專利名稱：一種納米金顆粒原位多次擴增檢測生物分子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種納米金顆粒原位多次擴增檢測生物分子的方法，屬于生物檢測技術領域。
基因(DNA)以及蛋白分子(如配體、受體等)的高靈敏性、簡單、快速的檢測，對于疾病的早期、快速診斷以及在衛(wèi)生檢疫、環(huán)境檢測等領域都具有非常重要的意義，目前較為準確靈敏的檢測方法有熒光標記、放射性標記等方法，這些方法雖然較為靈敏，但是存在著標記、分離、純化等繁瑣的操作，而且需要特殊的儀器等問題，尤其對于放射性標記，還存在同位素放射性污染的問題。因此，開發(fā)一種操作簡單、快捷、設備簡單、靈敏的檢測方法，具有非常重要的意義和廣闊的開發(fā)價值。
2000年I.Willner等人在Chem.Commun.(2000，1025-1026)上發(fā)表文章，報道了一種利用石英晶體微天平(QCM)為檢測儀器的DNA檢測方法。具體步驟包括將巰基DNA(探針1)固定在QCM的表面；將不同濃度的待檢測的cDNA與固定在QCM表面的探針1結合；用巰基DNA與固定尺寸的金顆粒(13nm)結合制成探針2，并用探針2浸泡QCM的表面，即與固定在QCM表面的cDNA結合，達到提高DNA檢測靈敏度的目的。經(jīng)過納米金顆粒增強以后DNA的檢測限由原來的大約10-8mol/L提高到1010mol/L。此法具有簡單、快速等優(yōu)點，但是檢測靈敏度有待進一步提高。根據(jù)QCM的工作原理，即其頻率的降低值與其表面吸附物質(zhì)的質(zhì)量增加值成正比，因此，在1.Willner等人報道的方法中，如果使用的納米金顆粒的粒徑愈大，那么對于提高DNA的檢測靈敏度愈有利。然而納米金顆粒的粒徑愈大(一般超過30nm)，巰基DNA與納米金顆粒雜交時愈易于聚集(J.Am.Chem.Soc.1998,120,12674-12675)，這嚴重制約著這種方法檢測靈敏度的進一步提高。
本發(fā)明的目的是提出一種納米金顆粒原位多次擴增檢測生物分子的方法，以提高生物分子檢測的靈敏度，開發(fā)一種操作簡便、快速、對儀器設備要求不高的方法，廣泛應用于臨床診斷、衛(wèi)生檢疫、環(huán)境監(jiān)測等領域的高靈敏性的DNA以及蛋白質(zhì)分子的檢測。
本發(fā)明提出的納米金顆粒原位多次擴增檢測生物分子的方法，包括以下步驟(1)將顆粒度小于30nm的金顆粒水溶液與濃度大于0.01μg/mL、pH值為5-9的巰基DNA緩沖溶液，或與濃度大于0.01μg/mL、pH值為5-9的配體分子緩沖溶液，按照金顆粒與巰基DNA或與配體分子的摩爾比為1∶1-1000的比例，在20-60℃的條件下混合，時間大于30分鐘，制備成納米金顆粒的生物探針1；(2)用與待檢測的DNA分子互補的巰基DNA或配體分子制備探針2在20-60℃的條件下，用濃度大于0.1μg/mL、pH值為5-9的巰基DNA緩沖溶液，或與濃度大于0.1μg/mL的pH值為5-9的配體分子緩沖溶液，浸泡檢測儀器的樣品臺表面，時間大于2小時，使探針2固定在檢測儀器的樣品臺表面；
(3)用pH值為5-9的待檢測的DNA分子緩沖溶液，或pH值為5-9的待檢測蛋白受體分子緩沖溶液，在20-60℃的條件下，浸泡已經(jīng)固定了探針2的檢測儀器的樣品臺表面，時間大于30分鐘，使待檢測的DNA分子或者待檢測的蛋白受體分子結合在探針2上；(4)在20-60℃的條件下，用納米金顆粒的生物探針1浸泡檢測儀器的樣品臺表面，時間大于30分鐘，使納米金顆粒固定在檢測儀器的樣品臺表面；(5)配制濃度大于0.001％的氯金酸水溶液或pH值為4-9的氯金酸緩沖溶液以及濃度大于0.01mmol/L的羥胺水溶液或羥胺緩沖溶液作為擴增試劑，對固定在檢測儀器的樣品臺表面上的納米金顆粒進行原位多次擴增，使納米金顆粒的尺寸增大，每次擴增時間大于0.5分鐘，即可進行對生物分子的檢測。
