專利名稱：用病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法和組合物。該方法通過讓待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與一個或多個細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸來提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率。所述接觸步驟可在病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞之前、之后或期間進(jìn)行。本發(fā)明還涉及這種穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用，包括載體所載核酸的表達(dá)或活生物體的治療。
背景技術(shù)：
“轉(zhuǎn)染”總指將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)，它對于生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)分子和重組技術(shù)革命具有重大貢獻(xiàn)。用于高等真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染技術(shù)包括例如磷酸鈣沉淀，DEAE-葡聚糖處理，電穿孔，顯微注射，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)染，以及多種科學(xué)書籍和雜志中的其他方法。
其中，病毒轉(zhuǎn)染的獨特性在于利用了病毒將其遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的天然機制將目的核酸分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。修飾后用于此類技術(shù)的病毒包括例如腺病毒，腺-相關(guān)病毒，單純性皰疹病毒和逆病毒。通常，將感興趣的核酸分子克隆到病毒基因組中。當(dāng)病毒基因組復(fù)制和包裝后，所得的病毒粒子就能夠通過病毒的進(jìn)入機制將目的核酸傳遞到細(xì)胞內(nèi)。
通常，在加載目的核酸之前需要通過核酸操作造成病毒基因組的復(fù)制缺陷。所得的病毒基因組或病毒載體需要輔助病毒或包裝系統(tǒng)來完成病毒粒子的組裝和從細(xì)胞內(nèi)釋放。當(dāng)用病毒載體或病毒粒子將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)時，這樣的技術(shù)稱之為“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。因此，細(xì)胞“轉(zhuǎn)導(dǎo)”一般指用病毒載體或病毒粒子將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。
在轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)中，用逆病毒進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞的基因改造已為人所關(guān)注。尤其受到關(guān)注的是用修飾逆病毒將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞來治療基因缺陷等疾病。這種方法的一個例子可見于造血系統(tǒng)細(xì)胞，其中，逆病毒和慢病毒已成為眾多研究的的主題。
Movassagh等結(jié)合活化T細(xì)胞生命周期的研究結(jié)果論述了他們試圖提高逆病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)率的研究。因此，他們的結(jié)論依賴于轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中活性細(xì)胞的分裂(division)。而且，他們的研究僅限于使用小鼠致癌逆病毒，并且，在轉(zhuǎn)導(dǎo)前必須對細(xì)胞進(jìn)行大量預(yù)激。
June等(WO96/34970)用T細(xì)胞刺激來提高T細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。用活化細(xì)胞或激活細(xì)胞進(jìn)行的T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)還包括Douglas等，Hooijberg等，Onodera等，Klebba等，Barry等和Unutmaz等的研究。不幸的是，這些工作都沒有證明實現(xiàn)了約65％以上的轉(zhuǎn)導(dǎo)率。
Costello等用人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)進(jìn)行了激活和非激活T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。據(jù)其觀察，激活的原始T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)率最高為17％左右，低于非激活T細(xì)胞的19％。他們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)存在HIV-1輔助蛋白時，激活T細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)率可獲得有限的提高，即不超過36％。
Chinnasamy等發(fā)現(xiàn)，在HIV-1輔助蛋白存在下，非激活和用分裂素激活的T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)率都有所提高。和Movassagh等一樣，Chinnasamy等在用慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)前對血淋巴細(xì)胞進(jìn)行了長時間的預(yù)激。雖然Chinnasamy等在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天發(fā)現(xiàn)最初轉(zhuǎn)導(dǎo)率超過96％，但兩周后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的百分比降至71.2％。Haas等也在用能表達(dá)標(biāo)記物基因(綠熒光蛋白)的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)觀察到了瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)和“假轉(zhuǎn)導(dǎo)”現(xiàn)象。根據(jù)標(biāo)記物基因在接受轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代CD34+臍帶血細(xì)胞內(nèi)的非整合性表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天仍檢測到明顯(10％以上)的瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后7天，仍可觀察到5％左右的此類瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的表達(dá)。直到10天后，瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的表達(dá)情況才與用無標(biāo)記物載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)的相仿。
所以，Chinnasamy等雖然采用細(xì)胞因子進(jìn)行了細(xì)胞預(yù)激，仍沒能實現(xiàn)原代淋巴細(xì)胞71.2％(兩周后轉(zhuǎn)導(dǎo)率)以上的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，所謂穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)即病毒載體整合到被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的染色體DNA內(nèi)。而且，根據(jù)Chinnasamy等的描述，他們沒能實現(xiàn)用不表達(dá)輔助蛋白(Vif，Vpr，Vpu和Nef)的HIV載體向非激活淋巴細(xì)胞內(nèi)的明顯轉(zhuǎn)導(dǎo)(轉(zhuǎn)導(dǎo)后14天的效率僅為3.6％)，雖然這些細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后接受了PHA分裂素和IL-2細(xì)胞因子的刺激。雖然，用非激活細(xì)胞和含輔助蛋白的載體使轉(zhuǎn)導(dǎo)率有所提高，但是，不論是否將刺激與載體聯(lián)用，激活或非激活細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第14天的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)率都不超過75％。
Hass等也觀察到了慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)率低的現(xiàn)象，他們用原代CD34陽性臍帶血細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)7天后最大穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)率不到25％。出人意料的是，即使采用極高感染復(fù)數(shù)或載體濃度，例如高達(dá)9000的感染復(fù)數(shù)(MOI)和高達(dá)108感染單位/ml的載體濃度，也未能提高該25％的轉(zhuǎn)導(dǎo)率上限。
Follenzi等也在白介素-3(IL-3)，白介素-6(IL-6)和干細(xì)胞因子(SCF)三種細(xì)胞因子混合物存在下用非常高的MOI 500來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。值得注意的是，這種混合物的使用將使這些細(xì)胞不適合用于人類臨床移植。
因此，目前仍然需要更有效的方法來實現(xiàn)載體向細(xì)胞內(nèi)的高頻穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，還需要更有效的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)非激活細(xì)胞，使之既可用作研究工具又可用作治療劑。
以上對參考文獻(xiàn)的引用并不表示承認(rèn)它們即相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)。所有對日期或主要內(nèi)容的引用都是基于申請人盡其所能獲得的信息，當(dāng)并不擔(dān)保它們的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用病毒載體和病毒粒子對細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的高效方法和組合物?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)”指病毒載體整合到受轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的染色體DNA內(nèi)。本發(fā)明方法包括使待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸。該接觸步驟可在該細(xì)胞與病毒載體或病毒粒子接觸之前、之后或期間進(jìn)行。“病毒載體”指用于通過轉(zhuǎn)導(dǎo)將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的，由病毒獲得的各種形式的核酸，這包括病毒的核酸，例如DNA和RNA，這些核酸的被包裹形式，其中包有病毒核酸的病毒粒子。
本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在其他領(lǐng)域的應(yīng)用，例如通過表達(dá)載體內(nèi)的核酸來生產(chǎn)有用的基因產(chǎn)物和蛋白質(zhì)，或用于治療疾病患者或疾病的危發(fā)個體，尤其是人。
與待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表面結(jié)合的至少一種分子包括各種可與細(xì)胞表面受體、標(biāo)記或其他可識別部分發(fā)生物理相互作用的分子。原則上，任何可結(jié)合于細(xì)胞表面的分子都可用于高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一般理論之外，本發(fā)明認(rèn)為，細(xì)胞表面結(jié)合性分子可使宿主細(xì)胞的染色質(zhì)更易接受DNA整合；更易使病毒載體優(yōu)先整合到一個利于載體基因表達(dá)的位點；促進(jìn)含核酸的衣殼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；促進(jìn)病毒穿越細(xì)胞膜或內(nèi)含體之類胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)；或使細(xì)胞更易接受病毒載體帶入的遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核。本發(fā)明方法包括一種以上的上述可能性。此外，從以上可能性的數(shù)量和多樣性可以看出，本發(fā)明不局限于任何單一理論。相反，鑒于本發(fā)明100％穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)和被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞用于人類疾病治療無副作用的驚人超過，應(yīng)將本發(fā)明視為開辟了人類細(xì)胞治療的新領(lǐng)域。
