結(jié)合，隨后通過引起刺激各種生物化學(xué)過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮其生物學(xué)活性。在某些情況下，這種受體的表達(dá)是被特異的信號調(diào)節(jié)的。細(xì)胞因子可涉及正性或負(fù)性反饋環(huán)，并因此調(diào)節(jié)相同或不同細(xì)胞因子受體的表達(dá)。這種受體可以是產(chǎn)生該細(xì)胞因子的同一類型細(xì)胞，或者是不同類型的細(xì)胞。細(xì)胞因子用來介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。
應(yīng)當(dāng)理解，細(xì)胞因子的細(xì)胞來源對每一個獨立的細(xì)胞因子具有區(qū)別的特征，且一個獨立的細(xì)胞因子可以由多種不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生。此外，特定的細(xì)胞因子(1)可對多個類型的細(xì)胞起作用，(2)對同一細(xì)胞可有多種作用，(3)可與另一個細(xì)胞因子具有一種活性，和(4)可影響其它細(xì)胞因子的合成或作用，如通過拮抗、或協(xié)同其作用。
這里描述的方法在生產(chǎn)治療用兩種或更多種細(xì)胞因子的混合物中是有用的，特別是用于治療癌癥、病毒感染、或炎癥的細(xì)胞因子混合物，如共有的美國申請序列號09/660,468中所細(xì)述的，在此特別合并為參考文獻(xiàn)。
用本發(fā)明方法可以增加其表達(dá)的細(xì)胞因子的實例包括但不限于，干擾素類(α、β和γ)、白介素類(IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-2和IL-4至13)、腫瘤壞死因子α和β(TNF-β)及其各自的可溶性受體(sTNF-R)、集落刺激因子類(粒細(xì)胞集落刺激因子，G-CSF；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，GM-CSF；和IL-3)、血管生成因子類(成纖維細(xì)胞生長因子，F(xiàn)GF；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，VEGF；和血小板衍生的生長因子1和2(PDGF-1和-2)和抗血管生成因子類(血管生成抑素和血管抑素)。
總之，本發(fā)明提供了由細(xì)胞系產(chǎn)生的一個細(xì)胞因子混合物，該細(xì)胞系的特征在于表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和/或表達(dá)抗凋亡蛋白，在合適的條件下培養(yǎng)，可以有效地引起兩種或更多種細(xì)胞因子產(chǎn)生的方式被修飾、選擇、激發(fā)和/或處理。本發(fā)明進(jìn)一步提供了由這種細(xì)胞系產(chǎn)生的細(xì)胞因子類的混合物。在一個優(yōu)選的方法中，細(xì)胞因子由細(xì)胞系產(chǎn)生，分泌進(jìn)培養(yǎng)基中并被分離(從也存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中的不需要的成分中純化)。
優(yōu)選的混合物包括但不限于，(1)干擾素α(IFN-α)和干擾素β(IFN-β)；(2)干擾素α、干擾素β和干擾素γ(IFN-γ)；(3)干擾素α和干擾素γ；(4)干擾素β和干擾素γ；(5)干擾素α、干擾素β和干擾素γ之一加腫瘤壞死因子α(TNF-α)；(6)干擾素α、干擾素β和干擾素γ之一加腫瘤壞死因子β(TNF-β)；(5)干擾素α、干擾素β和干擾素γ之一加白介素-2(IL-2)；(6)干擾素γ和白介素-1b(IL-1b)；(7)干擾素γ和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)；(8)干擾素γ、白介素-4和腫瘤壞死因子α；(9)白介素-2和白介素-12；(10)白介素-2、白介素-4或白介素-6之一和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；(11)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素-2和干擾素α或干擾素β。
一個優(yōu)選的抗癌癥或抗腫瘤組合物包括選自下列的兩種或更多種細(xì)胞因子IL-1-α、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、制瘤素、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、G-CSF、NKEF、NKSF、TRAIL和M-CSF，更優(yōu)選的選自下列因子IL-2、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、TNF-α、自然殺傷細(xì)胞增強因子(NKEF)、自然殺傷細(xì)胞刺激因子(NKSF)、TNF-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和GM-CSF。組合物被優(yōu)選地處理以去除下列細(xì)胞因子IL-3、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1 1、IL-1和TGF-β。為用于治療病毒感染，組合物優(yōu)選地包括選自下列的兩種或更多種細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β、IL-3、IL-7、IL-8、IL-12和GM-CSF，更優(yōu)選地選自IFN-α、IFN-β、TGF-β、IL-8、IL-12和GM-CSF。組合物被優(yōu)選地處理以去除下列細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-11、IL-13、TNF-α、TNF-β和制瘤素。
為用于治療炎癥狀態(tài)，組合物優(yōu)選地包括選自下列的兩種或更多種細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13、IL-1i、IFN-β、TGF-β和IFN-γ，并優(yōu)選地選自IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-β、IFN-γ和TGF-β。組合物被優(yōu)選地處理以從組合物中去除下列細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、TNF-α、TNF-β、TGF-β和制瘤素。
本發(fā)明的細(xì)胞因子混合物或組合物在治療癌癥、病毒感染或炎癥中有用途。一般地，要調(diào)整給予的總細(xì)胞因子劑量以使任何一個細(xì)胞因子成分以較低的劑量用藥，如該細(xì)胞因子單獨給予時正常劑量的10％-50％。
B、生產(chǎn)細(xì)胞因子混合物的細(xì)胞和培養(yǎng)條件本發(fā)明依賴于產(chǎn)生人細(xì)胞因子的細(xì)胞，它們因其產(chǎn)生所需的細(xì)胞因子混合物的能力而被選擇，如適于癌癥治療、病毒感染治療或炎癥治療的混合物。
因此，本發(fā)明提供了由這樣的細(xì)胞組成的細(xì)胞系，相對于相應(yīng)的親代細(xì)胞系(未修飾的、非選擇的、未激發(fā)的和非誘導(dǎo)的)，它們已被以有效引起細(xì)胞因子混合物產(chǎn)生增加的方式被選擇、修飾、激發(fā)，和/或激發(fā)和誘導(dǎo)。
用于產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物的親代細(xì)胞系實例包括但不限于B細(xì)胞類(例如Namalwa、293、CCRF-SB或Raji細(xì)胞)、單核細(xì)胞類(U937、THP-1)、流式1000細(xì)胞、流式4000細(xì)胞、纖維母細(xì)胞類(MRC-5、WI-38、FS-4、FS-7、T98G和MG-63細(xì)胞)、T細(xì)胞類(CCRF-CEM和Jurkat細(xì)胞)和其它細(xì)胞。
用于產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物的親代細(xì)胞系實例包括但不限于，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系細(xì)胞包括T-和B-細(xì)胞、肥大細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、角化細(xì)胞、造骨細(xì)胞衍生的細(xì)胞、黑素細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，血小板，多種其他的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，肺上皮細(xì)胞，胰腺基質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和從這些細(xì)胞類型衍生的腫瘤細(xì)胞。各種細(xì)胞因子的主要細(xì)胞來源在下面的表1中提供。衍生自這些細(xì)胞的細(xì)胞系是應(yīng)用這里描述的方法生產(chǎn)細(xì)胞因子混合物的合適的候補者。
表1.各種細(xì)胞因子的細(xì)胞來源


適合產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物用于治療癌癥(包括實體腫瘤、黑素瘤、白血病、和其它類型的癌癥或新生物)的人細(xì)胞包括B-淋巴細(xì)胞(B-細(xì)胞)、單核細(xì)胞、和T輔助細(xì)胞。適合體外培養(yǎng)的分離的B-細(xì)胞親代細(xì)胞系實例是Namalwa、293和Raji細(xì)胞。適合的單核細(xì)胞親代細(xì)胞系是U937和THP-1細(xì)胞?？捎糜隗w外培養(yǎng)的T細(xì)胞，含T輔助細(xì)胞1和2(TH1，TH2)，包括Jurkat和CEM細(xì)胞。
適合產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物用于治療病毒感染(包括HIV、肝炎病毒如HBV和HCV病毒、和其它人類致病病毒的感染)的人細(xì)胞一般包括B-淋巴細(xì)胞(B-細(xì)胞)和纖維母細(xì)胞系。適合體外培養(yǎng)的分離的B-細(xì)胞親代細(xì)胞系實例在上面給出。適合的纖維母細(xì)胞親代細(xì)胞系是MRC5、HFF和WI-38細(xì)胞。
適合產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物用于治療炎癥(包括哮喘、過敏癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的人細(xì)胞因子產(chǎn)生一般是T-細(xì)胞，包括T-輔助細(xì)胞，如上面舉例的。
一般地，U937細(xì)胞優(yōu)選用于產(chǎn)生FGF和sTNF-R；Jurkat細(xì)胞優(yōu)選用于產(chǎn)生IL-3和TNF-β；纖維母細(xì)胞優(yōu)選用于產(chǎn)生FGF和血管生成抑素；U937細(xì)胞優(yōu)選于產(chǎn)生TNF-α、IFN-α、IL-6及其同源物；表達(dá)CD4的細(xì)胞包括Jurkat和HUT，優(yōu)選用于產(chǎn)生TNF-β；及包括Jurkat和Namalwa的T和B細(xì)胞優(yōu)選用于產(chǎn)生IL-8及其同源物。
因此，本發(fā)明提供了含有這樣的細(xì)胞的細(xì)胞系，與相應(yīng)的親代細(xì)胞系相比，它們已以有效地引起細(xì)胞因子混合物產(chǎn)生增加的方式被選擇、修飾、激發(fā)，和/或激發(fā)和誘導(dǎo)。
選擇的細(xì)胞在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子過度表達(dá)的條件下被培養(yǎng)。用于產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物的細(xì)胞在典型地用于培養(yǎng)親代細(xì)胞系的條件下培養(yǎng)。通常，細(xì)胞在含有生理的鹽分和營養(yǎng)素的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI、MEM、IMEM DMED，或可以添加0.1-10％血清，如胎牛血清的F12。可選擇地，可以使用不含血清和/或不含動物來源的蛋白或不含蛋白的培養(yǎng)基，它們的許多實例在市場上獲得，例如Pro293。培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的，如培養(yǎng)物在固定或滾動培養(yǎng)器中37℃孵育，直至獲得所需要的細(xì)胞因子生產(chǎn)水平。對于大規(guī)模生產(chǎn)，可以使用發(fā)酵罐，細(xì)胞以成批或灌注方式生長。從Namalwa細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞因子的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件實例在實施例3中描述。
一般地，特定細(xì)胞系的培養(yǎng)條件可以在科技文獻(xiàn)中和/或從細(xì)胞系來源處如美國典型培養(yǎng)物保藏中心發(fā)現(xiàn)。對原代細(xì)胞系如纖維母細(xì)胞、B-細(xì)胞、T-細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞的優(yōu)選培養(yǎng)條件也通常可在科技文獻(xiàn)中得到。在細(xì)胞生長已經(jīng)確定后，細(xì)胞接受有效導(dǎo)致或允許一種或更多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的培養(yǎng)條件，被激發(fā)和/或激發(fā)和誘導(dǎo)以增加細(xì)胞因子混合物的產(chǎn)生。
當(dāng)外源提供的編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列在可誘導(dǎo)啟動子的控制下時，適合的誘導(dǎo)劑，如金屬鹽或抗生素，以有效誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)/產(chǎn)生的濃度被加入培養(yǎng)基中。
IV.增加的細(xì)胞因子產(chǎn)生A.增加的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)通過增加人細(xì)胞中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如PKR的表達(dá)/活性，可以增加人細(xì)胞因子混合物的產(chǎn)生。因此，表達(dá)較高的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子構(gòu)成水平，或其中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)可以被誘導(dǎo)到較高的水平的人細(xì)胞培養(yǎng)物用于生產(chǎn)細(xì)胞因子混合物。