然而，并非所有細(xì)胞表面結(jié)合性分子都能實現(xiàn)病毒載體的有效穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，如果與細(xì)胞表面分子的結(jié)合誘導(dǎo)的是細(xì)胞凋亡，則結(jié)果不是有效的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)而是細(xì)胞死亡。雖然細(xì)胞死亡是有意殺死細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)所期望的結(jié)果，但并非用含有酬載基因或核酸序列的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞所期望的。較好的細(xì)胞表面結(jié)合性分子應(yīng)使得細(xì)胞更易接受病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)。此類分子的例子包括特定細(xì)胞表面受體或其部分的抗體以及該受體的配體或結(jié)合性結(jié)構(gòu)域。此外，抗體的抗原結(jié)合性片段，例如Fab和Fv片段，也可用于本發(fā)明。所述特定細(xì)胞表面受體的結(jié)合性結(jié)構(gòu)域可包含一個或多個表位。
本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞表面結(jié)合性分子是抗CD3和抗CD28，它們結(jié)合T細(xì)胞從而使之更易為載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)。其他優(yōu)選的細(xì)胞表面結(jié)合性分子是FLT-3配體，TPO和Kit配體之受體的抗體或配體，它們可使表達(dá)此類受體的細(xì)胞，例如造血干細(xì)胞更易為載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)。其他優(yōu)選細(xì)胞表面結(jié)合性分子還包括GM-CSF和IL-4受體的抗體或配體，它們可使樹狀細(xì)胞或其前體，例如單核細(xì)胞，CD34陽性干細(xì)胞，或已分化的樹狀細(xì)胞系后代細(xì)胞更易為載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)。其他細(xì)胞表面結(jié)合性分子還包括位于一細(xì)胞表面上結(jié)合另一細(xì)胞表面的分子。
細(xì)胞表面結(jié)合性分子的其他例子還包括多肽，核酸，糖，脂類和離子，它們都可以是與其他物質(zhì)相絡(luò)合的狀態(tài)。較好的是，此類分子結(jié)合血細(xì)胞表面上的因子，例如CD1a，CD1b，CD1c，CD1d，CD2，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8α，CD8β，CD9，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CDw12，CD13，CD14，CD15，CD15s，CD16a，CD16b，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD31，CD32，CD33，CD34，CD35，CD36，CD37，CD38，CD39，CD40，CD41，CD42a，CD42b，CD42c，CD42d，CD43，CD44，CD45，CD45R，CD46，CD47，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD50，CD51，CD52，CD53，CD54，CD55，CD56，CD57，CD58，CD59，CDw60，CD61，CD62E，CD62L，CD62P，CD63，CD64，CD65，CD66a，CD66b，CD66c，CD66d，CD66e，CD66f，CD67，CD68，CD69，CDw70，CD71，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CD79α，CD79β，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD87，CD88，CD89，CD90，CD91，CDw92，CD93，CD94，CD95，CD96，CD97，CD98，CD99，CD100，CD101，CD102，CD103，CD104，CD105，CD106，CD107a，CD107b，CDw108，CDw109，CD114，CD115，CD116，CD117，CD118，CD119，CD120a，CD120b，CD121a，CD121b，CD122，CD123，CDw124，CD125，CD126，CDw127，CDw128a，CDw128b，CDw130，CDw131，CD132，CD133，CD134，CD135，CD136，CDw137，CD138，CD139，CD140a，CD140b，CD141，CD142，CD143，CD144，CDw145，CD146，CD147，CD148，CDw149，CD150，CD151，CD152，CD153，CD154，CD155，CD156，CD157，CD158a，CD158b，CD161，CD162，CD163，CD164，CD165，CD166和TCRζ。小寫字母(例如a或b)表示由多基因產(chǎn)物構(gòu)成的復(fù)合CD分子或表示屬于結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白家族?！皐”表示還未被完全確認(rèn)的推定CD分子。更完全的CD分子列表可見于Kishimoto，T.(編輯)。當(dāng)前有關(guān)CD分子還可參見Shaw，S.(編輯)蛋白質(zhì)網(wǎng)站http//www.bsi.vt.edu/immunology上的全球WWW資源/雜志。
更好的是結(jié)合淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞和白細(xì)胞表面因子的分子，所述表面因子例如CD2，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD6，CD7，CD8α，CD8β，CD9，CD11a，CD18，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD37，CD38，CD39，CD43，CD44，CD45R，CD46，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD50，CD53，CD54，CD56，CD57，CD58，CD59，CDw60，CD62L，CD68，CD69，CDw70，CD71，CD73，CDw75，CDw76，CD84，CD85，CD86，CD87，CD89，CD90，CD94，CD96，CD97，CD98，CD99，CD100，CD101，CD103，CD107a，CD107b，CDw108，CDw109，CD118，CD119，CD120b，CD121a，CD122，CDw124，CDw127，CDw128a，CDw130，CD132，CD134，CDw137，CD140a，CD140b，CD143，CD146，CD148，CD152，CD153，CD154，CD155，CD161，CD162，CD165，CD166和TCRζ。
適用于本發(fā)明的其他細(xì)胞表面結(jié)合性抗體和分子可參見Linscott的《免疫上生物試劑的發(fā)現(xiàn)》(第11版)，2000年1月，W.D.Linscott，Petaluma，CA。本發(fā)明部分實施例中，細(xì)胞表面結(jié)合性分子不是細(xì)胞因子。
雖然本發(fā)明可采用可溶性細(xì)胞表面結(jié)合性分子來促進(jìn)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，但也有其他優(yōu)選實施方式采用固定化的細(xì)胞表面結(jié)合性分子。較好的是固定化的抗體。或者，可利用表達(dá)該細(xì)胞表面結(jié)合性分子的其他細(xì)胞來進(jìn)行固定化。有效轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞的優(yōu)選方法是采用骨髓基質(zhì)細(xì)胞，在它們的表面表達(dá)能在轉(zhuǎn)導(dǎo)期間促進(jìn)干細(xì)胞維持但不分化的配體。刺激細(xì)胞不限于天然細(xì)胞，任何細(xì)胞都可以經(jīng)基因改造而表達(dá)合適的細(xì)胞表面結(jié)合性分子從而提高轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的適當(dāng)刺激。
還可以采用提高或增強所述至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子結(jié)合能力的其他分子。例如，可將某特定細(xì)胞表面受體的(第一)抗體可溶形式與第二抗體聯(lián)用，該第二抗體與已結(jié)合于細(xì)胞表面的第一抗體交連。
當(dāng)然，任何細(xì)胞都可用于本發(fā)明。較好的是，受轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是真核細(xì)胞，更好的是，原初細(xì)胞(primary cell)。然而，細(xì)胞系也可用本發(fā)明方法來轉(zhuǎn)導(dǎo)，有時還更易轉(zhuǎn)導(dǎo)。一優(yōu)選實施方式中，受轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是原初淋巴細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞)或巨噬細(xì)胞(例如單核巨噬細(xì)胞)或它們各自的前體細(xì)胞，例如造血干細(xì)胞。其他優(yōu)選受轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞一般說來是造血系統(tǒng)細(xì)胞，即通過造血過程形成的細(xì)胞，它們的前體細(xì)胞，以及與血細(xì)胞功能相關(guān)的細(xì)胞。此類細(xì)胞包括造血形成的粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞以及祖代多能細(xì)胞，淋巴樣細(xì)胞和髓樣干細(xì)胞。與血細(xì)胞功能相關(guān)的細(xì)胞包括協(xié)助免疫系統(tǒng)細(xì)胞行使功能的細(xì)胞，例如樹狀細(xì)胞之類抗原呈遞細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，單核細(xì)胞和郎格漢斯細(xì)胞。優(yōu)選實施方式中，所述細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞(即T細(xì)胞)，例如表達(dá)CD4和CD8標(biāo)記的T細(xì)胞。
特別優(yōu)選的實施方式中，所述細(xì)胞是原初CD4+T淋巴細(xì)胞或原初CD34+造血干細(xì)胞。然而，既然本發(fā)明所用的病毒載體可以是水皰性口炎病毒被膜G蛋白(見后文)制成的假型，所以，各種細(xì)胞都可用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)導(dǎo)。這樣的細(xì)胞包括但不限于星形細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞，表皮細(xì)胞、神經(jīng)元、樹狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、免疫反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞、囊狀內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、腫瘤囊狀內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、腎細(xì)胞、卵細(xì)胞或精子細(xì)胞(例如用于制造轉(zhuǎn)基因動物)，參與種系發(fā)生的細(xì)胞，胚胎多能干細(xì)胞或其祖細(xì)胞，包括血小板和紅細(xì)胞之類無核的血細(xì)胞等。較好的是，所述細(xì)胞來自真核多細(xì)胞物種(例如與單核酵母細(xì)胞相反的細(xì)胞)，更好的是，哺乳動物細(xì)胞，例如人細(xì)胞。
受轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可以單獨存在，也可以包括在一大群細(xì)胞內(nèi)。此類“大細(xì)胞群”可以包含例如(混合或純)細(xì)胞培養(yǎng)物，組織(例如表皮、基質(zhì)或其他組織)，器官(例如心臟、肺、肝、膽囊、膀胱、眼睛及其他器官)，器官系統(tǒng)(例如循環(huán)系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，泌尿系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)，皮膚系統(tǒng)或其他器官系統(tǒng))，胚泡，來自胚胎的胚胎干細(xì)胞(例如用于治療遺傳缺陷/疾病，或用于制造轉(zhuǎn)基因動物)，病患組織，例如腫瘤或感染部位，或生物體(例如禽類，哺乳動物，海洋生物，魚類，植物等)。較好的是，作為轉(zhuǎn)導(dǎo)靶的器官/組織/細(xì)胞來自循環(huán)系統(tǒng)(包括但不限于心臟、血管和血液)，呼吸系統(tǒng)(例如鼻，咽，喉，氣管，支氣管，肺等)，胃腸系統(tǒng)(例如口，口腔組織，咽，食道，胃，小腸，唾液腺，胰腺，肝，膽囊等)乳房系統(tǒng)(例如乳房上皮細(xì)胞和組織內(nèi)的支持細(xì)胞)，泌尿系統(tǒng)(例如腎，子宮，膀胱，尿道等)，神經(jīng)系統(tǒng)(包括但不限于腦，脊索和特殊的感受器官，例如眼睛)和外皮系統(tǒng)(例如皮膚)。
更好的是，受轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞選自以下來源心臟，血管，包括腫瘤血管和與感染或病患組織相關(guān)的血管，骨髓，血液，腦，淋巴組織，淋巴結(jié)，脾臟，肺，肝，膽囊，膀胱和眼睛。本發(fā)明一具體實施方式
中，受轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與最終所用的宿主細(xì)胞自體同源，但是，與宿主細(xì)胞同種異體、部分錯配、完全錯配、甚至異種的細(xì)胞也可使用。而且，受轉(zhuǎn)導(dǎo)的可以是適用于任何宿主，包括人類相關(guān)物種，的通用供體細(xì)胞，與物種例如人相關(guān)組群。后一種實施方式在細(xì)胞、組織或器官移植中尤其重要，此類應(yīng)用中，受轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的來源可能成為移植成敗的關(guān)鍵。
適合用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一類優(yōu)選細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，病患細(xì)胞，或因其遺傳特性或同生物體內(nèi)其他細(xì)胞的遺傳特性而易隨時間發(fā)生變異的細(xì)胞。后一種實施方式允許將本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞用于疾病的預(yù)防。乳房癌是此類疾病的一個例子，其預(yù)后指標(biāo)指示可用本發(fā)明轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行治療從而在病發(fā)前及早給予基因干涉。然而，本發(fā)明方法也可用于乳房癌被測出后的治療。本發(fā)明在癌癥治療領(lǐng)域還有許多其他用途，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員無需過多試驗即可將本發(fā)明方法用于多種癌癥的治療。
作為例子而非局限，本發(fā)明用途之一是用于雌激素依賴性乳房癌。將結(jié)合雌激素受體的抗體或配體與治療用病毒載體聯(lián)合可使雌激素依賴性乳房癌中的癌細(xì)胞被優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)。所述載體可包含，例如，抑腫瘤基因，例如皰疹病毒腺苷激酶基因。這樣，可通過添加9-(1，3-二羥基-2-丙氧甲基)鳥嘌呤—一種可被皰疹胸苷激酶激活的前藥—來選擇性地殺死轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。抑腫瘤基因和相應(yīng)前藥的例子還有許多，并且是本領(lǐng)域所熟知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多試驗即可做出適當(dāng)選擇。將可活化前藥與本發(fā)明轉(zhuǎn)導(dǎo)方法聯(lián)用可廣泛用于其他類型的腫瘤，以上舉例并非將本發(fā)明局限于激素依賴型，可溶性生長因子或增殖因子依賴型腫瘤。
例如，Her-2/neu陽性腫瘤細(xì)胞沒有雌激素依賴性，而且不是好的預(yù)后指標(biāo)，因為包含此類細(xì)胞的非雌激素依賴性腫瘤對于紫衫酚—一種雌激素拮抗劑—之類的藥物治療具有很強的抗性。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式之一是在例如骨髓移植方案中，病毒載體制劑中包含結(jié)合Her-2/neu或heregulin的抗體或其他分子來用于轉(zhuǎn)導(dǎo)染上腫瘤的細(xì)胞?；蛘撸捎媚軠p弱腫瘤發(fā)生的載體直接對腫瘤部位轉(zhuǎn)導(dǎo)或向血管內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明的另一實施方式僅針對腫瘤脈管系統(tǒng)，或同時針對腫瘤細(xì)胞。St Croix等已用SAGE分析法確定了與正常內(nèi)皮細(xì)胞相比在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)特異性過量表達(dá)的基因。許多此類基因編碼Thy-1細(xì)胞表面抗原或Endo180凝集素之類細(xì)胞表面分子。被上調(diào)的細(xì)胞表面因子都可能被本發(fā)明所述細(xì)胞表面結(jié)合性分子所結(jié)合，從而刺激有效且穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，腫瘤治療的方法之一可以是在選擇性結(jié)合腫瘤脈管而不結(jié)合正常內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合性分子存在下，用治療性病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，由此殺死這些內(nèi)皮細(xì)胞，繼而破壞腫瘤脈管系統(tǒng)。
本發(fā)明另一實施方式是在病毒載體內(nèi)包含選擇性地在腫瘤而非正常脈管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)抗腫瘤基因表達(dá)的元件(例如作用于mRNA的啟動子或順式作用穩(wěn)化/降解元件)，從而選擇性地在腫瘤脈管系統(tǒng)內(nèi)引起該抗腫瘤基因的表達(dá)。此類方法可體外(ex vivo或in vitro)或體內(nèi)(in vivo)進(jìn)行。如果是針對腫瘤脈管內(nèi)皮，則優(yōu)選體內(nèi)治療方式。或者，如果目標(biāo)是清除骨髓內(nèi)污染性腫瘤細(xì)胞以利骨髓移植，則優(yōu)選體外(ex vivo或in vitro)治療方式。
此外，體內(nèi)應(yīng)用不局限于疾病狀態(tài)，它們還可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)正常細(xì)胞。例如，本發(fā)明可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓內(nèi)的造血干細(xì)胞。在將載體直接注入骨髓時，可加入抗體或其他細(xì)胞表面結(jié)合性分子—例如FLT-3配體、TPO和Kit配體或它們的功能性類似物，或表達(dá)所述細(xì)胞表面結(jié)合性分子的基質(zhì)細(xì)胞的各種組合物，用于實現(xiàn)高效的骨髓轉(zhuǎn)導(dǎo)?！肮δ苄灶愃莆铩敝父鞣N保留了本發(fā)明細(xì)胞表面結(jié)合性分子的細(xì)胞表面結(jié)合活性的分子。此類功能性類似物包括FLT-3配體、TPO和Kit配體的片段；含有一處或多處氨基酸取代、插入或缺失的FLT-3配體、TPO和Kit配體分子；和可模擬細(xì)胞表面結(jié)合性分子的細(xì)胞表面結(jié)合活性的抗體。
實現(xiàn)上述目的的另一種方式是采用骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為病毒載體的生產(chǎn)者細(xì)胞，這樣，通過細(xì)胞治療而非載體制備來提供載體和細(xì)胞表面結(jié)合性分子。另一個例子是通過在載體之外添加CD3或CD28抗體或GM-CSF和IL-4各自的功能性類似物，通過皮下注射進(jìn)行的T細(xì)胞或樹狀細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。皮下組織內(nèi)的淋巴液會將載體和刺激物排入淋巴結(jié)，從而實現(xiàn)靶細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明的優(yōu)點包括不一定需要純化待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。通過選擇待結(jié)合細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)可實現(xiàn)對基本上同類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。這樣，在一群混合血細(xì)胞中，用CD3特異性抗體與細(xì)胞相互作用可增強CD3表達(dá)細(xì)胞—例如某些T細(xì)胞—的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在該細(xì)胞群中表現(xiàn)為相對于不表達(dá)CD3的其他類型細(xì)胞—例如粒細(xì)胞和單核細(xì)胞—的優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)導(dǎo)根據(jù)需要已預(yù)先純化或分離的細(xì)胞類型。采用純化或分離后細(xì)胞類型的優(yōu)點包括例如轉(zhuǎn)導(dǎo)率更高，因為載體相對于待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的比例提高了。
欲轉(zhuǎn)導(dǎo)純化T細(xì)胞時，最好至少有一種分子與T細(xì)胞的表面分子結(jié)合。此類細(xì)胞表面分子的例子包括CD3，CD28，CD25，CD71和CD69。結(jié)合這些細(xì)胞表面分子的分子的例子包括識別這些分子的抗體和單克隆抗體，其中許多可以買到，或可按照標(biāo)準(zhǔn)方法方便地制得。在一轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+或CD8+細(xì)胞的優(yōu)選實施方式中，可采用識別CD3和/或CD28的單克隆抗體?？少I到的此類抗體包括例如識別CD3的OKT3和識別CD28的CD28.2。這些抗體可以可溶形式使用，此后可能會與其他分子交連，也可以固定化形式—例如固定于微珠或其他固體表面上—使用。在本發(fā)明一特別優(yōu)選的實施方式中，抗體被固定在用于病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的容器的表面上，例如組織培養(yǎng)管的管、板或袋的壁上。拋開理論所述，使用固定于細(xì)胞與之粘附或接觸的表面的抗體可提高細(xì)胞表面上細(xì)胞表面相互作用的局部濃度。
欲轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞時，可采用FLT-3配體，TPO(血小板生成素或巨核細(xì)胞生長及發(fā)育因子)或Kit配體的造血干細(xì)胞受體的特異性抗體，也可采用干細(xì)胞陽性細(xì)胞標(biāo)記(包括但不限于CD34或AC133)的抗體。采用含配體化合物或組合物作為細(xì)胞表面結(jié)合性分子時，可采用完整的天然含配體蛋白質(zhì)、配體或與異源蛋白質(zhì)結(jié)合的配體，既可使用其可溶形式，也可使用其固定化形式。固定化形式包括利用親和素/生物素等直接或間接結(jié)合在微珠上。
或者，可在病毒載體的被膜內(nèi)表達(dá)配體，其形式可以是嵌合或融合蛋白和/或與一種或多種其他蛋白質(zhì)(共價或非共價)復(fù)合。此類實施方式中，細(xì)胞表面結(jié)合性分子與病毒載體共同構(gòu)成單一組合物用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞?？稍诓《颈荒?nèi)表達(dá)的細(xì)胞表面結(jié)合性分子還包括例如前述各種表面因子。
其他優(yōu)選的細(xì)胞表面結(jié)合性分子—例如抗體或其片段—是與Nortch或Delta的造血干細(xì)胞受體結(jié)合的分子，或是Notch或Delta蛋白質(zhì)本身，或是與異源蛋白結(jié)合著的Notch或Delta的配體。Notch和Delta編碼的細(xì)胞表面蛋白在果蠅發(fā)育過程中影響著眾多的細(xì)胞決定。脊椎動物的Notch和Delta同源體對于正常的胚胎發(fā)育至關(guān)重要。Delta同源體是參與造血調(diào)節(jié)的重要因素。Delta-Serrate-lag2(DSL)是一種同源體的可溶形式，它可增強原初造血細(xì)胞前體的擴增。DSL與造血細(xì)胞生長因子—例如白介素-3(IL-3)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)—一起能促進(jìn)原初造血祖細(xì)胞的擴增，同時，抑制原始前體分化為僅響應(yīng)IL-3的更成熟的前體細(xì)胞(參考Han等所述)。DSL的作用機制很可能是激活造血細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Notch受體，通過選擇性地阻抑細(xì)胞分化來調(diào)節(jié)細(xì)胞感受態(tài)以對周圍的造血細(xì)胞生長因子而非擴增因子作出反應(yīng)(參考Han和Moore，《血液》，1999)。所以，Delta和Notch同源體和作為它們功能性類似物的抗體也是優(yōu)選的細(xì)胞表面結(jié)合性分子，載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的效率可達(dá)75％以上，尤其是對造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明包括用于所述方法的病毒載體和包含所述病毒載體的組合物。所述載體優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒科)載體，尤其是慢病毒載體。也可采用其他逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如瘤病毒和鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。還可以是來自其他DNA病毒或可在生命周期某時刻將其基因組轉(zhuǎn)為DNA的病毒的載體。較好的是所述病毒屬于腺病毒科，微小病毒科，肝DNA病毒科(包括肝炎δ病毒和一般不歸為肝DNA病毒的戊肝病毒)，乳多孔病毒科(包括多瘤病毒和乳頭瘤病毒)，皰疹病毒科和痘病毒科。