一旦獲得了過度表達(dá)或過度產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系，該細(xì)胞系可進(jìn)一步以有效引起細(xì)胞因子增加的方式被激發(fā)和/或誘導(dǎo)。
在一個優(yōu)選的方法中，步驟包括(a)培養(yǎng)能夠過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的人細(xì)胞，(b)在足以過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的條件下，將含細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼序列的異源核酸構(gòu)建物，或其類似物或同源物，導(dǎo)入細(xì)胞中；選擇或篩選已經(jīng)整合了異源核酸的細(xì)胞，并(c)激發(fā)；和(d)處理細(xì)胞以適合于誘導(dǎo)細(xì)胞因子基因的表達(dá)。
在一個優(yōu)選的實施例中，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子是PKR，細(xì)胞被誘導(dǎo)以過度表達(dá)PKR。在優(yōu)選的方面，能夠過度表達(dá)PKR的細(xì)胞以導(dǎo)致較高水平PKR表達(dá)或產(chǎn)生的方式被激發(fā)和/或被誘導(dǎo)。
本發(fā)明提供的細(xì)胞系選擇、修飾、培養(yǎng)條件、激發(fā)或激發(fā)和誘導(dǎo)的結(jié)合導(dǎo)致特定細(xì)胞系的細(xì)胞因子產(chǎn)生顯著增加，如相對于在相同培養(yǎng)條件下，沒有選擇、修飾、激發(fā)和誘導(dǎo)的同一細(xì)胞系所具有的細(xì)胞因子生成和表達(dá)水平，此細(xì)胞因子生成或表達(dá)的增加相當(dāng)于增加至少200％(2倍或2×)、250％(2.5倍或2.5×)、300％(3倍或3×)、400％(4倍或4×)、500％(5倍或5×)，優(yōu)選地1000％(10倍或10×)，或更多，如這里描述的。在某些情況下，本發(fā)明方法引起的細(xì)胞因子產(chǎn)生增加為100倍(100×)至1000倍(1000×)或更多。
因此，本發(fā)明的一個方面與分離的細(xì)胞群有關(guān)，即表達(dá)或產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物的細(xì)胞系。在此所用，術(shù)語“群”指兩個或更多細(xì)胞的組，它們已衍生自一個單一的親代細(xì)胞。
典型地與細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)的問題在本發(fā)明方法中被消除，如非重組哺乳動物系統(tǒng)的低產(chǎn)量、不適當(dāng)?shù)奶腔?、缺少合適的翻譯后修飾或微生物系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的錯誤折疊。
B.凋亡的抑制凋亡或程序化細(xì)胞死亡是細(xì)胞內(nèi)在的自殺過程，其中不需要的單個細(xì)胞經(jīng)歷遺傳學(xué)決定的程序，以染色體DNA碎裂、RNA降解和最終的細(xì)胞死亡為終點(綜述于Orrenius 1995；Stellar 1995；Vaux 1993)。一旦進(jìn)入凋亡，細(xì)胞經(jīng)歷新的蛋白合成周期和各種形態(tài)學(xué)/生理學(xué)改變，包括胞漿濃縮、核染色質(zhì)濃縮、膜空泡、以及最終DNA降解，檢測為特征性的微核體階梯。
TNFs作為原型前炎癥細(xì)胞因子，是由活化的免疫細(xì)胞在病原清除、抗病毒活動和腫瘤破壞過程中產(chǎn)生的細(xì)胞毒蛋白。但是，體內(nèi)高水平的TNF-α可以是有害的，因為TNF-α引起代謝紊亂、消耗和血細(xì)胞生成抑制。在細(xì)胞水平，TNF-α導(dǎo)致超氧化物基團(tuán)的產(chǎn)生、溶酶體酶類激活(Larrick，等人，1990；Liddil，等人，1989)，并通過激活核酸內(nèi)切酶活性碎裂DNA(Rubin，等人，1988)，導(dǎo)致凋亡。
已知PKR在TNF-α信號傳導(dǎo)通路及誘導(dǎo)凋亡中起作用。已經(jīng)顯示，過度表達(dá)PKR的U937細(xì)胞也存在凋亡增加(見，如，Yeung MC，等人，1996和Yeung MC，等人，1999.)。
與凋亡相關(guān)聯(lián)的個別原癌基因可能在進(jìn)行凋亡的細(xì)胞中表達(dá)，且已經(jīng)觀察到，調(diào)節(jié)個別原癌基因的表達(dá)影響此過程。原癌基因的實例包括c-myc、Fas(APO-1)、p53和Bcl-2以及其它基因如ced-3、ced-4、ced-9和lce(Stellar，1995；Cohen，1993)。
通過抑制凋亡，這里描述的細(xì)胞系在培養(yǎng)中具有較長的生存期，并顯示細(xì)胞因子生物合成的增加和/或產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞功能時間延長。
因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，能夠抑制凋亡的選擇的基因蛋白，如CrmA、Bcl-2a、Bcl-XL或其同源物，在宿主細(xì)胞中被過度表達(dá)，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞的死亡抑制或延遲。
在其它情況下，“修飾形式的”凋亡相關(guān)蛋白在細(xì)胞中被表達(dá)。編碼凋亡相關(guān)蛋白的基因的表達(dá)抑制可引起凋亡細(xì)胞死亡的抑制或延遲，并可以受下列方法的影響，包括但不限于，內(nèi)源基因的突變、同源物重組或位點定向的誘變、基因缺失或基因切除或有效引起凋亡相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)消除或改變的任何方法。
與凋亡相關(guān)的蛋白包括但不限于，eIF-2a或eIF-2α、eIF-3、FADD、Bcl-Xs、BAK、BAX，等?！靶揎椥问降摹钡鞍资侵柑烊坏鞍椎难苌蜃儺愋问剑ǔ＞哂泻辽僖粋€氨基酸取代、缺失或插入的衍生多肽序列，特別優(yōu)選的是氨基酸取代。氨基酸取代、插入或缺失可發(fā)生在多肽序列中的任何殘基上，它干擾蛋白的生物學(xué)活性。編碼變異或衍生蛋白的相應(yīng)核酸序列被認(rèn)為是“突變的”或“修飾形式的”基因或其編碼序列，并包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
作為舉例，人細(xì)胞培養(yǎng)中凋亡細(xì)胞死亡過程的抑制可以按如下獲得(1)能夠抑制凋亡的蛋白過度表達(dá)，其實例包括但不限于CrmA、Bcl-2a和Bcl-XL或其同源物；(2)eIF2-α磷酸化的抑制(GenBank登記號A457497)，例如通過突變形式的eIF2-α或真核細(xì)胞翻譯啟動因子(eIF-3)的過度表達(dá)，它們采用同源物重組或位點定向誘變(從而抑制PKR的下游底物)的各自內(nèi)源性基因的突變而制備；(3)內(nèi)源性FADD活性的抑制，例如通過突變形式FADD的過度表達(dá)，它通過內(nèi)源性FADD基因采用同源物重組或位點定向誘變的突變而制備；或(4)應(yīng)用跨顯性突變，通過Bcl-2a的一個或多個原凋亡配體的內(nèi)源性基因的突變，例如BAX(GenBank登記號L22473)、BAK(GenBank登記號BE221666)和/或Bcl-Xs(GenBank登記號L20122)，通過同源物重組或位點定向誘變，或通過一個或多個BAX、BAK和Bcl-Xs的基因腐蝕或基因缺失。
細(xì)胞死亡可以通過用碘化丙啶(PI)染色細(xì)胞來檢測，或通過使用對凋亡細(xì)胞死亡特異的實驗，例如通過用annexin V染色(Vermes，等人，1995)。細(xì)胞活力實驗與顯微鏡觀察的相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)聯(lián)合，通過對其結(jié)果的評價，可以區(qū)別壞死性細(xì)胞死亡和凋亡細(xì)胞死亡。
在一個方法中，提供了細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的細(xì)胞系，并用含抗凋亡基因的載體轉(zhuǎn)染，使抗凋亡功能的細(xì)胞選擇和轉(zhuǎn)染得以采用在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)方面已經(jīng)“穩(wěn)定”的細(xì)胞來進(jìn)行。在此情況下，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的細(xì)胞系可以通過亞克隆和選擇，或通過導(dǎo)入和表達(dá)編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列而制備。
在一個可選擇的方法中，細(xì)胞首先用含抗凋亡基因的載體轉(zhuǎn)染，然后成功的轉(zhuǎn)化體可用含細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼核酸序列的載體進(jìn)一步轉(zhuǎn)染。這使得可以用已經(jīng)“穩(wěn)定的”具有抗凋亡功能的細(xì)胞進(jìn)行二次轉(zhuǎn)染和選擇?？蛇x擇地，已經(jīng)“穩(wěn)定的”具有抗凋亡功能的細(xì)胞可以被亞克隆和選擇細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)。
在細(xì)胞培養(yǎng)中，通過抑制與細(xì)胞因子合成相關(guān)的凋亡，特別是在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的條件下，增加細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法進(jìn)一步在共有的美國申請序列號09/772,109中描述，在此特別合并為參考文獻(xiàn)。
V.增加內(nèi)源性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，能夠表達(dá)一種或更多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子混合物的細(xì)胞系可接受有限稀釋克隆(這里提作“亞克隆”)，篩選增強的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性和/或mRNA和/或蛋白表達(dá)，進(jìn)一步亞克隆和選擇增強的細(xì)胞因子活性和/或表達(dá)，如下面進(jìn)一步描述的?？梢杂米骷?xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的標(biāo)記物的細(xì)胞因子實例包括但不限于，TNF-α和β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF和IFNs。
在實施本方法中，能夠表達(dá)一種或更多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和一種或更多種細(xì)胞因子的細(xì)胞系(在此指定為“親代細(xì)胞系)，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)方法被鑒定并進(jìn)行單個細(xì)胞的有限稀釋克隆。通常，亞克隆步驟至少進(jìn)行1次，典型地在96孔板上接連3至5次。采用典型地用于培養(yǎng)親代細(xì)胞系的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)亞克隆以獲得大約0.3至0.5百萬細(xì)胞/ml的群體。然后檢測亞克隆的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子表達(dá)。
細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)和/或產(chǎn)生的檢測實例包括，生物學(xué)活性的功能試驗、蛋白檢測如Western印跡、及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子mRNA檢測如RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng))和Northern印跡、點印跡、或原位雜交，采用根據(jù)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼核酸序列的合適的標(biāo)記探針。
選擇細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)生水平超過親代細(xì)胞系至少2倍(2×)，優(yōu)選地3倍(3×)、4倍(4×)、5倍(5×)或更多倍的亞克隆。在某些情況下，這種選擇的亞克隆具有的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)生水平是親代細(xì)胞系的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)生水平的10倍(10×)或更多。
典型地，選擇的亞克隆在用有效引起細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子產(chǎn)生增加的方式處理之前，通過與激發(fā)劑接觸而被激發(fā)。激發(fā)劑的實例在下面進(jìn)一步描述。然后，選擇的亞克隆被以有效引起細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)增加和細(xì)胞因子混合物產(chǎn)生增加的方式誘導(dǎo)。
VI.通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源核酸構(gòu)建物增加細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子本發(fā)明還提供了已經(jīng)用含編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子核酸序列的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等，是在轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染前預(yù)先用于親代宿主細(xì)胞的，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。