逆轉(zhuǎn)錄病毒科的其他病毒屬于以下屬或亞科瘤病毒，泡沫病毒和慢病毒。瘤病毒亞科的RNA病毒最好是人1型或2型T-嗜淋巴病毒(即HTLV-1或HTLV-2)或牛白血病病毒(BLV)，鳥類造白細(xì)胞組織增生-肉瘤病毒(例如Rous肉瘤病毒(RSV)，鳥類成髓細(xì)胞血癥病毒(AMV)，鳥類成紅細(xì)胞增多癥病毒(AEV)和Rous相關(guān)病毒(RAV；RAV-0至RAV-50)，哺乳動物C型病毒(例如莫洛尼小鼠白血病病毒(MuLV)，Harvey小鼠肉瘤病毒(HaMSV)，Abelson小鼠白血病病毒(A-MuLV)，AKR-MuLV，貓白血病病毒(FeLV)，猿肉瘤病毒，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(REV)，脾壞疽病毒(SNV)，B型病毒(例如小鼠乳房瘤病毒(MMTV))和D型病毒(例如Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和“SAIDS”病毒)。
慢病毒亞科的RNA病毒最好是1型或2型人免疫缺陷病毒(即HIV-1或HIV-2，其中HIV-1過去又稱淋巴結(jié)病相關(guān)病毒3(HTLV-III)和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)相關(guān)病毒(ARV))或其他已知與AIDS或AIDS樣疾病相關(guān)的與HIV-1或HIV-2有關(guān)聯(lián)的病毒。首字母縮寫“HIV”或“AIDS病毒”或“人免疫缺陷病毒”在此都指HIV病毒，HIV相關(guān)病毒。而且，慢病毒亞科的RNA病毒最好是綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎/病毒性羊進(jìn)行性肺病病毒(例如感染綿羊)，貓免疫缺陷病毒(FIV)，牛慢病毒，猿免疫缺陷病毒(SIV)，馬傳染性貧血病毒(EIAV)和公羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)。
尤其好的慢病毒載體是HIV類載體，尤其是HIV-1或HIV-2類或其組合。當(dāng)然，逆轉(zhuǎn)錄病毒(尤其是HIV)的不同血清型可單獨或混合用來制備用于本發(fā)明的載體。本發(fā)明優(yōu)選的載體含有存在于野生型病毒但不存在于“基本”慢病毒載體中的順式作用元件?！盎尽甭《据d體只含有最基本的LTRs和位于5′前導(dǎo)序列中的包裝序列和gag編碼序列，但可以可選性地包含可促進(jìn)載體RNA以Rev依賴性方式向核外轉(zhuǎn)移的RRE元件。優(yōu)選載體還包含增強細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)率的核苷酸序列。
此類載體的一個例子是pN2cGFP，它含有完整的gag和pol。另一個例子是含有pol內(nèi)4551-5096位(pNL4-3中的位序號，編號M19921，HIVNL43 9709bp，由C.E.Bucher提供，NIAID，NIH，Bethesda，MD)序列的載體。然而，能夠提高載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的任何野生型(wt)HIV來源的順式作用元件都可采用。能夠通過本發(fā)明方法進(jìn)行有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體的其他例子是美國專利5,885,806的cr2HIV構(gòu)建體。
此前認(rèn)為尚不足以顯著提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率的一段序列，即Zennou等(2000)記載的中央DNA翼(central DNA flap)(pLAI3內(nèi)4793-4971位片段，相對于pNL4-3內(nèi)的4757-4935位)能夠提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率。本發(fā)明包括以下發(fā)現(xiàn)雖然以上小片段不足以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率，但一段更大545pb片段(pNL4-3內(nèi)4551-5096位)或包含該片段的更大片段能夠提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率。
可用于本發(fā)明的其他病毒載體構(gòu)建體可參考美國專利5,885,806。該專利中的構(gòu)建體只是舉例，可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的載體并不僅限于此。相反，這些構(gòu)建體給予本領(lǐng)域技術(shù)人員的其他啟示是，可用于本發(fā)明的病毒載體既可包含來自野生型病毒的基本序列，也可包含大到野生型病毒完整基因組的序列，但不包含復(fù)制和/或致病必需序列。準(zhǔn)確確定有效轉(zhuǎn)導(dǎo)必需序列的方法屬于本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法。例如，可系統(tǒng)性地將病毒序列返回到“基本”載體中，或從包含近完整HIV基因組的載體(例如cr2HIV)中制造連續(xù)缺失，這些都是本領(lǐng)域所熟知的。
此外，將其他病毒骨架中的序列放入目標(biāo)載體(例如巨細(xì)胞病毒(CMV))中也是本領(lǐng)域的已知技術(shù)。不論使用的究竟是何病毒載體，如果該病毒遺傳物質(zhì)所編碼的各種輔助蛋白以及所含的序列能夠提高在某些類型細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)率，則可以留在載體或輔助者(helper)基因組中。本領(lǐng)域已有多種常規(guī)篩選方法可通過將序列插入載體或輔助者的基因組中來確定該遺傳物質(zhì)是否可提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式之一在載體或輔助者的基因組內(nèi)都未包含輔助蛋白。但這一優(yōu)選實施方式并不排除本發(fā)明在載體或輔助者基因組內(nèi)保留輔助蛋白或其他序列以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率的實施方式。
本發(fā)明所用病毒載體還可以通過“假型(pseudotype)”形成來獲得，其中，用不同的病毒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，產(chǎn)生的后代病毒粒子含有一個病毒的基因組但包裹在含有一種或多種其他病毒外膜蛋白的外層內(nèi)。這種現(xiàn)象已被用來將目標(biāo)病毒載體包裝成“假型”病毒粒子，即用目標(biāo)病毒載體和編碼至少一種其他病毒外膜蛋白或細(xì)胞表面分子的遺傳物質(zhì)共轉(zhuǎn)染或共傳染包裝細(xì)胞。參考美國專利5,512,421。這樣的混合病毒可用所用異源外膜蛋白之一或多種的抗血清來中和。常用于假型形成的一種常用病毒是水泡性胃炎病毒(VSV)，它屬于棒狀病毒科。假型化引入了異源病毒的進(jìn)入機制，因而拓寬了病毒的宿主細(xì)胞范圍。
對本發(fā)明所用病毒載體和VSV進(jìn)行假型化可得到這樣的病毒粒子，其病毒載體核酸包裹在核衣殼內(nèi)，核衣殼則被含有VSV G蛋白的膜包圍。所述的核衣殼宜包含通常與病毒載體相關(guān)的蛋白。含VSV G蛋白的外圍膜當(dāng)病毒載體從用來包裝的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移出來后即成為病毒粒子的一部分。包裝細(xì)胞的例子可參考美國專利5,739,018。本發(fā)明優(yōu)選實施方式之一中，所述病毒顆粒來自HIV，并用VSV G蛋白假型化。含VSV G蛋白的假型病毒顆?？筛腥径喾N細(xì)胞類型，其效率高于兩親病毒載體。宿主細(xì)胞的范圍包括哺乳動物和非哺乳動物細(xì)胞，例如人、鼠、魚、爬行動物和昆蟲的細(xì)胞。
用于本發(fā)明轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的病毒載體還可以在該病毒的啟動子或異源啟動子下包含和表達(dá)一種或多種核酸序列。所述啟動子還可以包含隔離元件，例如紅細(xì)胞系DAN酶超敏位點，使之與操縱子側(cè)接，以實現(xiàn)密切調(diào)控下的基因表達(dá)。優(yōu)選啟動子包括HIV-LTR，CMV啟動子，PGK，U1，E-B病毒的EBER轉(zhuǎn)錄單元，tRNA，U6和U7。雖然Pol II啟動子是優(yōu)選，但Pol III啟動子也可用。組織特異性啟動子也是優(yōu)選的。例如，β珠蛋白基因座調(diào)控區(qū)增強子和α與β珠蛋白啟動子可實現(xiàn)在紅細(xì)胞和紅細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)的組織特異性表達(dá)。另一優(yōu)選實施方式是使用與啟動子相關(guān)的順式作用序列。例如，可用U1基因來增強反義基因的表達(dá)，其中的非啟動子序列用于將反義序列或核酶定向于已剪切的目標(biāo)RNA，參見美國專利5,814,500。
當(dāng)然，可在本發(fā)明病毒載體中引入任何病毒順式作用核苷酸序列，尤其優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組內(nèi)的順式作用序列。例如，可將自gag，pol，env，vif，vpr，vpu，tat或rev基因衍生的順式作用核苷酸序列引入本發(fā)明病毒載體以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率。較好的是，順式作用序列不編碼表達(dá)多肽；不會表達(dá)成為多肽或其部分，因為存在基因缺失，例如翻譯起始位點缺失；只編碼一個大多肽的一部分或片段；或相對天然序列含有一處或多處取代、插入或缺失的突變序列。順式作用序列的一個例子是在HIV pol內(nèi)的cPPT(中央聚嘌呤段)序列。
所述本發(fā)明病毒載體內(nèi)的一段或多段序列可以是該載體源病毒內(nèi)的，也可以是異源序列。所述序列最好是(編碼)目標(biāo)基因產(chǎn)物的全長或部分序列。此類序列和基因產(chǎn)物最好是能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生某種生物學(xué)效應(yīng)的生物活性物質(zhì)。此類物質(zhì)的例子包括蛋白質(zhì)、核糖核酸、酶、轉(zhuǎn)運蛋白或其他生物活性分子。
優(yōu)選實施方式之一中，所述生物活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)，例如毒素、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子或細(xì)胞因子、結(jié)構(gòu)蛋白或細(xì)胞表面分子。所述蛋白質(zhì)可包含一個或多個功能未知的結(jié)構(gòu)域并可以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的同源蛋白。此外，所述蛋白也可以是待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)沒有、缺乏或改變了的?；蛘?，所述蛋白可以是轉(zhuǎn)顯性(transdominant)陰性突變蛋白或餌蛋白，用來阻止某天然蛋白在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)其正常活性。
例如，所述核酸序列可編碼核酶，該酶在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)結(jié)合、剪切并破壞已表達(dá)或待表達(dá)的RNA。或者，所述核酸序列編碼特定核酸序列的反義分子，造成其變性。載體所含序列可以在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，誘導(dǎo)性表達(dá)或在細(xì)胞或病毒調(diào)控性轉(zhuǎn)錄調(diào)控下表達(dá)。根據(jù)目標(biāo)用途，異源序列可編碼任何所需蛋白，例如轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的標(biāo)記。此類標(biāo)記包括可選標(biāo)記，例如特定的抗性表型(例如新霉素抗性)，MDR-1(P-糖蛋白)，O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)，二氫葉酸還原酶(DHFR)，乙醛脫氫酶(ALDH)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，超氧化物歧化酶(SOD)和胞嘧啶脫氨酶。參考Koc等所述。
在本發(fā)明方法中，待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)之前、之后或同時與至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸。例如，可在加入轉(zhuǎn)導(dǎo)所用病毒載體之前、之后或同時將細(xì)胞培養(yǎng)在含有CD3和CD28抗體(包被在培養(yǎng)皿的表面，或固定在培養(yǎng)基內(nèi)的微珠上)的培養(yǎng)基內(nèi)。較好的是，細(xì)胞只在初次接觸病毒載體之后或當(dāng)時與固定化的CD3和/或CD28接觸。此類情況下，在用病毒載體進(jìn)行實際轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，細(xì)胞不與細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸。在細(xì)胞經(jīng)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后與細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸的實施方式中，所述接觸最好發(fā)生在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天內(nèi)，1、2天內(nèi)更好。
細(xì)胞與病毒載體共培養(yǎng)的時間可以不同，這取決于所用的條件和材料。影響培養(yǎng)時間的因素包括所用細(xì)胞、載體和MOI(感染復(fù)數(shù))，用來細(xì)胞表面結(jié)合性分子及其數(shù)量，這些分子是固定化的還是溶解形式的，如何固定化和溶解的，所需的轉(zhuǎn)導(dǎo)率。較好的是培養(yǎng)約8-72小時，以12-48小時為佳。尤其好的一種實施方式中，培養(yǎng)時間為24小時，并可以重復(fù)一次。
待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與病毒載體至少接觸一次，但可以多于一次，這取決于細(xì)胞類型。例如，已經(jīng)通過多次載體轉(zhuǎn)導(dǎo)實現(xiàn)了對CD34陽性干細(xì)胞的高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明的優(yōu)選方法之一同時加入病毒載體和細(xì)胞表面結(jié)合性分子(例如CD3和/或CD28抗體或FLT-3配體，TPO或Kit配體)，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)后約1-8天內(nèi)不更換培養(yǎng)基。更好的是，轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天內(nèi)不更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的時間盡可以長，只要條件允許，且過程本身對細(xì)胞或細(xì)胞所在生物體沒有明顯影響。適合此類用途的細(xì)胞表面結(jié)合性蛋白的例子還包括前文所述的那些。
同理，采用的MOI約為1-400，以低于500為宜。通常，MOI優(yōu)選約2-50，更好的是10-30，但是，也可考慮采用約1至10、20、30或40。最好的MOI是20。而且，每細(xì)胞內(nèi)的病毒載體拷貝數(shù)至少為1。然而，以上所述方法也可采用每細(xì)胞內(nèi)多拷貝數(shù)。優(yōu)選的拷貝數(shù)為每細(xì)胞內(nèi)約1-100份。更好的是拷貝數(shù)是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后提供治療、預(yù)防或生物學(xué)效應(yīng)所需或?qū)崿F(xiàn)最高效轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的最少拷貝數(shù)。
就治療或預(yù)防用途而言，更好的拷貝數(shù)是細(xì)胞能夠耐受，即對細(xì)胞或其所在生物沒有明顯副作用的最大拷貝數(shù)。每細(xì)胞內(nèi)的最低和最高拷貝數(shù)取決于待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和可能存在的其他細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)技術(shù)即可方便的確定最適拷貝數(shù)。例如，逐漸提高轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞濃度和感染復(fù)數(shù)，然后分析拷貝數(shù)、療效或生物學(xué)效應(yīng)，以及對轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或其所在宿主的副作用(例如安全性和毒性)。
體外與病毒載體共培養(yǎng)后，細(xì)胞可在細(xì)胞表面結(jié)合性分子存在下培養(yǎng)不同的時間，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)率分析，或另作他用。或者，可將細(xì)胞培養(yǎng)在適合其發(fā)育和擴增的條件下，例如用白介素-2(IL-2)培養(yǎng)或先用細(xì)胞表面結(jié)合性分子再用IL-2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后培養(yǎng)的時間是任何的，但以1至7到10天為宜。也可培養(yǎng)更長時間，例如14天，但不宜過長，以免損害細(xì)胞。在本發(fā)明細(xì)胞先與細(xì)胞表面結(jié)合性分子共培養(yǎng)然后才與病毒載體共培養(yǎng)的實施方式中，培養(yǎng)時間約為24-72小時，以24小時為最佳。
可將以上轉(zhuǎn)導(dǎo)前培養(yǎng)與現(xiàn)有技術(shù)中用細(xì)胞因子和/或分裂素刺激細(xì)胞相比較。本發(fā)明具有避免采用此類刺激的優(yōu)點，例如，刺激通過擴增來增加細(xì)胞數(shù)量，使之遠(yuǎn)多于刺激前。對擴增后如此多的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)需要多得多的病毒載體和相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)材料(例如容器、培養(yǎng)基、細(xì)胞因子等)，因而會提高成本。而且，刺激細(xì)胞會影響其未來用途的質(zhì)量。據(jù)Movassagh等記載，用為期3天的轉(zhuǎn)導(dǎo)前刺激降低了轉(zhuǎn)導(dǎo)后及此后培養(yǎng)中T細(xì)胞庫的多樣性。此外，轉(zhuǎn)導(dǎo)前刺激不具備轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂不活躍的細(xì)胞這樣的優(yōu)點。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)率約為75-100％。較好的是至少75-90％，更好的是至少90-100％，最好的是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
此外，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可用于研究或治療和預(yù)防活體內(nèi)的病患。研究性用途的例子是Unutmaz等所述的結(jié)構(gòu)-功能研究。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞之治療性用途的例子包括將細(xì)胞導(dǎo)入活生物體。例如，先用本發(fā)明方法將例如美國專利5,885,806所述的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入HIV感染者或危發(fā)個體的未激活的原初T細(xì)胞內(nèi)，然后將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞回輸給患者?；蛘?，可用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞直接表達(dá)含于病毒載體內(nèi)的異源序列。
在參與HIV治療或預(yù)防時，所述載體可編碼已被認(rèn)可用于抗HIV的毒素或其他抗病毒劑。或者，所述載體可編碼定向于HIV的物質(zhì)，例如tat，rev，nef，vpu或vpr基因的轉(zhuǎn)顯性陰性突變體。其他用途中，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可經(jīng)校正而表達(dá)合適的珠蛋白以治療鐮形細(xì)胞貧血癥或地中海貧血癥。還可以對免疫細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，以調(diào)整它們的免疫功能，對抗原的應(yīng)答，或與其他細(xì)胞的相互作用。以上及其他用途都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。


圖1A和1B分別是pN2cGFP和pN1GFP(cPT)的圖譜。圖中標(biāo)明了各限制酶位點以及來自HIV的部分。pN2cGFP構(gòu)建體含有GFP編碼序列，該序列與CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動子操作性連接，從而使GFP表達(dá)受其調(diào)控。pN1GFP(cPT)構(gòu)建體后文又稱pN1(cpt)CGFP，含有來自HIV pol基因的cPPT。這些構(gòu)建體被用于后文實施例。
圖2顯示用包被有固定化CD3和CD28抗體的微珠轉(zhuǎn)導(dǎo)原初T細(xì)胞的結(jié)果。細(xì)胞先與載體接觸然后與微珠接觸(分圖A)，先與微珠接觸然后與載體接觸(分圖B)，同時與載體和微珠接觸(分圖C)?；谵D(zhuǎn)導(dǎo)載體所編碼GFP熒光的流式細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，分圖A-C的轉(zhuǎn)導(dǎo)率分別為90.70％，87.19％和79.14％。
圖3是與病毒載體接觸前用IL-2和PHA-P或用固定于微珠的CD3和CD28抗體刺激CD4+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)率比較。使用固定化抗體，每次的轉(zhuǎn)導(dǎo)率都高于95％。使用IL-2和PHA的則只有70.2-84.5％。
圖4顯示用本發(fā)明方法所得人CD4+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率。轉(zhuǎn)導(dǎo)后15天，通過流式細(xì)胞計數(shù)比較對照細(xì)胞與用能表達(dá)綠熒光蛋白(GFP)的載體以20MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，結(jié)果顯示，約93％的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞也發(fā)出綠熒光。
圖4顯示使用IL-2和PHA-P或用固定化CD3和CD28抗體轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+和GFP+細(xì)胞14天后的FACS分析結(jié)果比較。約93％抗體處理細(xì)胞14天后仍保持穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，而IL-2和PHA處理的細(xì)胞僅有約75％保持穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖5顯示不同病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果。
圖6顯示不同MOI對轉(zhuǎn)導(dǎo)率的影響。
圖7證明，在細(xì)胞表面結(jié)合性分子存在下，用病毒載體多次轉(zhuǎn)導(dǎo)后，實現(xiàn)了對自臍帶血制得的CD34+細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后6周，88％以上的細(xì)胞保持陽性。
圖8分圖A-D顯示移植到SCID(重度聯(lián)合免疫缺陷)小鼠后的長期轉(zhuǎn)導(dǎo)率。約8周后，平均91％以上的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(仍在繼續(xù)成熟)保持轉(zhuǎn)導(dǎo)所得GFP標(biāo)記表達(dá)陽性。
圖9分圖A和B顯示樹狀細(xì)胞的7天后轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
本發(fā)明實施方式本發(fā)明涉及用病毒載體實現(xiàn)效率達(dá)75％以上的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法及組合物。轉(zhuǎn)導(dǎo)后7-10天或14天可將穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞與瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)或假轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞區(qū)分開來。本發(fā)明方法與以下事實有關(guān)待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸提高了穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)率。出人意料的是，所述接觸步驟可在轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟之后進(jìn)行。更出人意料的是，最高穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)率出現(xiàn)在先轉(zhuǎn)導(dǎo)然后與固定化細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸的情形下。
本發(fā)明方法包括用病毒載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)與接觸細(xì)胞表面結(jié)合性分子相結(jié)合。如前所述，所述接觸可在載體轉(zhuǎn)導(dǎo)之前、之后或同時進(jìn)行。本發(fā)明適用于多種細(xì)胞，并可采用任何細(xì)胞表面結(jié)合性分子。可用于本發(fā)明方法的細(xì)胞包括未激活的原初細(xì)胞—即新鮮分離自活體來源的細(xì)胞—以及細(xì)胞系，它們可以在使其保持于擴增狀態(tài)的因子存在下預(yù)先培養(yǎng)不同的時間。如果采用細(xì)胞系，可在用本發(fā)明轉(zhuǎn)導(dǎo)前將它們培養(yǎng)在無刺激因子的條件下。