在一個方法中，人細(xì)胞系用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，后者具有啟動子或有生物學(xué)活性的啟動子片段，或一個或更多(如一系列)在宿主細(xì)胞系中起作用的增強子，與編碼一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的DNA片段可有效地連接，使得一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子在細(xì)胞系中過度表達(dá)。
在一個方法中，親代細(xì)胞在結(jié)構(gòu)性或可誘導(dǎo)啟動子的控制下，用含細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，使得在合適生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子核酸序列的過度表達(dá)。細(xì)胞也可以用第二個載體轉(zhuǎn)染，該載體在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生的條件下，在細(xì)胞中表達(dá)抑制凋亡的蛋白。
實施例描述了舉例的載體和轉(zhuǎn)染方法，以獲得適用于本發(fā)明中的生產(chǎn)人細(xì)胞因子細(xì)胞。用含細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和抗凋亡基因的載體繼續(xù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在二次轉(zhuǎn)染之前選擇成功的轉(zhuǎn)化體。這使得可以用已經(jīng)“穩(wěn)定的”表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子或抗凋亡基因的細(xì)胞進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染和選擇。載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染條件是常規(guī)的，為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。特別是，在這種載體構(gòu)建物中，獲得能夠被導(dǎo)入并在選擇的人細(xì)胞中復(fù)制的適合質(zhì)?；蚱渌d體是熟知的，如從商業(yè)途徑，其中質(zhì)粒也可以配備可選擇的標(biāo)記物、插入位點和適合的調(diào)控元件如終止序列。細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子、PKR基因和抗凋亡基因Bcl-XL編碼序列的實例在實施例1中注明，并可以如所引用的從GenBank中獲得。
用于人細(xì)胞的合適克隆和表達(dá)載體被描述于，Sambrook等人.(1989)分子克隆實驗室指南(第二版)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Planview，N.Y.和Ausubel FM等人.(1989)分子生物學(xué)現(xiàn)代工具，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，在此特別合并為參考文獻(xiàn)。啟動子的例子包括結(jié)構(gòu)性啟動子和可誘導(dǎo)啟動子，其實例包括CMV啟動子、SV40早期啟動子、RSV啟動子、EF-1α啟動子、含反應(yīng)元件(TRE)的啟動子和金屬硫蛋白啟動子。
A.載體編碼一種或更多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的天然或合成多核苷酸片段(“編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列”)或抗凋亡基因，可被合并進(jìn)能夠在人細(xì)胞中導(dǎo)入并復(fù)制的異源核酸構(gòu)建物或載體中。這里公開的載體和方法適合用在表達(dá)一種或更多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子或抗凋亡基因的宿主細(xì)胞中。只要在其導(dǎo)入的人細(xì)胞中復(fù)制并可能存活，任何載體均可使用。大量適合的載體和啟動子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并可從商業(yè)上獲得。
載體是遞送DNA到靶細(xì)胞的工具。本領(lǐng)域已知的遞送核酸構(gòu)建物進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞的方法包括，采用腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體或腺相關(guān)病毒載體的病毒方法。通常，病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體和腺病毒載體的基因轉(zhuǎn)移效率高于非病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體，包括最廣泛使用的兼性營養(yǎng)鼠白血病病毒(MuLV)載體，只能感染復(fù)制中的細(xì)胞，其轉(zhuǎn)導(dǎo)速率通常低于腺病毒載體。然而，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合進(jìn)宿主基因組，所以轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是持久的。最近，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體已被發(fā)展，其中攜帶治療基因的載體構(gòu)建物被導(dǎo)入攜帶兩個獨立構(gòu)建物的包裝細(xì)胞系中，該細(xì)胞系表達(dá)包裝結(jié)構(gòu)蛋白，從而解決了圍繞有復(fù)制能力的感受態(tài)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒傳代的安全問題(Salmons和Gunzburg，1997)。
腺病毒載體可以高效感染許多靜息的或復(fù)制中的細(xì)胞類型。最近，雜交的腺/逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體已經(jīng)得到描述(見，如Bilbao，等人，1997)。腺相關(guān)病毒載體也加速轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)宿主染色體及轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)表達(dá)，而沒有引起強烈的宿主免疫反應(yīng)。
人工染色體如酵母人工染色體(YAC)載體，也可用來引導(dǎo)異源核酸構(gòu)建物進(jìn)入細(xì)胞。
用于人細(xì)胞的合適克隆和表達(dá)載體也被描述于Sambrook等人，1989，和Ausubel FM等人，1989中，在此特別合并為參考文獻(xiàn)。DNA編碼序列可以通過各種方法插入質(zhì)?；蜉d體(這里總起來提作“載體”)。一般地，DNA序列通過標(biāo)準(zhǔn)的方法被插入合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點。這種方法和相關(guān)的亞克隆方法被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
這種載體典型地配備有可選擇的標(biāo)記物、插入位點、和適合的調(diào)控元件，如終止序列。載體可含有對編碼序列在宿主細(xì)胞中(和/或在載體或宿主細(xì)胞環(huán)境中，通常編碼修飾的可溶性蛋白抗原的序列不在其中表達(dá))的表達(dá)有作用的調(diào)節(jié)序列，包括例如，非編碼序列如內(nèi)含子和調(diào)控元件，即啟動子和終止子元件或5’和/或3’非翻譯區(qū)，可有效地連接到編碼序列上。大量適合的載體和啟動子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，且許多可從商業(yè)上獲得。
啟動子實例包括結(jié)構(gòu)性啟動子和可誘導(dǎo)的啟動子，其實例包括CMV啟動子、SV40早期啟動子、RSV啟動子、EF-1α啟動子、如所描述的(ClonTech和BASF)在tet-開或tet-關(guān)系統(tǒng)中含tet反應(yīng)元件(TRE)的啟動子、β肌動蛋白啟動子和可以通過添加某些金屬鹽而上調(diào)的金屬硫蛋白啟動子。大量適合的載體和啟動子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并可從商業(yè)上獲得，且被Sambrook，等人，(見上)描述。聯(lián)合超過一個啟動子元件的雜交啟動子也在本發(fā)明方法中應(yīng)用。雜交啟動子的構(gòu)建方法為本領(lǐng)域所熟知。
用于這種表達(dá)載體中的可選擇標(biāo)記物一般為本領(lǐng)域所知，對適當(dāng)?shù)目蛇x擇標(biāo)記物的選擇依賴于宿主細(xì)胞。典型的可選擇標(biāo)記物基因編碼使之對抗生素或其它毒素具有抗性的蛋白，例如氨芐青霉素、甲氨喋呤、四環(huán)素、新霉素(Southern和Berg，J.，1982)、霉酚酸(Mulligan和Berg，1980)、嘌呤霉素、zeomycin或潮霉素(Sugden等人，1985)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，采用含有外源性分別編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和/或抗凋亡蛋白的核酸序列的細(xì)胞，在適合的結(jié)構(gòu)性或可誘導(dǎo)啟動子的控制下，在適于細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)的情況下，獲得細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過度表達(dá)和/或抗凋亡基因的表達(dá)。
B.核酸編碼序列含細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼核酸序列的載體可被導(dǎo)入細(xì)胞中，引起細(xì)胞過度表達(dá)一種或更多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子。
用于這種載體中的編碼核酸實例包括但不限于，來自人p68 PKR基因、鼠PKR基因和其它包括eIF-2-α激酶的酵母GCN2和氯高鐵血紅素調(diào)節(jié)的抑制劑(Wek RC，Trends Biochem Sci 1994；19491-496)的編碼序列，人p68 PKR基因在GenBank登記號M35663上找到。用于實施本發(fā)明的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子包括但不限于，ISG(2-5A合成酶GenBank登記號NM_006187，ISGγ3 GenBank登記號NM_002038，MxA GenBank登記號30817，MxB GenBank登記號30818)，IRF-1 GenBank登記號NM_002198，IRF-3 GenBank登記號NM_001571，IRF-7A GenBank登記號U53830，IRF-7B GenBank登記號U53831，IRF-7C GenBank登記號U53832，細(xì)胞因子受體，NF-κB GenBank登記號NM_003998，AP-1GenBank登記號J04111，NF-IL6 GenBank登記號X52560，PKC誘導(dǎo)劑，p38 MAPK GenBank登記號AF015256，Jak3 GenBank登記號NM_000215，STAT GenBank登記號NM_007315，IFN-γ GenBank登記號J00219，IFN-β GenBank登記號V00534，IFN-α GenBank登記號J00207，TNF-αGenBank登記號X02910，TNF-β GenBank登記號M16441，GM-CSF GenBank登記號NM_00758，G-CSF GenBank登記號X03655，EGF GenBank登記號NM_001963，PDGFα GenBank登記號NM_002607，PDGFβ GenBank登記號NM_002609，TGF-β GenBank登記號M60316，IL-1，趨化因子(IL8GenBank登記號M28130，MIP-1a GenBank登記號，NM_002983 MIP-1bGenBank登記號J04130)，單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP1 GenBank登記號NM_002982)，PMA，鈣離子載體，丁酸鈉或內(nèi)毒素，polyIC，dsRNA，病毒類似物，激活PKR的細(xì)胞應(yīng)激信號，(熱休克，致病原感染)，與控制PKR表達(dá)的啟動子相互作用的因子，轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄信號(STAT)和任何影響細(xì)胞因子產(chǎn)生增加的因子。
此外，編碼突變或變異形式的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列可以包括在載體構(gòu)建物中，用于細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過度表達(dá)。用于本發(fā)明實施中的多核苷酸包括剪接變異體、與自身核酸編碼序列互補的序列及其新的片段。多核苷酸的形式可以是RNA或DNA，并包括信使RNA、合成的RNA和DNA、cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈的或單鏈的，如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼(反義，互補)鏈。在表達(dá)時，這些細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的突變或變異形式可具有升高或降低的活性。
在一個方法中，用轉(zhuǎn)化子位點定向誘變試劑盒(ClonTech)產(chǎn)生突變的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼序列。Cai和Williams(J Biol Chem1998；27311274-11280)描述了一系列PKR突變體，它們具有底物結(jié)合(就eIF-α而言)與激酶活性(底物磷酸化)分離。雖然在底物結(jié)合上有效性較少或激酶活性較低，但這些PKR活性下降的突變體可被用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生表PKR的細(xì)胞。
根據(jù)熟知的重組技術(shù)，選擇的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼序列可被插入合適的載體，并用于轉(zhuǎn)化能夠過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系。
按照本發(fā)明，編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和抗凋亡蛋白的多核苷酸序列或基因包括，剪接變異體、全長基因的片段、融合蛋白的編碼序列、天然或全長基因或其功能等價物的修飾形式，這里總起來分別稱作“編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列”和“編碼抗凋亡蛋白的核酸序列”。
由于遺傳密碼固有的簡并性，編碼實質(zhì)上一致或功能上相等的氨基酸序列的其它核酸序列可被用于克隆和表達(dá)編碼CRF-或抗凋亡蛋白的核酸序列。因此，對于特定的編碼CRF-或抗凋亡蛋白的核酸序列，可理解的是，作為遺傳密碼簡并性的結(jié)果，可以產(chǎn)生編碼同樣氨基酸序列的數(shù)種編碼序列。例如，三聯(lián)體CGT編碼精氨酸。精氨酸可選擇地由CGA、CGC、CGG、AGA和AGG編碼。因此，應(yīng)當(dāng)理解，編碼區(qū)內(nèi)的這種取代屬于本發(fā)明涵蓋的序列變異體中。這些序列變異的任一或全部，可以按這里描述的、天然形式CRF-或抗凋亡蛋白編碼核酸序列同樣的方式被使用。
編碼“變異體”CRF-或抗凋亡蛋白的核酸序列可編碼“變異體”CRF-或抗凋亡氨基酸序列，它們的改變來自于天然多肽序列的一個或多個氨基酸，兩者都包含在發(fā)明的范圍之內(nèi)。類似地，涉及CRF-或抗凋亡蛋白時，術(shù)語“修飾形式的”是指衍生或變異形式的天然CRF-或抗凋亡蛋白編碼核酸序列或天然CRF-或抗凋亡氨基酸序列。典型地，“修飾形式”的天然CRF-或抗凋亡蛋白或蛋白的編碼序列分別具有含至少一個氨基酸或核酸取代、缺失或插入的衍生序列。
在實施本發(fā)明過程中使用的多核苷酸包括編碼天然CRF-或抗凋亡蛋白和其剪接變異體的序列，與編碼序列和CRF-或抗凋亡蛋白編碼多核苷酸的新片段互補的序列。多核苷酸可能是RNA或DNA形式，包括信使RNA、合成的RNA和DNA、cDNA和基因組DNA。DNA可能是雙鏈的或單鏈的，如果是單鏈則可能是編碼鏈或非編碼(反義、互補)鏈。
如本領(lǐng)域中那些專業(yè)技術(shù)人員所理解的，在某些情況下產(chǎn)生具有非天然存在密碼子的核苷酸序列是有益的?？梢赃x擇特定真核細(xì)胞宿主所優(yōu)選的密碼子(Murray，E.等人，1989)，例如，用來增加CRF-或抗凋亡蛋白表達(dá)的速率或產(chǎn)生具有期望特性的重組RNA轉(zhuǎn)錄物，這些特性如較采用天然存在序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物具有更長的半衰期。
天然CRF-或抗凋亡蛋白編碼核酸序列可被進(jìn)行基因工程以便為了多種原因而改變編碼序列，包括但不限于，對細(xì)胞的克隆、處理和/或表達(dá)進(jìn)行修飾的改變。
在一種方法中，用于實施本發(fā)明的異源核酸構(gòu)建物或表達(dá)載體包括編碼蛋白的序列，該蛋白的活性形式是需要的，如編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子(CRF)的序列，在此以PKR為例，或編碼抗凋亡蛋白的序列，在此以CrmA、Bcl-2或Bcl-XL為例。
在本發(fā)明的一個常規(guī)實施方案中，CRF編碼核酸序列與天然編碼序列之間至少有70％，優(yōu)選地80％、85％、90％或95％或更多的序列同源性。例如，用來表達(dá)人PKR的編碼序列與發(fā)現(xiàn)于GenBank登記號M35663的序列至少有70％，優(yōu)選地80％、85％、90％或95％或更多的序列同源性。
對于細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼核酸序列，取代、插入或缺失可發(fā)生在序列中的任何殘基上，只要編碼的氨基酸序列仍然保持天然細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的生物學(xué)活性。
在另一個常規(guī)實施方案中，本發(fā)明提供了CrmA、Bcl-2a、Bcl-XL或其類似物的核酸編碼序列，該類似物與GenBank中發(fā)現(xiàn)的天然編碼序列至少有70％，優(yōu)選地80％、85％、90％或95％或更多的序列同源性。例如，用于表達(dá)人p68 PKR基因的編碼序列與發(fā)現(xiàn)于GenBank登記號M35663的序列至少有70％，優(yōu)選地80％、85％、90％或95％或更多的序列同源性。
當(dāng)將CrmA、Bcl-2a、Bcl-XL或其類似物的核酸編碼序列的變異體形式引入人細(xì)胞內(nèi)時，取代、插入或缺失可能發(fā)生在序列中的任何殘基上，只要編碼的氨基酸序列仍然保持天然抗凋亡蛋白的生物學(xué)活性。
在一個相關(guān)的實施方案中，可以通過引入一個與凋亡相關(guān)的蛋白如eIF-2a或eIF-2α、eIF-3、FADD、Bcl-Xs、BAK、BAX等的修飾編碼序列而抑制凋亡。在這個實施方案中，修飾的eIF-2a或eIF-2α、eIF-3、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAX編碼序列編碼天然蛋白的衍生體或變異體形式，它們一般含有至少包含一個氨基酸取代、缺失或插入的衍生多肽序列，這些修飾作用可在多肽序列中的任何殘基上插入，這樣干擾了蛋白的生物學(xué)活性。
可用來在兩個序列間確定同源性，從而分析變異體編碼序列的計算機(jī)程序?qū)嵗ǖ幌抻?，一套BLAST程序，如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，可在互聯(lián)網(wǎng)的NIH站點上公開獲得。也見，Altschul，S.F.等人，1990和Altschul，S.F.等人，1997。當(dāng)將核酸序列與GenBank DNA序列和其他公共數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進(jìn)行比較時，序列研究典型地采用BLASTN程序來進(jìn)行。BLASTX程序優(yōu)選用來搜索核酸序列，該序列已經(jīng)被翻譯成與GenBank蛋白序列和其他公共數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列相對的所有閱讀框架。BLASTN和BLASTX都可采用默認(rèn)的參數(shù)運行，開放缺口損失(open gap penalty)為11.0，延伸缺口損失(extended gap penalty)為1.0，并使用BLOSUM-62矩陣(見Altschul等人，1997)。
在變異體編碼序列的分析中，兩個或多個序列之間的同源性程度一般采用序列分析程序來執(zhí)行，如CLUSTAL-W程序(Thompson，J.D.等人，Nucleic Acids Research，224673-4680.1994)MacVector 6.5版，以默認(rèn)的參數(shù)運行，包括開放缺口損失為10.0，延伸缺口損失為0.1，以及BLOSUM 30相似性矩陣。這些序列分析程序中的每一個都可在互聯(lián)網(wǎng)的許多站點上獲得。
兩個序列之間的關(guān)系也可通過雜交來定性。如果兩個序列在中度至高度嚴(yán)格的雜交和洗脫條件下可特異地與另一個雜交，該核酸序列就被認(rèn)為是與參考核酸序列“選擇性可雜交的”。雜交條件是根據(jù)核酸結(jié)合復(fù)合體或探針的解鏈溫度(Tm)而定的?！白罡邍?yán)格性”一般發(fā)生在大約Tm-5℃(探針的Tm之下5)；“高度嚴(yán)格性”為大約Tm之下5-10；“中度嚴(yán)格性”為大約探針的Tm之下10-20；和“低嚴(yán)格性”為Tm之下大約20-25。從作用上說，最嚴(yán)格條件可用來鑒定具有嚴(yán)格同源性或近似嚴(yán)格同源性的序列；而高度嚴(yán)格條件可用來鑒定具有大約80％或更高序列同源性的序列。
中度和高度嚴(yán)格的雜交條件在本領(lǐng)域中是為人熟知的(見，如Sambrook，等人，1989，第9章和11章，和Ausubel，F(xiàn).M.等人，1993，在此特別地合并作為參考文獻(xiàn))。高度嚴(yán)格條件的實例包括在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和100g/ml變性載體DNA中大約42℃下的雜交，然后在2×SSC和0.5％SDS中室溫下沖洗2次，在0.1×SSC和0.5％SDS中42℃另外沖洗兩次。
細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸編碼序列可因為許多原因而被改變，包括但不限于，對細(xì)胞的克隆、處理和/或細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)進(jìn)行修飾的改變。
異源核酸構(gòu)建物可包含一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子單獨的編碼序列或結(jié)合一種或多種抗凋亡蛋白的編碼序列、其變異體、片段或剪接變異體(i)以分離的形式；(ii)結(jié)合其他的編碼序列；如編碼融合蛋白或信號肽的序列；(iii)結(jié)合非編碼序列，如內(nèi)含子和調(diào)控元件，如啟動子和終止元件或5’和/或3’非翻譯區(qū)，其對編碼序列在合適宿主中的表達(dá)有效；和/或(iv)在編碼序列是異源基因的載體或宿主環(huán)境中。
本發(fā)明也可以單獨使用包含編碼一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列或結(jié)合一種或多種抗凋亡蛋白編碼序列的重組核酸構(gòu)建物，如上所述。構(gòu)建物一般采用載體的形式，如質(zhì)粒或病毒載體，其中以正向或反向的方向已經(jīng)插入了編碼序列。
C.宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化包含核酸編碼序列的載體，如上所述，與合適的啟動子和調(diào)控序列一起，被用來轉(zhuǎn)化人類細(xì)胞，以使細(xì)胞單獨過度表達(dá)一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子，或結(jié)合一種或多種抗凋亡蛋白的編碼序列，因此增加細(xì)胞因子混合物的產(chǎn)生。
在本發(fā)明的一個方面中，采用已經(jīng)建立的優(yōu)選細(xì)胞系，異源核酸構(gòu)建物被用來在體外將核酸編碼序列轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞中。為了長期、高產(chǎn)量的生產(chǎn)細(xì)胞因子混合物，也優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。因此可以斷定，在執(zhí)行本發(fā)明的過程中可以使用任何能有效產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的方法。
除非另有指示，本發(fā)明的實踐可使用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已經(jīng)有詳盡的解釋。見例如，“分子克隆實驗室指南”，第二版，(Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，1989)，“動物細(xì)胞培養(yǎng)”(R.I.Freshney，主編，1987)；“現(xiàn)代分子生物學(xué)方法”(F.M.Ausubel等人，主編，1987)；和“現(xiàn)代免疫學(xué)方法”(J.E.Coligan等人，主編，1991)，在此特別地合并作為參考文獻(xiàn)。
親代細(xì)胞或細(xì)胞系可用克隆載體或表達(dá)載體進(jìn)行基因修飾(即，轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)。載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。
將核酸引入細(xì)胞以表達(dá)異源核酸序列的大量方法對普通的專業(yè)技術(shù)人員也是已知的，包括但不限于，電穿孔；細(xì)胞一細(xì)胞融合；核微注射或直接微注射進(jìn)單個細(xì)胞中；細(xì)菌原生質(zhì)體與昆蟲細(xì)胞融合；使用多聚陽離子，如聚凝胺或聚鳥氨酸；與脂質(zhì)體進(jìn)行膜融合，Lipofectamine或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；用DNA包被的微發(fā)射體的高速轟擊；與磷酸鈣-DNA沉淀物孵育；DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；用修飾的病毒核酸感染；等。(見，如Davis，L.，Dibner，M.，和Battey，I.分子生物學(xué)基本方法，1986。)基因修飾的細(xì)胞在常規(guī)的營養(yǎng)基中培養(yǎng)，該營養(yǎng)基進(jìn)行了調(diào)整以適合激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化物或擴(kuò)增一條或多條被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的核酸編碼序列的表達(dá)。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等，是以前對選擇的宿主細(xì)胞表達(dá)所使用的，為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所理解。已經(jīng)導(dǎo)入一條或多條核酸編碼序列的細(xì)胞的后代一般被認(rèn)為含有導(dǎo)入的序列。
D.增強細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子的表達(dá)通常來說，一旦產(chǎn)生了單獨過度表達(dá)一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子或結(jié)合一種或多種抗凋亡蛋白的細(xì)胞系，就要采取其他的步驟來增加細(xì)胞因子混合物的產(chǎn)量，和/或促進(jìn)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收細(xì)胞因子。這樣的步驟包括以下一個或多個(1)在有效增強一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；(2)在有效促進(jìn)細(xì)胞因子回收的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；(3)激發(fā)細(xì)胞；和(4)處理細(xì)胞以誘導(dǎo)一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和一種或多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生(誘導(dǎo))。