如果是原初細(xì)胞，可在自活體來源獲得后進(jìn)行特定細(xì)胞類型的選擇。例如，如果要用的是CD4+和/或CD8+細(xì)胞，首先獲得外周血(PB)或臍帶血(來自臍帶的CB)樣品，然后富集CD4+和/或CD8+細(xì)胞。將CD4+和/或CD8+細(xì)胞與其他PB雜細(xì)胞分離可采用標(biāo)準(zhǔn)的磁珠陽性選擇法，塑料粘附陰性選擇法和/或其他本領(lǐng)域認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。測定分離所得細(xì)胞類型的純度可采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫表型分選法和流式細(xì)胞計數(shù)法。
分離后，即可將所得原初細(xì)胞用于效率為75％以上的本發(fā)明病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明最好用原初淋巴細(xì)胞進(jìn)行，例如T細(xì)胞，用能夠表達(dá)目標(biāo)異源遺傳物質(zhì)的HIV-1衍生載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外優(yōu)選的是采用原初造血干細(xì)胞，例如CD34+細(xì)胞。如果異源遺傳物質(zhì)是或編碼用于體內(nèi)治療或預(yù)防疾病的治療性或預(yù)防性產(chǎn)物，則可將轉(zhuǎn)導(dǎo)后的原初細(xì)胞回輸?shù)?例如)患者的體內(nèi)。這樣，本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可用于基因療法，用于通過彌補遺傳缺陷或定向于病毒感染來治療或預(yù)防疾病。
本發(fā)明還可用于有效轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以確定某基因的功能，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)基因，表達(dá)基因庫(cDNA庫和反義基因或核糖核酸酶庫)用于功能性篩選目標(biāo)基因，用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-核酸雙鏈雜交體檢測，基因捕獲，用微陣或蛋白質(zhì)陣列進(jìn)行的高通量基因篩選，或用SAGE、擬蛋白質(zhì)進(jìn)行的研究，以及其他功能分析方法。
若要轉(zhuǎn)導(dǎo)混合細(xì)胞群內(nèi)的原初細(xì)胞則不采用上述分離/純化步驟，而是通過選擇至少一種存在于目標(biāo)細(xì)胞類型上的細(xì)胞表面分子或成分和制備能夠結(jié)合這些成分的一種或多種分子來定向于待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。所述細(xì)胞表面成分可以是靶細(xì)胞表面的受體、標(biāo)記或其他可識別表位。一旦選定，即可制備與所選成分相互作用的分子，例如特異性抗體，以用于本發(fā)明。
例如，可以先純化CD4+和/或CD28+細(xì)胞，然后聯(lián)用固定化CD3和CD28抗體用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)導(dǎo)，也可以用同樣的抗體在混合細(xì)胞群中(例如外周血細(xì)胞(PBC)或外周血單核細(xì)胞(PBMNC))實現(xiàn)CD4+和/或CD28+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于整個白細(xì)胞群中的造血干細(xì)胞很難純化或分離，可以用固定化CD34抗體在混合細(xì)胞群中實現(xiàn)造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明細(xì)胞表面結(jié)合性分子可定向于并結(jié)合待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表面上的成分。較好的是，所述成分是受體、標(biāo)記或細(xì)胞表面其他蛋白質(zhì)類或非蛋白質(zhì)類因子的組成部分。所述成分包括可被細(xì)胞表面結(jié)合性分子識別的表位。這些表位包括含有多肽序列、糖、脂類、核酸、離子或其組合的表位。
細(xì)胞表面結(jié)合性分子的例子包括抗體或其抗原結(jié)合性片段以及細(xì)胞表面受體的配體或結(jié)合域。細(xì)胞表面結(jié)合性分子本身可以是多肽、核酸、糖、脂類或離子。較好的是，所述分子是抗體或其片段，例如Fab或Fv片段。更好的是，所述分子不以可溶形式使用而是固定在固體介質(zhì)—例如可與待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞一起培養(yǎng)的微珠或組織培養(yǎng)皿、袋或板的表面—上使用。轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+或CD8+細(xì)胞的優(yōu)選實施方式中，可在病毒載體存在下，將識別CD3和/或CD28的單克隆抗體加在細(xì)胞培養(yǎng)袋中。
本發(fā)明包括含有本發(fā)明方法所用細(xì)胞表面結(jié)合性分子的組合物，例如包含所述分子和轉(zhuǎn)導(dǎo)所用病毒載體以及可選性存在的待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的組合物。所述病毒載體可以是任何來源的，但優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，尤其是慢病毒載體。尤其好的慢病毒載體是人免疫缺陷病毒(HIV)，最好是HIV-1、HIV-2或其嵌合體的衍生載體。當(dāng)然，可用本發(fā)明方法將不同病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到同一細(xì)胞內(nèi)。例如，一種載體可能是復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，另一種載體則可能是能令第一載體復(fù)制/包裝并擴增的包裝構(gòu)建體。當(dāng)病毒載體編碼各種病毒輔助蛋白時，這些蛋白可包含于任一待轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的載體內(nèi)?；蛘撸《据o助蛋白可通過包含在轉(zhuǎn)導(dǎo)所用病毒顆粒內(nèi)而存在于轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中。此類病毒顆粒可共包裝有效量的輔助蛋白以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)率。在優(yōu)選實施方式之一中，病毒載體不編碼輔助蛋白。
用于本發(fā)明轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的病毒載體還可以包含并表達(dá)處于啟動子調(diào)控下的—段或多段核酸序列。本發(fā)明實施方式之一中，一段核酸序列編碼的基因產(chǎn)物表達(dá)后可緩解或校正待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的遺傳缺陷。另一實施方式中，所述核酸序列編碼或構(gòu)成可預(yù)防或治療病毒性感染的遺傳抗病毒劑?！斑z傳抗病毒劑”在此指由遺傳物質(zhì)編碼或構(gòu)成的物質(zhì)。此類物質(zhì)的例子可參考美國專利5,885,806。它們包括通過抑制病毒蛋白起效的物質(zhì)，例如逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶；通過與病毒因子競爭靶位點起效的物質(zhì)；或定向于病毒目標(biāo)直接造成其變性的物質(zhì)，例如核糖核酸酶和反義構(gòu)建體。遺傳抗病毒劑還包括例如反義分子，RNA餌基因，轉(zhuǎn)顯性突變體，干擾素，毒素，調(diào)節(jié)或改變RNA剪接的核酸，免疫原和核糖核酸酶例如“錘頭狀”核糖核酸酶及其胞外引導(dǎo)序列(EGS)介導(dǎo)的形式。
或者，病毒載體可編碼受轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的標(biāo)記。在附圖所示和后文所述實施例中，綠熒光蛋白(GFP)是轉(zhuǎn)導(dǎo)到CD4+細(xì)胞內(nèi)的病毒載體所編碼的標(biāo)記。其他標(biāo)記還包括前文所列的那些。檢測GFP可確定功能性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的數(shù)量，即此類細(xì)胞不僅被載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且能夠表達(dá)GFP，且表達(dá)水平可通過FACS分析測知。必需指出的是，檢測不一定反映轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的實際數(shù)量，因為有些細(xì)胞可能雖被載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)，但其GFP表達(dá)水平低于FACS檢測的下限。
測定轉(zhuǎn)染率的另一種方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。例如，可用TaqMan PCR來測定穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的病毒載體實際拷貝數(shù)。
待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可在接觸細(xì)胞表面結(jié)合性分子之前、之后或同時與病毒載體接觸。因此，細(xì)胞可先與載體接觸—段時間，然后加入細(xì)胞表面結(jié)合性分子。此類細(xì)胞可以是新鮮分離或制備的尚未激活而進(jìn)入細(xì)胞周期的原初細(xì)胞?；蛘?，細(xì)胞可以先與細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸—段時間，然后接觸病毒載體。與載體接觸后，最好去除過量載體，并在誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)育和/或擴增的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。此類條件可以是有細(xì)胞表面結(jié)合性分子或其他刺激/活化因子—例如細(xì)胞因子和淋巴因子(如果是T細(xì)胞)存在?；蛘撸梢栽谳d體與細(xì)胞接觸之后，進(jìn)一步培養(yǎng)之前去除過量載體。
本發(fā)明另一實施方式是在病毒載體和細(xì)胞表面結(jié)合性分子同時存在下培養(yǎng)細(xì)胞。此類細(xì)胞以未預(yù)先激活的細(xì)胞為宜。在誘導(dǎo)生長或擴增的條件下培養(yǎng)細(xì)胞一段時間，此類條件例如持續(xù)存在細(xì)胞表面結(jié)合性分子或其他刺激/活化因子。或者，可在進(jìn)一步培養(yǎng)前去除過量載體。
在任一以上所述病毒載體與細(xì)胞表面結(jié)合性分子的聯(lián)用中，與載體的共培養(yǎng)都可以至少重復(fù)一次，也可以重復(fù)一次以上，例如兩次、三次、四次或更多次。
待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與病毒載體共培養(yǎng)的時間根據(jù)所用條件和材料而不同。影響培養(yǎng)時間的因素包括所用細(xì)胞、載體和MOI(感染復(fù)數(shù))，用來細(xì)胞表面結(jié)合性分子及其數(shù)量，所述分子是否固定化及如何固定化，以及所需轉(zhuǎn)導(dǎo)率。本發(fā)明優(yōu)選實施方式之一中，所用細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞，載體是HIV衍生載體，MOI約為20，細(xì)胞表面結(jié)合性分子是固定在微珠上的CD3和CD28抗體，所得轉(zhuǎn)導(dǎo)率為93％以上。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會看到，以上因素中，有些具有正關(guān)聯(lián)的，有些則是反關(guān)聯(lián)的。例如，MOI降低會降低轉(zhuǎn)導(dǎo)率，但是如果提高細(xì)胞表面結(jié)合性分子的數(shù)量則可保持轉(zhuǎn)導(dǎo)率。
病毒載體與待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞共培養(yǎng)的時間以24小時為佳，對淋巴細(xì)胞可重復(fù)一次，對造血干細(xì)胞則可重復(fù)多達(dá)4次。類似的，在細(xì)胞先與細(xì)胞表面結(jié)合性分子共培養(yǎng)然后與病毒載體共培養(yǎng)的實施方式中，培養(yǎng)時間約為12-96小時。較好的是，與細(xì)胞表面結(jié)合性分子的共培養(yǎng)與接觸病毒載體同時進(jìn)行。此時，可在引入病毒時讓細(xì)胞表面結(jié)合性分子仍與細(xì)胞接觸?；蛘?，在向細(xì)胞內(nèi)加入載體前先去除細(xì)胞表面結(jié)合性分子。
與載體接觸后，在誘導(dǎo)生長或擴增的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。較好的是，所述條件為仍在細(xì)胞表面結(jié)合性分子存在下培養(yǎng)?；蛘?，細(xì)胞先與細(xì)胞表面結(jié)合性分子共培養(yǎng)，然后換以含有誘導(dǎo)細(xì)胞生長的其他因子例如白介素-2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。另一實施方式是先去除過量細(xì)胞表面結(jié)合性分子和過量載體，然后在誘導(dǎo)細(xì)胞生長或擴增以及進(jìn)一步增強載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子存在下進(jìn)行培養(yǎng)。此類因子包括植物血凝素(PHA)之類分裂素和細(xì)胞因子，生長因子，活化劑，細(xì)胞表面受體，細(xì)胞表面分子，可溶性因子或其組合，還包括這些分子的活性片段，或與其他蛋白質(zhì)和/或因子聯(lián)合。