在有效增強一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在含有促進(jìn)表達(dá)的因子，如金屬鹽或抗生素，的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，這些因子以有效激活誘導(dǎo)型啟動子的濃度加入到培養(yǎng)基中。
在有效促進(jìn)細(xì)胞因子回收的條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在無血清和/或無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
激發(fā)是一種熟知的現(xiàn)象，將細(xì)胞與激發(fā)劑接觸導(dǎo)致一種或多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，一般在誘導(dǎo)之后。激發(fā)劑的實例包括但不限于，醋酸佛波豆蔻酯(PMA)和其他佛波醇酯、鈣離子載體、干擾素-α、干擾素-γ、干擾素-β、G-CSF、GM-CSF、PDGF、TGF、EGF或趨化因子(Il-8、MCP或MIP)、丁酸鈉、內(nèi)毒素、PHA、LPS及其衍生物如3-脫酰LPS、病毒如新城疫病毒、激酶激活物(如PKR、PACT的蛋白激活物)、或轉(zhuǎn)錄激活物(NF-KB、IRFs包括IRF-3和IRF-7)。對PKR抑制劑p53的抑制，也已被證明導(dǎo)致PKR活性增強(Tan SL，Gale MJ Jr，Katze MG，MolCell Biol 18(5)2431-43，1998)?？梢赃x擇的是，去除血清和生長因子如IL-3可用來在細(xì)胞中誘導(dǎo)PKR活性。在科技文獻(xiàn)中可查到適合的激發(fā)劑濃度。
例如，5-50nM范圍內(nèi)的PMA濃度，一般大約10nM是適合的。應(yīng)該理解的是，最佳的激發(fā)劑濃度和激發(fā)劑、誘導(dǎo)劑的組合，以及為產(chǎn)生特異的細(xì)胞因子混合物在特定類型細(xì)胞中這種激發(fā)和誘導(dǎo)作用的條件是不同的。但是，這些條件可以由本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員確定，而不須進(jìn)行大量的試驗。
誘導(dǎo)或處理是指添加微生物(病毒、細(xì)菌或真菌)誘導(dǎo)劑或非微生物誘導(dǎo)劑至細(xì)胞培養(yǎng)物中，前者是能夠作為誘導(dǎo)劑的微生物提取物(如，內(nèi)毒素或含細(xì)菌細(xì)胞壁的提取物)。非微生物誘導(dǎo)劑的實例包括但不限于，雙鏈RNA(dsRNA)如poly(I)poly(C)或poly r(I)poly r(C)(polyIC)、或病毒dsRNA如仙臺病毒RNA、小分子如聚陰離子、硫酸肝素葡聚糖、硫酸軟骨素和細(xì)胞因子。
病毒誘導(dǎo)方法的實例包括但不限于，(1)與活病毒(如仙臺病毒、腦心肌炎病毒或單純皰疹病毒)接觸；(2)與上面提到的滅活病毒接觸；或(3)與分離的雙鏈病毒RNA接觸。另外，通過添加已知刺激某種細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的特定細(xì)胞因子可產(chǎn)生或增強細(xì)胞因子誘導(dǎo)。在添加誘導(dǎo)劑后，細(xì)胞一般繼續(xù)孵育，直至獲得所需的細(xì)胞因子誘導(dǎo)和分泌水平。在37℃孵育至少12-48小時，直至72-96小時一般是足夠的。
有效量的誘導(dǎo)劑加入一段時間可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如在培養(yǎng)基中能夠有效獲得細(xì)胞因子混合物的產(chǎn)生，如大約0.001-100μg/ml。
在本方法的一個應(yīng)用實例中，細(xì)胞用IFN-β激發(fā)大約24小時，然后置于含poly IC和放線菌酮的培養(yǎng)基中大約5小時，在最后一個小時中加入放線菌素D。
在本方法的另一個應(yīng)用實例中，細(xì)胞用IFN-β激發(fā)大約24小時，然后用病毒誘導(dǎo)劑如仙臺病毒(SV)處理大約1小時進(jìn)行誘導(dǎo)，接著置于含poly IC和放線菌酮的培養(yǎng)基中大約5小時，在最后一個小時中加入放線菌素D。
實例1描述了表達(dá)CrmA細(xì)胞系的產(chǎn)生和細(xì)胞的超誘導(dǎo)或病毒誘導(dǎo)。
實例2描述了載體的實例、轉(zhuǎn)染的方法和過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系的產(chǎn)生，該細(xì)胞系還表達(dá)抗凋亡蛋白、Bcl-XL，適合用于本發(fā)明的實施。實例3通過過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子，以及還表達(dá)抗凋亡蛋白的過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系的實例，描述了細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
在一個優(yōu)選的方法中，用DEAE葡聚糖進(jìn)一步處理細(xì)胞影響了細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過度表達(dá)和一種或多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在另一種方法中，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)可被另一個調(diào)節(jié)因子增強，后者可與控制細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼核酸序列表達(dá)的啟動子相互作用。內(nèi)源性PKR編碼核酸序列的表達(dá)可被調(diào)節(jié)因子調(diào)控，包括干擾素誘導(dǎo)型GAS元件、IL-6敏感的NF-IL-6和APRF元件和NF-κB元件(見，如JagusR等人，1999和Williams BR，1999)。
典型地，在培養(yǎng)、激發(fā)和處理(即誘導(dǎo))后的不同時間點，檢測培養(yǎng)基中一種或多種所選擇的細(xì)胞因子的存在。根據(jù)為人熟知的生物學(xué)測定方法，檢測所選擇的細(xì)胞因子的存在可通過直接測定，如采用抗體結(jié)合試驗，或通過培養(yǎng)基對多種細(xì)胞因子反應(yīng)細(xì)胞活性的效應(yīng)間接測定。
在一個舉例的方法中，培養(yǎng)步驟在含有血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行，誘導(dǎo)步驟在基本上為無血清和/或無蛋白的培養(yǎng)基中進(jìn)行。這種方法的益處是從中獲取細(xì)胞因子混合物的最終細(xì)胞培養(yǎng)基中加入的血清蛋白最少，因此使之需要較簡單的純化方法來獲得適合用于人的細(xì)胞因子組合物。
在另一個舉例的方法中，用醋酸佛波豆蔻酯(PMA)激發(fā)過度表達(dá)PKR的Namalwa 41027細(xì)胞系，然后用poly IC誘導(dǎo)，有效地誘導(dǎo)了較野生型Namalwa細(xì)胞中所觀察到的更多的PKR表達(dá)。圖6*顯示了與野生型Namalwa細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-β、IL-6和IL-8相比，Namalwa PKR+41027細(xì)胞在poly IC誘導(dǎo)后產(chǎn)生的TNF-β、IL-6和IL-8增加。這些結(jié)果表明通過亞克隆和選擇得到的過度表達(dá)PKR的細(xì)胞系產(chǎn)生了細(xì)胞因子混合物，如在實例3中所進(jìn)一步描述的。
VII.評價細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子表達(dá)的方法細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子的活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生可通過本領(lǐng)域已知的方法來確定。實例包括生物學(xué)活性的功能性試驗和Northern印跡或mRNA的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。免疫測定可用來檢測表達(dá)的蛋白。
可以選擇的是，可以通過免疫學(xué)方法來測定表達(dá)，如細(xì)胞或組織切片的免疫組織化學(xué)染色以直接評價表達(dá)(如，間接免疫熒光試驗)、ELISA、競爭性免疫測定、放射性免疫測定、Western印跡等。用于免疫組織化學(xué)染色和/或液體樣品測定的抗體可以是單克隆或多克隆的，并可在任何哺乳動物中制備。
作為實例，內(nèi)源性或外源性提供的PKR編碼核酸序列的存在、擴(kuò)增和/或表達(dá)可在樣品中直接測定，例如通過測定PKR活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生。這樣的測定包括自體磷酸化測定，eIF2α磷酸化測定，一種激酶測定實驗；Northern印跡法定量mRNA的轉(zhuǎn)錄，點印跡法(DNA或RNA分析)，RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，或原位雜交，根據(jù)編碼PKR的核酸序列，使用合適的標(biāo)記探針；和常規(guī)的Sounthern印跡法。
這些方法的詳細(xì)細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知的，實施這些方法的許多試劑可從商業(yè)渠道購得。一般來說，細(xì)胞因子分析試劑盒可從市場上購得，可用于已知細(xì)胞因子或其他蛋白表達(dá)水平的定量免疫測定(如，從R&D系統(tǒng)獲得的細(xì)胞因子檢測試劑盒)。
VIII.細(xì)胞因子產(chǎn)生從過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和/或抗凋亡蛋白的細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞因子分泌至培養(yǎng)基中，并可被純化或分離，如通過從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除不需要的成分。一般來說，細(xì)胞因子被分餾以分離含有選定特性的細(xì)胞因子，如與特殊結(jié)合媒介物如抗體或受體的結(jié)合親和性；或具有選定的分子量范圍，或等電點范圍。
A.細(xì)胞因子的純化和/或分離一種或多種細(xì)胞系經(jīng)過適當(dāng)時間的選擇、修飾、激發(fā)和處理(即誘導(dǎo))的組合處理后，可產(chǎn)生細(xì)胞因子的混合物。然后含有細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子混合物的培養(yǎng)基被回收，細(xì)胞因子從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離和/或純化。就回收培養(yǎng)基中含有的懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)基可以較低的速度離心、過濾、或用其他的方式處理去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。培養(yǎng)基繼續(xù)被處理，如通過透濾法或分子篩色譜去除低分子量成分，如致熱原，和超出細(xì)胞因子分子量范圍的高分子量成分，典型的為10-40kD。
為獲得所需的細(xì)胞因子混合物，產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的培養(yǎng)基接受多種蛋白分離方法，這些方法利用了每種細(xì)胞因子與如抗體或受體等結(jié)合媒介物的結(jié)合親和性、其分子量或等電點。這些方法的實例包括抗體親和柱色譜、離子交換色譜；乙醇沉淀；反向HPLC；硅色譜或陽離子交換樹脂如DEAE上的色譜；色譜聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；或使用，例如Sephadex G-75的凝膠過濾?？梢圆捎枚喾N蛋白質(zhì)純化的方法，這些方法在本領(lǐng)域是已知的并有所描述，如在Deutscher，酶學(xué)方法，182，1990；Scopes，蛋白質(zhì)純化原理和實踐，Springer-Verlag，紐約，1982。選擇的純化步驟取決于所使用的生產(chǎn)過程和所生產(chǎn)的特定細(xì)胞因子混合物的特性。
在一個優(yōu)選的分離方法中，含有所需細(xì)胞因子混合物的組合物是采用親和色譜通過分離所選擇的細(xì)胞因子而共同純化的。該方法使用純化的抗細(xì)胞因子抗體或可與所需細(xì)胞因子結(jié)合的細(xì)胞因子特異性受體作為親和性媒介。許多種細(xì)胞因子的特異性抗體可從市場上購得，如從Sigma Chemical Co.，Sigma Catalog2000-2001(St.Louis，MO)。
另外，適合細(xì)胞因子-抗體相互作用的親和柱可從市場經(jīng)銷商處，如Pharmacia購得。根據(jù)本發(fā)明采用這樣的柱來制備細(xì)胞因子組合物的過程中，柱采用如Tris緩沖鹽水(TBS)的溶液進(jìn)行平衡，選擇的所需細(xì)胞因子的抗體裝載在預(yù)平衡的親和柱上，使抗體結(jié)合在上面。直接從細(xì)胞培養(yǎng)中或在部分純化后獲得的含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基，冷卻至低溫度如4℃后，并裝載在親和柱上。然后柱在滾動裝置上室溫孵育12-18小時，使細(xì)胞因子與相應(yīng)的抗體結(jié)合。
孵育后，柱用一種或多種沖洗溶液沖洗，如TBS，然后結(jié)合的細(xì)胞因子用合適的洗脫液洗脫。見如Sambrook J，等人，分子克隆實驗室指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，(1989)和美國專利第4,385,991、3,983,001、4,937,200和5,972,599號，每一篇文獻(xiàn)在此為使用親和色譜進(jìn)行蛋白質(zhì)純化提供了詳細(xì)的內(nèi)容。