其他因子包括，例如表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)，血管緊張素，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，GDF，骨成形蛋白(BMP)，成纖維細(xì)胞生成因子(酸性和堿性FGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，PIGF，人生長激素(HGH)，牛生長激素(BGH)，heregulins，兩棲調(diào)節(jié)素，Ach受體誘導(dǎo)活性(ARIA)，RANTES(活化、T細(xì)胞表達(dá)和分泌調(diào)節(jié))，血管生長因子，腫瘤壞死因子β(TNF-β)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，血管形成素1或2，胰島素，胰島素生長因子I或II(IGF-1或IGF-2)，ephrins，leptins，白介素1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15(IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14或IL-15)，G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)，GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)，M-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)，LIF(白血病抑制因子)，血管抑制素，制瘤素，紅細(xì)胞生成素(EPO)，α干擾素(包括其亞型)，β、γ、ω干擾素，趨化因子，巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α或β(MIP-1α或β)，單細(xì)胞趨化蛋白-1或-2(MCP-1或2)，GROβ，MIF(巨噬細(xì)胞遷移抑制因子)，MGSA(黑素瘤生長刺激活性)，α抑制素HGF，PD-ECGF，bFGF，淋巴毒素，Mullerian抑制物，F(xiàn)AS配體，成骨蛋白，多效素/midkine，睫嗜中性因子，雄激素誘導(dǎo)的生長因子，自分泌自力因子，刺猬蛋白，雌激素，孕酮，雄激素，糖皮質(zhì)受體，RAR/RXR，甲狀腺受體，TRAP/CD40，EDF(紅細(xì)胞系分化因子)，F(xiàn)ic(生長因子可誘導(dǎo)趨化因子)，IL-1RA，SDF，NGR或RGD配體，NGF，胸苷-α1，OSM，趨化因子受體，干細(xì)胞因子(SCF)，或它們的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，培養(yǎng)條件的選擇取決于本領(lǐng)域有關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞及其未來用途的已知信息。例如，不可選擇IL-3，IL-6和干細(xì)胞因子聯(lián)用來培養(yǎng)有待用于人移植的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。類似的，培養(yǎng)條件的選擇不應(yīng)有損細(xì)胞活度和轉(zhuǎn)導(dǎo)率。
較好的是，轉(zhuǎn)導(dǎo)后培養(yǎng)時間約為4小時，或1至7到10天。更好的是16-20小時或4、5、6天。也可進(jìn)行14天的轉(zhuǎn)導(dǎo)后培養(yǎng)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)率約為75-100％。較好的是約75-90％，更好的是約90-95％，最好的是91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。
此外，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可用于研究或活體內(nèi)疾病的治療。本發(fā)明的一項優(yōu)選內(nèi)容是轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的治療性用途，亦即用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞生產(chǎn)基因產(chǎn)物或直接導(dǎo)入活體，從而作為基因療法的一部分。例如后文所例舉的，可分離原初T細(xì)胞并用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。以載體所編碼基因產(chǎn)物的產(chǎn)生或過量產(chǎn)生或以載體所賦予的表型作為轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的表征。例如，可用含有并能表達(dá)所需或有用核酸序列的載體先轉(zhuǎn)導(dǎo)原初T細(xì)胞，然后返回(活體)體內(nèi)。較好的是，所述活體是已受HIV-1感染或有此危險的個體。
另一實施方式中，用能夠在導(dǎo)入宿主后條件性殺死T細(xì)胞的基因或核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞。這可用于同種異體骨髓移植，通過用前藥方式殺死T細(xì)胞來預(yù)防移植物抗宿主疾病。
或者，原初細(xì)胞可以是某基因產(chǎn)物缺陷型的，然后由轉(zhuǎn)導(dǎo)所用病毒載體來彌補該缺陷。此類細(xì)胞可在以載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后返回給活體。
這樣，本發(fā)明既具有體外用途，又具有體內(nèi)用途。就向活體內(nèi)輸送而言，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞最好包含在生物學(xué)認(rèn)可的溶液或藥學(xué)認(rèn)可的制劑中。所述輸送可通過已知的靜脈、腹膜內(nèi)或其他輸注方法以及非輸注方法進(jìn)行。給藥劑量根據(jù)各種因素而不同，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說不難確定。結(jié)合病毒載體內(nèi)已知或精心設(shè)計的有效負(fù)載，本發(fā)明有許多用途，轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳物質(zhì)所帶來的益處將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于可能存在的副作用風(fēng)險。
起初，輸送的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞總量約為104-1010。例如，可采用105，106，107，108或109個細(xì)胞。實際數(shù)量取決于被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。如果需要，進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的多次輸送也是一種優(yōu)選實施方式。此外，宜根據(jù)需要調(diào)整宿主以適應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的輸入。調(diào)整方法是本領(lǐng)域所已知的，例子之一是骨髓移植中的調(diào)整。
以上概括描述了本發(fā)明，以下說明性實施例將更有助于對本發(fā)明的理解。除非特別說明，實施例不限定本發(fā)明的范圍。
實施例1原初CD4+T細(xì)胞的制備對標(biāo)準(zhǔn)方法略加修改，分離外周血CD4+T細(xì)胞。具體地說，用粘附法去除混雜的單核細(xì)胞。將非粘附細(xì)胞與包被有抗CD4+抗體的磁性微珠接觸以選擇CD4+細(xì)胞。取出磁珠，分離得到CD4+細(xì)胞。
經(jīng)流式細(xì)胞計數(shù)檢驗，高度純化的CD4+細(xì)胞純度高達(dá)90％以上。
實施例2用細(xì)胞表面結(jié)合性分子以不同接觸時間轉(zhuǎn)導(dǎo)原初CD4+T細(xì)胞。
在細(xì)胞表面結(jié)合前進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)原初CD4+細(xì)胞(約500,000個)按MOI 20與pN2cGFP共培養(yǎng)24小時，然后加入以αCD3和αCD28包被的微珠，再培養(yǎng)7天。圖1顯示pN2cGFP的圖譜。在細(xì)胞表面結(jié)合后進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)原初CD4+細(xì)胞(約500,000個)與αCD3和αCD28包被的微珠共培養(yǎng)24小時，然后按MOI 20向培養(yǎng)物中加入pN2cGFP，繼續(xù)共培養(yǎng)24小時。然后，在含有微珠但無載體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天以洗去過量載體。
細(xì)胞表面結(jié)合與轉(zhuǎn)導(dǎo)同時進(jìn)行在以αCD3和αCD28包被的微珠存在下，原初CD4+細(xì)胞(約500,000個)按MOI 20與pN2cGFP共培養(yǎng)24小時。然后，在含有微珠但無載體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天以洗去過量載體。
方案中可選的替換可用其他病毒載體代替pN2cGFP。此外，在去除過量載體前，轉(zhuǎn)導(dǎo)過程可重復(fù)，即總共2次。而且，轉(zhuǎn)導(dǎo)和去除過量載體后，αCD3和αCD28包被的微珠可以白介素-2(10ng/ml)和PHA-P(3mg/ml)替代。7天后，可將培養(yǎng)基換成含白介素-2(10ng/ml)的無PHA-P培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)7天。
或者，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后與αCD3和αCD28包被的微珠共培養(yǎng)7天后，可洗滌細(xì)胞，然后在白介素-2(10ng/ml)存在下繼續(xù)培養(yǎng)。
實施例III轉(zhuǎn)導(dǎo)后分析轉(zhuǎn)導(dǎo)后，并在培養(yǎng)7或14天后，用流式細(xì)胞計數(shù)法分析細(xì)胞的CD4+和/或綠熒光蛋白(GFP)情況。
以上3種轉(zhuǎn)導(dǎo)方案的比較可見圖2。按MOI 20以pN2cGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)后與固定于微珠上的αCD3和αCD28接觸，轉(zhuǎn)導(dǎo)率約為91％。先與微珠接觸然后轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率約為89％，同時進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)率約為80％。本實驗中，用單核細(xì)胞粘附去除法、CD14MACS去除法和CD4 MACS富集法選出CD4+T細(xì)胞?？贵w的固定如下所述。與載體的接觸在37℃和5％CO2條件下進(jìn)行。培養(yǎng)條件為500,000個CD4+T細(xì)胞/ml，含2％人血清白蛋白的Yssel′s培養(yǎng)基。FACS分析在選擇后第7天進(jìn)行。MF表示平均熒光度。
圖3所示為7天后不同刺激條件的實驗結(jié)果比較。用IL-2和PHA或固定于微珠的CD3和CD28抗體處理CD4+細(xì)胞24小時，然后按MOI 20進(jìn)行一次pN2cGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)。在并列比較中，使用固定化抗體的轉(zhuǎn)導(dǎo)率每次都在95％以上(體現(xiàn)為CD4和GFP雙陽性)。相比之下，以IL-2和PHA刺激所得的轉(zhuǎn)導(dǎo)率僅為70.2-84.5％。FACS分析在選擇后第7天進(jìn)行。
圖4顯示選擇后第15天一次類似實驗的結(jié)果。用IL-2和PHA或固定于微珠上的CD3和CD28抗體處理細(xì)胞24小時，然后按MOI20進(jìn)行一次pN2cGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)，7天后去除PHA-P和微珠，在僅含IL-2的條件下培養(yǎng)(500,000/ml)細(xì)胞，至選擇后第15天。使用固定化抗體后，約93％的細(xì)胞CD4和GFP均呈陽性。用IL-2和PHA處理后，僅75％的細(xì)胞保持CD4和GFP雙陽性。以上結(jié)果表明7天后檢測到的部分陽性細(xì)胞(圖3)可能是“假轉(zhuǎn)染”所致。
實施例IV不同載體對細(xì)胞的高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)該實施例是轉(zhuǎn)導(dǎo)所用載體之間的比較。pN2cGFP含有完整的gag和pol編碼序列，pN1(cpt)cGFP含pol的4551-5096位部分(非編碼)序列。圖5所示結(jié)果表明，同時用固定于微珠上的CD3和CD28抗體刺激，載體數(shù)量為MOI 20的條件下，兩種載體對原初CD4細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)率都很高。FACS在選擇后第10天進(jìn)行。
實施例VMOI對轉(zhuǎn)染率的影響圖6顯示不同MIO的影響，所用2-20 MOI所得的轉(zhuǎn)導(dǎo)率為72.7-83.8％。細(xì)胞先與固定于微珠上的CD3和CD28抗體接觸24小時，然后按不同MOI以pN1(cpt)cGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)。