色譜分離可以按如下進(jìn)行采用許多不同親和柱的每一種從所選擇的細(xì)胞因子混合物中連續(xù)地去除每種單獨的細(xì)胞因子，并將得到的單獨純化的細(xì)胞因子組合起來，或優(yōu)選地，采用親和柱材料將細(xì)胞培養(yǎng)基混合起來，該親和柱材料含有大量吸附抗體的層析柱，這些抗體針對要在最終細(xì)胞因子組合物或混合物中包含的幾種細(xì)胞因子。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，細(xì)胞因子混合物可被處理以去除一些細(xì)胞因子，這些因子對所選擇的適應(yīng)癥很少或沒有已知的價值，或它們已知或可能對治療效應(yīng)有負(fù)作用。
本發(fā)明的細(xì)胞因子組合物或混合物包括由在此所描述的方法制備的產(chǎn)細(xì)胞因子細(xì)胞所產(chǎn)生的兩種或多種細(xì)胞因子。混合物中的細(xì)胞因子因其單獨的或與混合物中其他成分一起的特定生物學(xué)活性，以及它們在治療癌癥、病毒感染和炎癥中的作用或潛在利益而被選擇。這些判斷結(jié)果建立在已經(jīng)存在的臨床試驗數(shù)據(jù)、體外細(xì)胞學(xué)研究和科技文獻(xiàn)上對多種細(xì)胞因子作用的資料的基礎(chǔ)上。
IX.本發(fā)明的細(xì)胞因子組合物的用途本發(fā)明的細(xì)胞因子組合物或混合物可通過以下途徑給藥，包括但不限于，口服、眼內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、經(jīng)皮(TD)注射、肌內(nèi)(IM)注射、皮下(SC)注射、靜脈(IV)注射、腹膜內(nèi)(IP)注射、和腫瘤旁注射或吸入。優(yōu)選的給藥途徑是通過肌內(nèi)、皮下或靜脈途徑注射。典型地，治療持續(xù)至達(dá)到所需的終點，例如減少腫瘤負(fù)荷、清除病毒感染、或減輕炎癥的癥狀。如本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員可以理解的，治療效應(yīng)的優(yōu)選指標(biāo)將根據(jù)在治療中的疾病狀況而不同。如同使用任何治療方案一樣，使用本發(fā)明的細(xì)胞因子混合物的治療周期將根據(jù)對治療效應(yīng)的評價結(jié)果而進(jìn)行調(diào)整。這樣的評價以適合治療中的疾病狀況的頻率有規(guī)則地進(jìn)行。例如，惡性癌癥的有效治療必須防止腫瘤細(xì)胞的繼續(xù)擴(kuò)散，并降低死亡率，即增加患病患者的存活時間。
合適的細(xì)胞因子混合物給藥方案是可變化的，但以初始劑量后接著一個或多個間隔的重復(fù)劑量的連續(xù)給藥為代表。
在本發(fā)明方法的一個應(yīng)用實例中，細(xì)胞因子是干擾素-α或干擾素-β，其劑量范圍是每個患者每次用藥總共的細(xì)胞因子濃度為從大約3至5百萬國際單位至大約15至20百萬國際單位，其中患者平均為70kg，典型的細(xì)胞因子組合物的特異活性為從大約每毫克1×108IU至每毫克1×109IU。
在本發(fā)明方法的另一個應(yīng)用實例中，細(xì)胞因子是IL-2、GM-CSF或IFNγ，其劑量范圍是每個患者每次用藥的總細(xì)胞因子濃度為從大約1至3百萬國際單位至大約5至10百萬國際單位，其中患者平均為70kg。
在一個典型的治療方案中，細(xì)胞因子混合物在4至6周期間內(nèi)每周用藥1至3次。但是，在某些情況下，細(xì)胞因子混合物的用藥可以持續(xù)幾年或更多的不確定時間，例如在給予干擾素-β治療MS的情況下。
手術(shù)、放射治療和化療是目前治療癌癥的基本方法。預(yù)期，細(xì)胞因子混合物的應(yīng)用可與這些其他的癌癥治療和新出現(xiàn)的治療形式結(jié)合起來，新的治療形式包括單克隆抗體和癌癥疫苗。應(yīng)當(dāng)理解，在此描述的這些方法可以協(xié)同或附加的方式與手術(shù)、放療和化療的任何一種相互作用，形成更大的治療效應(yīng)。在某些情況下，治療癌癥的改良方法將常規(guī)的癌癥治療如化療或放療，與細(xì)胞因子混合物的用藥結(jié)合起來。
以上描述的治療方案是以提供實例為目的的，治療的方案可根據(jù)患者的反應(yīng)，按需進(jìn)行調(diào)整。
在本書面說明中引用的所有專利和參考文獻(xiàn)在此均特別地整體合并作為參考。
下面實例的描述并不打算以任何方式限制本發(fā)明。
實例1表達(dá)CrmA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的制備和特征A.表達(dá)CrmA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的制備將CrmA的框內(nèi)編碼序列插入至pEF Bos載體中構(gòu)建pEFFLAG-crmA-puro表達(dá)載體，pEF Bos載體是由Mizushima和Negata(NAR18，5322，1990)所描述的，其基礎(chǔ)是Huang等人，1997所描述的載體。pEF FLAG-crmA-puro含有在強延伸因子1α(EF-1α)啟動子的控制下編碼抗凋亡CrmA蛋白的全長cDNA(GenBank登記號第M14217；牛痘病毒白痘瘡變異體(CPV-W2)(CrmA)基因，全部的編碼序列)，和在pGK啟動子控制下的嘌呤霉素抗性基因。注釋的其他特征是N-末端FLAG抗原表位的編碼序列(Hopp等人，1988)，它可加入至CrmA核酸序列中以便于表達(dá)CrmA的細(xì)胞系的檢測。
載體也可包括(i)多聚腺苷酸信號和轉(zhuǎn)錄終止序列以增強mRNA的穩(wěn)定性；(ii)游離基因復(fù)制的SV40起始點和簡單的載體營救；(iii)氨芐青霉素抗性基因和篩選使用的ColE1起始點，并保留在大腸桿菌中；和(iv)嘌呤霉素抗性標(biāo)記物(Puro)以便保證篩選，并在用pEFFLAG-crmA-puro轉(zhuǎn)染后鑒定含有質(zhì)粒的真核細(xì)胞。
在轉(zhuǎn)染前一天MG-63細(xì)胞以每孔5×104的密度接種在6孔板中。2μg pEF FLAG-crmA-puro質(zhì)粒DNA懸浮在100μl無血清，蛋白或抗生素的Opti-MEM培養(yǎng)基中。Lipofectamine試劑(Gibco，10μl)用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋至100μl。在兩種溶液輕微混合后，混合物在室溫下孵育45分鐘使DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體形成。在處理MG-63細(xì)胞前，600μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基立即加入到含有DNA-脂質(zhì)體混合物的反應(yīng)管中，以獲得最終的轉(zhuǎn)染溶液。細(xì)胞用PBS沖洗，然后添加最終的DNA-脂質(zhì)體混合物并在37℃孵育4小時。緊接著添加1毫升MEM-5％FBS，并繼續(xù)孵育16小時。輕輕的吸除培養(yǎng)上清液，并加入新鮮的細(xì)胞生長培養(yǎng)基(MEM添加5％FBS)。孵育48小時后，加入含有篩選標(biāo)記物，geneticin(G418，500μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基(MEM添加5％FBS)以篩選采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。總之，通過用500μg/ml G418(Gibco-BRL)篩選3-4周可獲得大量的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。
B.表達(dá)CrmA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的特性1.細(xì)胞活力增加野生型(WT)和表達(dá)CrmA(CrmA-#2)的MG-63細(xì)胞的處理是用仙臺病毒(SV)進(jìn)行誘導(dǎo)，采用下列的方法超誘導(dǎo)(SI；Inoue I等人，1991)。
細(xì)胞以每孔2.5×104的密度接種在24孔板中，然后在37℃5％CO2濃度孵育。孵育后，細(xì)胞用IFN-β(100IU/ml)激發(fā)24小時。然后向每孔200μl 2％胎牛血清(FBS)MEM培養(yǎng)基中加入1000血細(xì)胞凝集素單位的SV誘導(dǎo)細(xì)胞，并孵育1小時，然后加入300μl含有polyIC(100μl/ml)和放線菌酮(5μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基，并繼續(xù)孵育5小時。在最后1小時加入放線菌素D至終濃度4μg/ml。在誘導(dǎo)過程后，處理的細(xì)胞用PBS沖洗3次，去除所有誘導(dǎo)物，并重新在含有2％FBS的新鮮MEM中懸浮。
不用仙臺病毒(SV)處理±或超誘導(dǎo)(SI)的野生型(WT)和表達(dá)CrmA(CrmA-#2)的MG-63細(xì)胞作為對照(UT)。每種類型細(xì)胞的活力采用標(biāo)準(zhǔn)的碘化丙啶FACS檢測法來測量。如在圖1中所顯示的，CrmA的表達(dá)可抑制SV/SI誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，在SV誘導(dǎo)和SI處理后在20小時時表達(dá)CrmA的細(xì)胞活力可達(dá)80％。相對比，在同樣條件下僅有20％的野生型MG-63細(xì)胞在此過程中存活。
2.細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加細(xì)胞孵育20小時，然后收集每孔的培養(yǎng)基并通過ELISA測定干擾素-β(IFN-β)的產(chǎn)生。IFN-β ELISA測定根據(jù)供應(yīng)商所描述的方法進(jìn)行。(人干擾素-β ELISA試劑盒；TFB，Inc.經(jīng)銷，由日本東京的FUJIREBIO，Inc.生產(chǎn))。如在圖2中所顯示的，與MG-63野生型對比物相比，CrmA#2 MG-63細(xì)胞明顯的能產(chǎn)生更多的IFN-β。
表達(dá)CrmA(CrmA-#2)的MG-63細(xì)胞在含有0，2mM，4mM和8mM一個已知的PKR抑制劑，核苷類似物2-氨基嘌呤(2-AP)的培養(yǎng)基中經(jīng)受超誘導(dǎo)(SI)處理。
在激發(fā)前一天將細(xì)胞以每孔2.5×104的密度在24孔板中接種，在37℃5％CO2濃度下進(jìn)行SI(超誘導(dǎo))處理。孵育后，細(xì)胞用IFN-β(100IU/ml)激發(fā)24小時，然后加入含有poly IC(100μg/ml)和放線菌酮(5μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基500μl，細(xì)胞繼續(xù)孵育5小時，在最后一個小時加入放線菌素D至終濃度4μg/ml。在誘導(dǎo)過程后，處理的細(xì)胞用PBS沖洗3次，去除所有的誘導(dǎo)物，并重新懸浮在含有2％FBS的新鮮MEM中。
如在圖3中所顯示的，2-AP可以劑量依賴的方式抑制IFN-β的產(chǎn)生，證實PKR在調(diào)節(jié)IFN-β的表達(dá)中具有重要作用。
3.通過Western印跡分析Flag-CrmA蛋白的表達(dá)如上所述制備的親代野生型細(xì)胞系(MG-63-WT)的細(xì)胞和CrmA轉(zhuǎn)化體(MG-63-CrmA-#2)的細(xì)胞，在100毫米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至100％匯合。細(xì)胞用冷磷酸緩沖鹽水(PBS)沖洗，并用細(xì)胞刮收集在1.5毫升的微離心管中。用PBS進(jìn)一步?jīng)_洗后，細(xì)胞在裂解緩沖液(10mMTris-HCL[pH7.5]，1％Triton X-100，0.25％SDS，50mM KCL，1mM二硫蘇糖醇，2mM MgCl2和1×蛋白抑制劑混合物[Roche])中在冰上孵育10分鐘，然后在10,000g離心10分鐘。裂解上清液轉(zhuǎn)移至一個新的微離心管中，根據(jù)生產(chǎn)商提供的實驗方法采用BRL試劑盒測定蛋白濃度。含有100μg蛋白的細(xì)胞裂解物裝在4-12％NuPAGE Bis-Tris MOPS凝膠上，并進(jìn)行電泳分離，分離后凝膠印跡在一張PVDF膜上。這張膜進(jìn)一步印在5％奶-PBS中過夜，并與大鼠抗Flag一抗接觸，該抗體由AStrasser博士饋贈(Royal Melbourne醫(yī)院，維多利亞，澳大利亞)，在1∶500的稀釋度下1小時。印跡的膜用PBS-0.1％Tween-20沖洗3次，用抗大鼠HRP結(jié)合的二抗(1∶2000)孵育1小時。采用ECL檢測試劑(Amersham)可檢測到Flag-CrmA蛋白的存在。
每個用CrmA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的樣品顯示了Flag-CrmA高水平的表達(dá)，相比較親代野生型對照細(xì)胞(MG63-WT)顯示沒有表達(dá)。
實例2單獨過度表達(dá)PKR或過度表達(dá)PKR和抗凋亡蛋白的Namalwa細(xì)胞系A(chǔ).pEF-FLAG-Bcl-XL的制備pEF-FLAG-Bcl-XL載體(Huang等人，1997)含有編碼抗凋亡Bcl-XL蛋白的全長cDNA，可有效的與強延伸因子1α(EF-1α)啟動子連接。該載體另外突出的特征是N-末端FLAG抗原表位(Hopp等人，1988)，它加入到Bcl-XL蛋白中便于篩選表達(dá)高水平Bcl-XL的細(xì)胞系。
載體也可包括i)多聚腺苷酸信號和轉(zhuǎn)錄終止序列以增強mRNA的穩(wěn)定性；ii)游離基因復(fù)制的SV40起始點和簡單的載體營救；iii)氨芐青霉素抗性基因和篩選使用的ColE1起始點，并保留在大腸桿菌中；和iv)嘌呤霉素抗性標(biāo)記物(Puro)以便保證篩選，并在用Bcl-XL和PKR轉(zhuǎn)染后鑒定含有質(zhì)粒的真核細(xì)胞。
B.pcDNA-FLAG-PKR的制備pcDNA-FLAG-PKR載體含有編碼全長人PKR分子(551個氨基酸；Meurs等人，1990；GenBank登記號第NM002759號)的cDNA，該PKR分子用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)修飾后包含編碼序列MDYKDDDDK的N末端FLAG標(biāo)記(Hopp等人，1988)，并插入至真核表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen)中，這樣FLAG-PKR編碼序列在CMV啟動子的控制下被表達(dá)。
稱為pcDNA-FLAG-PKR的載體，含有適合PKR轉(zhuǎn)錄的多種特征，包括i)為高水平的表達(dá)mRNA來自人CMV極早期基因的啟動子序列；ii)多聚腺苷酸信號和來自牛生長激素基因(BGH)的轉(zhuǎn)錄終止序列以增強mRNA的穩(wěn)定性；iii)游離基因復(fù)制的SV40起始點和簡單的載體營救；iv)氨芐青霉素抗性基因和為篩選使用的ColE1起始點，并保留在大腸桿菌中；和v)G418抗性標(biāo)記物(Neo)以便保證篩選，并在轉(zhuǎn)染后鑒定含有質(zhì)粒的真核細(xì)胞。