實施例VICD34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)制備臍帶血CD34+細(xì)胞，在FLT-3配體，TPO和Kit配體(各100ng/ml)存在下進(jìn)行4次pN1(cpt)cGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞在長期培養(yǎng)基(LTC-IC)中培養(yǎng)5周，然后在甲基纖維素中培養(yǎng)10天，然后接受分析(結(jié)果為培養(yǎng)6周以上的結(jié)果)。圖7所示為由CD34幼稚細(xì)胞所得成熟CD45+細(xì)胞的分析結(jié)果。對照細(xì)胞顯示無明顯轉(zhuǎn)導(dǎo)，以載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞則有88％顯示CD45和GFP陽性。
實施例VIICD34+細(xì)胞的長期轉(zhuǎn)導(dǎo)如上所述以pN1(cpt)cGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞，將其移植到經(jīng)部分輻照的SCID小鼠的骨髓內(nèi)。8周后，分離細(xì)胞，用FACS分析帶CD45的成熟人細(xì)胞和GFP表達(dá)。結(jié)果顯示在圖7的分圖A-D中。
分圖A顯示接受非轉(zhuǎn)導(dǎo)人細(xì)胞移植對照鼠的結(jié)果。
分圖B顯示接受以下轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞移植的小鼠的結(jié)果在100ng/ml FLT-3配體，TPO和Kit配體存在下，按MOI 50以pN1(cpt)cGFP載體對細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)4天的轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后8周，該小鼠顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)人細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)率(CD45+陽性)為令人驚奇的96.3％。該小鼠的人細(xì)胞移植水平為11.1％，與此前所報道的結(jié)果相當(dāng)。
分圖C和D顯示接受分圖B所述處理的另兩個小鼠的結(jié)果。結(jié)果顯示以CD45+和GFP雙陽性表征的轉(zhuǎn)導(dǎo)率為87.8％和89.6％，證明高轉(zhuǎn)導(dǎo)率具有再現(xiàn)性。
平均轉(zhuǎn)導(dǎo)率為91.2％，反映了穩(wěn)定的長期轉(zhuǎn)導(dǎo)。
實施例VIII細(xì)胞表面結(jié)合性分子的固定化本實施例描述如何將CD3(B-B11)抗體和CD28(B-T3)抗體與環(huán)氧dynal微珠直接連接，以用于后面是實施例。
1.將0.618g硼酸溶于95ml組織培養(yǎng)級水中，制備成0.1硼酸鹽溶液。充分混合，用高質(zhì)量NaOH調(diào)節(jié)至pH9.5。將最終體積調(diào)定為100ml，用0.2μm過濾器消毒。密封容器，于4℃保存。
2.向以上硼酸鹽溶液中加入抗體至150μg/ml。對B-B11和B-T3抗體來說，每毫升硼酸鹽溶液中加入75μg。將總體積調(diào)定為1ml。加入抗體后的硼酸鹽濃度應(yīng)低于0.05M。每1ml硼酸鹽/抗體溶液加入4×108個環(huán)氧微珠。
3.在轉(zhuǎn)輪上37℃培養(yǎng)24小時。
4.用洗珠培養(yǎng)基于20℃洗滌微珠3次，每次10分鐘，洗珠培養(yǎng)基不含Ca和Mg的磷酸鹽緩沖液，含3％人血清白蛋白，5mM EDTA和0.1疊氮鈉。
5.22℃洗珠30分鐘。
6.4℃洗珠過夜。
7.換以新鮮洗珠培養(yǎng)基，重懸微珠至2×108/ml。IgG包被微珠在4℃至少可穩(wěn)定存放6個月。
實施例IX樹狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)分離外周血單核細(xì)胞，然后用兩種刺激性細(xì)胞因子條件，按MOI 50以pNcGFP進(jìn)行連續(xù)3天的轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述兩種條件為GM-CSF(800單位/ml)，IL-4(500單位/ml)和TNF-α(100單位/ml)或GM-CSF(500單位/ml)和α干擾素(800單位/ml)。圖9分圖A顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)后7天的結(jié)果，其中，第一種細(xì)胞因子條件下的轉(zhuǎn)導(dǎo)率為90.2％。7天后，第二種細(xì)胞因子條件下的轉(zhuǎn)導(dǎo)率為92.9％(分圖B)。CD86是樹狀細(xì)胞唯一的可用標(biāo)記，但需要指出的是，CD86-細(xì)胞也可能是樹狀細(xì)胞。
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不論是否特別指出，本發(fā)明對所列參考文獻(xiàn)均就其全文進(jìn)行了參考。
根據(jù)以上對本發(fā)明的全面論述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，無需過多實驗即可在本發(fā)明范圍內(nèi)，在較寬的范圍內(nèi)用與本文所述相當(dāng)?shù)膮?shù)、濃度和條件來實施本發(fā)明。
雖然以上結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但顯然還可進(jìn)行其他修改。本發(fā)明的范圍意在包涵符合本發(fā)明總旨的各種變更、用途或修改，還包括雖未在此公開但為本領(lǐng)域所已知且符合權(quán)利要求所述必要特征的實施方式。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法，包括讓細(xì)胞與慢病毒載體和至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸，約14天后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞超過75％。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述的細(xì)胞與慢病毒載體接觸在細(xì)胞與至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸之前進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，所述的細(xì)胞與慢病毒載體接觸與細(xì)胞接觸至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子同時進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，所述的細(xì)胞與慢病毒載體接觸在細(xì)胞與至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸之后進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，所述與慢病毒載體的接觸進(jìn)行一次以上。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，所述細(xì)胞為原初細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，所述細(xì)胞表面結(jié)合性分子是抗體，配體或細(xì)胞表面分子。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，所述慢病毒載體包含至少一段順式作用核苷酸序列，所述序列來自gag，pol，env，vif，vpr，vpu，tat或rev基因。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，所述序列是不表達(dá)的，或者是gag，pol，env，vif，vpr，vpu，tat或rev基因的片段或突變體。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，所述慢病毒載體是HIV衍生載體。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，所述慢病毒載體是假型化載體。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，所述假型化載體含有水泡性胃炎病毒G外膜蛋白。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，所述細(xì)胞是造血細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，所述造血細(xì)胞為CD4+細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，所述造血細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，所述淋巴細(xì)胞為CD4+或CD8+細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，所述造血細(xì)胞為CD34+細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，所述造血細(xì)胞為造血干細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，所述至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子包含選自FLT-3配體，TPO和Kit配體或作為它們功能類似物的抗體的分子。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，所述至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子包含選自FLT-3配體，TPO和Kit配體或作為它們功能類似物的抗體的分子。
21.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，所述細(xì)胞是樹狀細(xì)胞或能夠分化為樹狀細(xì)胞的細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，所述至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子選自包含GM-CSF，IL-4和TNF-α；GM-CSF和干擾素-α；或作為以上物質(zhì)之功能類似物的抗體的組合物。
23.如權(quán)利要求14所述的方法，所述至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子選自CD3抗體及其片段，CD28抗體及其片段，和它們的組合。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，所述至少一種細(xì)胞表面結(jié)合性分子包含固定于包被微珠上的CD3抗體和CD28抗體。
25.如權(quán)利要求3或4所述的方法，還包括在誘導(dǎo)生長和/或擴增的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，所述條件還包括進(jìn)一步與細(xì)胞表面結(jié)合性分子或細(xì)胞因子共培養(yǎng)。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，所述細(xì)胞因子為白介素-2.
28.如權(quán)利要求25所述的方法，所述培養(yǎng)進(jìn)行約7天。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，所述培養(yǎng)進(jìn)行約14天。
30.如權(quán)利要求3所述的方法，所述細(xì)胞與慢病毒載體的接觸進(jìn)行約24小時，并可重復(fù)至少1次。
31.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，所述慢病毒的量為MOI低于500。
32.一種將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入活體的方法，包括將所述物質(zhì)導(dǎo)入用權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了用病毒載體有效轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法和組合物。讓待轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與一種或多種細(xì)胞表面結(jié)合性分子接觸提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)率。細(xì)胞與細(xì)胞表面結(jié)合性分子的接觸可在與病毒載體接觸之前、之后或同時進(jìn)行。轉(zhuǎn)導(dǎo)載體可構(gòu)建成表達(dá)目標(biāo)基因，從而使被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可用作治療和預(yù)防制劑。
文檔編號C12N15/63GK1531596SQ01817725
公開日2004年9月22日 申請日期2001年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月31日
發(fā)明者L·休繆, 韓偉, 呂小賓, V·斯德普西金, M·萊舍, B·戴維斯, 張永年, B·德羅普利克, L 休繆, 奩綻 , 縷瘴鶻 申請人:VIRxSYS股份有限公司