第二個PKR載體，稱為pTRE-PKR，其制備是通過將相同的PKR cDNA插入到一個從Clontech獲得的pTRE質(zhì)粒的一個限制性/插入位點中。pTRE質(zhì)粒類似于在制備所描述的第一個PKR載體中使用的pFLAG，但它含有一個在CMV啟動子上游的四環(huán)素反應(yīng)元件用于控制插入的基因。
C.6A細(xì)胞系(Bcl-XL和PKR陽性)的制備繼續(xù)用質(zhì)粒pEF-FLAG-Bcl-XL和pcDNA-FLAG-PKR轉(zhuǎn)染人B淋巴母細(xì)胞系Namalwa(WT)。用15μg pEF-FLAG-Bcl-XL質(zhì)粒在DMEM/F12(+10％FBS)中采用基因脈沖發(fā)生儀(Gene Pulserapparatus)(BioRad)設(shè)定在800uF，300V通過對4×106對數(shù)生長的Namalwa細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體。用2μg/ml嘌呤霉素(Gibco-BRL)篩選3-4周獲得大量的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，并用流式細(xì)胞儀如下監(jiān)測Bcl-XL的表達(dá)。沖洗大量的轉(zhuǎn)染體，用丙酮增加膜通透性，然后用2μg/ml鼠抗FLAG M2單克隆抗體(IBI)，藻紅蛋白結(jié)合的羊抗鼠IgG(1μg/ml；Becton-Dickinson)進(jìn)行染色。細(xì)胞在FACScan中進(jìn)行分析，根據(jù)它們前方和側(cè)向的光散射特性區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，通過熒光密度的水平區(qū)分表達(dá)Bcl-XL的細(xì)胞。然后高水平表達(dá)Bcl-XL的轉(zhuǎn)化體(Namalwa-Bcl-XL)用pcDNA-FLAG-PKR轉(zhuǎn)染。
用15μg pcDNA-FLAG-PKR質(zhì)粒在DMEM/F12(+10％FBS)中采用基因脈沖發(fā)生儀(Gene Pulser apparatus)(BioRad)設(shè)定在800uF，300V通過對4×106對數(shù)生長的Namalwa-Bcl-XL細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，得到穩(wěn)定的高水平表達(dá)Bcl-XL的轉(zhuǎn)染體。用2mg/ml geneticin(G418，Gibco-BRL)篩選3-4周獲得大量的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。通過有限稀釋克隆獲得克隆系，用Western印跡分析(Huang等人，1997)分析Bcl-XL和PKR的表達(dá)。采用2μg/ml抗FLAG M2抗體，然后用結(jié)合過氧化物酶的羊抗鼠IgG和ECL檢測(Amersham)鑒定蛋白。Bcl-XL和PKR陽性細(xì)胞系的實例標(biāo)為6A。
D.A9細(xì)胞系(PKR陽性)的制備用15μg pTRE-PKR質(zhì)粒在DMEM/F12(+10％FBS)中采用基因脈沖發(fā)生儀(Gene Pulser apparatus)(BioRad)設(shè)定在800uF，300V通過對4×106對數(shù)生長的Namalwa細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，得到穩(wěn)定的高水平表達(dá)PKR的轉(zhuǎn)染體。用2mg/ml geneticin(G418，Gibco-BRL)篩選3-4周獲得大量的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。通過有限稀釋克隆獲得克隆系，用Western印跡分析(Huang等人，1997)分析Bcl-XL和PKR的表達(dá)。
E.表達(dá)Bcl-XL和PKR的轉(zhuǎn)基因Namalwa細(xì)胞系的特性1.細(xì)胞活力增加在PKR過度表達(dá)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的條件下，在培養(yǎng)物中測定野生型Namalwa細(xì)胞(WT)和實例2C和2D中的A9和6A細(xì)胞的細(xì)胞活力。PKR和Bcl-XL雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)，PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)和親代的Namalwa細(xì)胞(WT)以2.5×105細(xì)胞/ml的密度在加入10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞用20mM PMA(激發(fā)劑)處理20小時，然后用200μg/ml poly r(I)poly r(C)和10μg/mlDEAE葡聚糖(poly IC誘導(dǎo))處理72小時或用200HAU/1×106細(xì)胞的仙臺病毒處理48小時。處理后，在FACScan上通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞活力。
圖4A顯示了在仙臺病毒誘導(dǎo)后，PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)和親代Namalwa細(xì)胞(WT)的活力是相似的，PKR和Bcl-XL雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)可觀察到更高的活力。
圖4B顯示了在poly IC誘導(dǎo)后，PKR和Bcl-XL雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)和親代Namalwa細(xì)胞(WT)的細(xì)胞活力是相似的，PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)觀察到較低的活力。
2.干擾素-α的表達(dá)增加在poly IC和仙臺病毒誘導(dǎo)后，均在PKR過度產(chǎn)生的條件下，在三個細(xì)胞系中分析IFN-α產(chǎn)生的水平。收集培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA試劑盒(R&D Systems)生產(chǎn)商提供的步驟通過ELISA分析IFN-α的水平。
在圖5A中顯示的結(jié)果表明在仙臺病毒誘導(dǎo)后，PKR和Bcl-XL雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)產(chǎn)生的IFN-α明顯高于PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)和親代Namalwa細(xì)胞(WT)產(chǎn)生的IFN-α。
在圖5B中顯示的結(jié)果表明在poly IC誘導(dǎo)后，PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)和PKR和Bcl-XL雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)產(chǎn)生的IFN-α明顯高于親代Namalwa細(xì)胞(WT)產(chǎn)生的IFN-α。
實例3過度表達(dá)PKR的Namalwa細(xì)胞系的制備和細(xì)胞因子產(chǎn)生B.過度表達(dá)細(xì)胞因子和治療性蛋白的Namalwa細(xì)胞系的制備從American Type Culture Collection(ATCC)，10801 UniversityBlvd.，Manassas，Va.，U.S.A.中獲得的野生型Namalwa細(xì)胞。這些細(xì)胞如下面的細(xì)節(jié)進(jìn)行培養(yǎng)，亞克隆，篩選，激發(fā)和誘導(dǎo)。
野生型Namalwa細(xì)胞培養(yǎng)在含有胎牛血清濃度范圍在0.5至15％之間的DMEM/F12培養(yǎng)基中。使用本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員常規(guī)應(yīng)用的方法，單個細(xì)胞通過在96孔板中培養(yǎng)，經(jīng)過有限稀釋克隆(“亞克隆”)。亞克隆的步驟執(zhí)行1至5次，采用典型地用于培養(yǎng)親代細(xì)胞系的培養(yǎng)條件培養(yǎng)亞克隆至大約0.3至0.5百萬細(xì)胞/ml。然后用Northern印跡，Western印跡，PKR自磷酸化測定(Der和Lau Proc Natl Acad Sci928841-8845，1995)，一種采用已發(fā)表的測定eIFα磷酸化(Zamanian-Daryoush，Der，Williams Oncogenes 18315-326，1999)方法檢測組蛋白磷酸化，和一種激酶測定法(通過PKR免疫沉淀法和體外檢測激酶活性(Zamanian-Daryoush等人，Molecular and CellularBiology，201278-1290，2000)進(jìn)行測定)分析亞克隆PKR的表達(dá)和活性。
篩選較親代細(xì)胞系顯示至少兩倍以上激酶活性的亞克隆。篩選的亞克隆也通過Western和Northern印跡監(jiān)測PKR的產(chǎn)生。然后誘導(dǎo)篩選的亞克隆以進(jìn)一步增強PKR和細(xì)胞因子活性，產(chǎn)生和/或表達(dá)，在誘導(dǎo)前激發(fā)或不激發(fā)。
過度表達(dá)PKR細(xì)胞系的實例，稱為Namalwa PKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D1. G7.C1.A9，和Namalwa PKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D1.G7.G3.C1在此用來描述本發(fā)明。
C.過度表達(dá)PKR的Namalwa細(xì)胞的特性1.Namalwa PKR++41027亞克隆細(xì)胞對TNF-β、IL-6和IL-8的表達(dá)Namalwa PKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D1.G7.C1.A9和WT Namalwa細(xì)胞在5.0×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度下用20nM醋酸佛波豆蔻酯在6孔板中預(yù)處理20小時。然后用200μg/ml poly Ipoly C繼續(xù)處理72小時以誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)。在誘導(dǎo)后24小時，48小時和72小時去除處理細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，采用ELISA(R&D Systems)測定TNF-β，IL-6和IL-8的產(chǎn)生。
圖6顯示了相對野生型Namalwa細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-β，IL-6和IL-8，Namalwa PKR++41027，亞克隆2A1.D1.G7.C1.A9細(xì)胞經(jīng)poly IC誘導(dǎo)后TNF-β，IL-6和IL-8的產(chǎn)生增強。TNF-β產(chǎn)生的水平在誘導(dǎo)后72小時最高，在這個時間點上，Namalwa PKR++41027，亞克隆2A1.D1.G7.C1.A9較野生型Namalwa細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-β高大約3倍(3×)。類似地，在用poly IC誘導(dǎo)后72小時，相對親代對照，NamalwaPKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D1.G7.C1.A9誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-6和IL-8超過10倍。
2.在過度表達(dá)細(xì)胞因子和治療性蛋白的細(xì)胞系中IFN-γ的產(chǎn)生增加Namalwa PKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D1.G7.G3.C1在5.0×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度下用20nM醋酸佛波豆蔻酯在6孔板中37℃預(yù)處理20小時以激發(fā)細(xì)胞因子的表達(dá)。然后用100μg/ml poly(I)poly(C)加10μg/ml DEAE葡聚糖繼續(xù)處理48小時以誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)。在誘導(dǎo)后48小時去除處理細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，采用R&D Systems購得的試劑盒采用ELISA測定IFN-γ的表達(dá)和分泌。ELISA根據(jù)生產(chǎn)廠商的指導(dǎo)進(jìn)行(圖6)。
3.在過度表達(dá)細(xì)胞因子和治療性蛋白的細(xì)胞系中多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加在添加10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Namalwa PKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D1.G7.C1.A9在7至8×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度下用1mM丁酸鈉在6孔板中37℃預(yù)處理24小時以激發(fā)細(xì)胞因子的表達(dá)。然后用仙臺病毒，100HA單位繼續(xù)處理24至48小時以誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)。在誘導(dǎo)后24或48小時去除處理細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，根據(jù)生產(chǎn)廠商的指導(dǎo)，采用R&D Systems購得的試劑盒采用ELISA測定細(xì)胞因子或治療蛋白的表達(dá)和分泌。顯示檢測的細(xì)胞因子或治療蛋白水平的結(jié)果在表2提供。
表2.從Namalwa 41027細(xì)胞&中表達(dá)的細(xì)胞因子或其他治療性蛋白&所有蛋白均從Namalwa PKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D.D1.G7.C1.A9中測定

1在任何特定系列的激發(fā)和誘導(dǎo)條件下測定的細(xì)胞因子表達(dá)水平既不代表給定細(xì)胞系能表達(dá)的細(xì)胞因子的全部補足，也不代表絕對水平。參數(shù)包括但不限于，激發(fā)和誘導(dǎo)劑的選擇和濃度、孵育溫度、基質(zhì)和基質(zhì)添加劑、pH、細(xì)胞密度、培養(yǎng)管結(jié)構(gòu)、通風(fēng)情況、攪拌情況和其它能影響細(xì)胞因子表達(dá)最終水平的培養(yǎng)條件。
此外IFN-γ從Namalwa PKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D1.G7.G3.C1中測定。
實例4如下面進(jìn)一步所描述的，制備野生型(WT)、CrmA或表達(dá)CrmA和PKR的MG-63細(xì)胞，并處理以誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生A.用CrmA或CrmA和PKR轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物從ATCC獲得人成骨細(xì)胞瘤MG-63細(xì)胞，并在5％CO2的存在下37℃，在添加5％FBS的MEM中培養(yǎng)。MG-63細(xì)胞的轉(zhuǎn)染采用(1)PEFFlag-CrmA(嘌呤霉素)質(zhì)粒(Strasser博士饋贈)，其質(zhì)粒圖譜和構(gòu)建方法如Huang DC等人(Oncogene 1997 Jan 30；14(4)405-14)所述，使用Lipofectamine(采用生產(chǎn)廠商(Gibco-BRL)建議的步驟)。單個細(xì)胞克隆用有限稀釋法(3-5細(xì)胞/毫升)分離，并采用96孔板篩選單個的抗生素抗性集落。
表達(dá)CrmA的MG-63細(xì)胞隨后用pet V5-PKRwt質(zhì)粒(殺稻瘟素；由Williams B.R.G.博士提供；克里夫蘭臨床基金會)采用Lipofectamine(Gibco-BRL)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在1.5μg/ml嘌呤霉素和10μg/ml殺稻瘟素(Invitrogen Corporation，Carlsbad，加利福尼亞)的存在下篩選穩(wěn)定的細(xì)胞系。通過有限稀釋法(3-5細(xì)胞/毫升)分離單個細(xì)胞克隆，并在96孔板中篩選單個的殺稻瘟素抗性集落。通過Western印跡采用V5抗原表位標(biāo)記抗體(Invitrogen)測定PKR的表達(dá)。
如Inoue等人，1991所述進(jìn)行SI(超誘導(dǎo))。在超誘導(dǎo)前一天，細(xì)胞接種在6孔板中，并在5％CO2的存在下37℃孵育。第二天，細(xì)胞用100IU/ml IFN-β和1mM丁酸鈉進(jìn)行激發(fā)。24小時后，加入含有polyIC(100μg/ml)和放線菌酮(5μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基5小時。在最后一個小時加入放線菌素D至終濃度4μg/ml。然后用PBS沖洗細(xì)胞3次去除所有的誘導(dǎo)物，培養(yǎng)基換為含有5％血清的MEM。在孵育20小時后，收集培養(yǎng)基采用ELISA進(jìn)行細(xì)胞因子分析，測定過程根據(jù)生產(chǎn)廠商(R&DSystems和BioSource International)的指導(dǎo)進(jìn)行。分析的結(jié)果見表3，該表顯示了分析的細(xì)胞因子的結(jié)果，MG-63表達(dá)IFN-β，IL-6，IL-8，GM-CSF，G-CSF，F(xiàn)GF和VEGF的結(jié)果。
表3.MG-63細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子或其他治療性蛋白

實例5表達(dá)分析Namalwa PKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D.D1.G7.C1.A9的細(xì)胞因子表達(dá)曲線采用Affymetrix(Santa Clara，CA)人基因芯片進(jìn)行測定，該芯片的描述見PNAS 1998，9515623-15628。
制備RNA對添加10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中滾瓶培養(yǎng)的NamalwaPKR++41027細(xì)胞，亞克隆2A1.D1.G7.C1.A9進(jìn)行表達(dá)分析。在7至8×105細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度下，細(xì)胞用1mM的丁酸鈉37℃激發(fā)24小時，在1200rpm離心，在含有1％FBS的新鮮生長培養(yǎng)基中以每毫升1×107細(xì)胞的密度重新懸浮。緊接著繼續(xù)接觸仙臺病毒100HA單位60至90分鐘，然后再添加3倍量的新鮮培養(yǎng)基，孵育48小時后誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)。在處理結(jié)束后收獲細(xì)胞，如Anal.Biochemistry162，156-159(1987)所述采用單步硫氰酸胍/苯酚/氯仿提取法為基因芯片分析制備RNA。
表4.誘導(dǎo)后A9(PKR-轉(zhuǎn)染的)Namalwa細(xì)胞基因芯片表達(dá)的結(jié)果




從前面的描述可見，本發(fā)明解決了很多目的和特征。本領(lǐng)域的那些專業(yè)技術(shù)人員現(xiàn)在可從前面的描述中理解到，本發(fā)明中教導(dǎo)的廣泛內(nèi)容可以用多種形式來實現(xiàn)。因此，盡管本發(fā)明已經(jīng)以一些特殊的實施方案及其實例被描述，但應(yīng)該理解，可以進(jìn)行多種改變和修飾而不會偏離本發(fā)明的權(quán)利要求。
權(quán)利要求
1.一種含有人細(xì)胞因子混合物的組合物，通過以下步驟產(chǎn)生(a)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物的人細(xì)胞系，所述細(xì)胞系的特征在于過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子；(b)處理過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系以實現(xiàn)細(xì)胞因子混合物的產(chǎn)生增加；和(c)收集由培養(yǎng)的、過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系所產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系是通過用編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的人細(xì)胞系是通過亞克隆和選擇而產(chǎn)生的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的處理是指激發(fā)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的處理是指激發(fā)和誘導(dǎo)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的收集是指通過共同純化所選擇的細(xì)胞因子分餾產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物在癌癥治療中的用途，其中所述的產(chǎn)生的細(xì)胞因子包括選自以下的兩種或多種細(xì)胞因子白介素--2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、干擾素-ω(IFN-ω)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、自然殺傷增強因子(NKEF)、自然殺傷細(xì)胞刺激因子(NKSF)、TNF-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物在治療病毒感染中的用途，其中所述的產(chǎn)生的細(xì)胞因子包括選自以下的兩種或多種細(xì)胞因子干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、干擾素-ω(IFN-ω)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、白介素-8(IL-8)、白介素-12(IL-12)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物在治療炎癥狀態(tài)中的用途，其中所述的產(chǎn)生的細(xì)胞因子包括選自以下的兩種或多種細(xì)胞因子白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)。
10.包含人細(xì)胞因子混合物的組合物，通過以下步驟產(chǎn)生(a)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子混合物的人細(xì)胞系，所述細(xì)胞系的特征在于過度表達(dá)抗凋亡蛋白；(b)處理過度表達(dá)抗凋亡蛋白的細(xì)胞系以實現(xiàn)細(xì)胞因子混合物的產(chǎn)生增強；和(c)收集由培養(yǎng)的、過度表達(dá)抗凋亡蛋白的細(xì)胞系所產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述的過度表達(dá)抗凋亡蛋白的人細(xì)胞系可被修飾或選擇以便獲得一種細(xì)胞系，其進(jìn)一步的特征是可過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述的過度表達(dá)抗凋亡蛋白和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系是用編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述的過度表達(dá)抗凋亡蛋白和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系是通過亞克隆和選擇而產(chǎn)生的。
14.在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生人細(xì)胞因子混合物的方法，包括(a)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生人細(xì)胞因子混合物的人細(xì)胞系；(b)選擇或修飾培養(yǎng)的人細(xì)胞系，其中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子被該細(xì)胞系過度表達(dá)；(c)處理所述培養(yǎng)的、過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系，以實現(xiàn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生；和(d)收集由培養(yǎng)的、處理的細(xì)胞系所產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
15.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系是用編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的核酸序列轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的人細(xì)胞系是通過亞克隆和選擇而產(chǎn)生的。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系進(jìn)一步被修飾以表達(dá)抗凋亡蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的處理是指激發(fā)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的處理是指激發(fā)和誘導(dǎo)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的細(xì)胞因子選自(a)白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、干擾素-ω(IFN-ω)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、自然殺傷增強因子(NKEF)、自然殺傷細(xì)胞刺激因子(NKSF)、TNF-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)中的兩種或多種，用于治療癌癥；(b)干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、干擾素-ω(IFN-ω)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、白介素-8(IL-8)、白介素-12(IL-12)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)中的兩種或多種，用于治療病毒感染；和白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素--10(IL-10)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)中的兩種或多種，用于治療炎癥狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明公開了由過度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞產(chǎn)生的人細(xì)胞因子混合物及其生產(chǎn)方法。該混合物通過以下步驟制備在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過度表達(dá)的條件下培養(yǎng)人細(xì)胞因子生成細(xì)胞，處理細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，分離由該細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子混合物。
文檔編號C12R1/91GK1527721SQ01817924
公開日2004年9月8日 申請日期2001年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月12日
發(fā)明者A·S·勞, A S 勞, W·H·旺, 旺, L·布郎寧, 贍, N·奧西恩, 鞫 申請人:基因特羅生物治療公司