若使用的檢測儀器的樣品臺表面為金屬(如金、鉑)，則在其表面固定金顆粒探針之前，需進行適當?shù)姆忾]。封閉條件在溫度為20-60℃的條件下，時間不少于1小時；封閉試劑的濃度大于0.01μg/mL；封閉試劑包括牛血清白蛋白、巰基乙醇～巰基十八醇、巰基乙酸～巰基十八酸、巰基乙胺～巰基十八胺、乙硫醇～十八硫醇等。
使用本發(fā)明提出的納米金顆粒原位多次擴增檢測生物分子的方法，可以顯著提高DNA分子以及蛋白質(zhì)受體分子的檢測靈敏度，經(jīng)過二次或多次擴增之后檢測靈敏度提高大約5個數(shù)量級，檢測限達到10-15mol/L。本發(fā)明可以廣泛應用于DNA以及蛋白質(zhì)分子的檢測，具有、檢測靈敏度高、操作簡便、快速、對儀器設備要求不高等優(yōu)點，可以廣泛應用于臨床診斷、衛(wèi)生檢疫、環(huán)境監(jiān)測等領域，具有十分廣泛的應用前景與開發(fā)價值。
下面詳細介紹本發(fā)明的實施例。
實施例1(1)納米金顆粒的生物探針1的制備用2mL、顆粒度為13nm的金顆粒水溶液與0.5mL、40μg/mL的pH值為7.0的巰基DNA-5’-HS-(CH2)6-GCGCGAACCGTATA-3的PBS緩沖溶液混合，制得金顆粒探針1；(2)探針2在檢測儀器的樣品臺表面的固定用20μg/mL、pH值為8.0的巰基DNA:5’-TCTATCCTACGCT-(CH2)6-SH-3’(探針2)的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液，在40℃的條件下浸泡QCM的金電極表面20小時，實現(xiàn)探針2在檢測儀器的樣品臺表面的固定；(3)用2mg/mL、pH值為7.0的牛血清白蛋白PBS緩沖溶液，對QCM的表面進行封閉；(4)用pH值為7.0的不同濃度的被檢測的核酸分子cDNA:5’-AGCGTAGGATAGATATACGGTTCGCGC-3’的PBS緩沖溶液浸泡QCM的表面，將cDNA分子與探針2結合；(5)在30℃的條件下，用探針1浸泡QCM的表面2小時，實現(xiàn)金顆粒在QCM表面的固定；(6)用0.08％的氯金酸水溶液與0.06mmol/L的羥胺水溶液對固定于QCM的表面金顆粒進行二次擴增，每次擴增1分鐘。實驗結果如下表
10-15＜1 120 210實施例2(1)納米金顆粒的生物探針1的制備用2mL、24nm的金顆粒水溶液與0.5mL、10μg/mL的pH值為8.5的巰基DNA:5’-HS-(CH2)6-ATGGGCCT-3’的PBS緩沖溶液混合，制得金顆粒探針1；(2)探針2在檢測儀器的樣品臺表面的固定將20μg/mL的巰基DNA:5’-SH-(CH9)6-CAGGTTCAT-3’(探針2)，在25℃的條件下浸泡QCM的金電極表面3小時，實現(xiàn)探針2在檢測儀器的樣品臺表面的固定；(3)用巰基乙醇/巰基乙胺的混合溶液，在55℃的條件下，對QCM的表面進行封閉10小時；(4)在25℃的條件下，用pH值為8.5的不同濃度被檢測的cDNA:5’-ATGAACCTGAGGCCCAT-3’的PBS緩沖溶液，浸泡QCM的表面6小時；(5)在50℃的條件下用金顆粒的生物探針1浸泡QCM的表面1小時，實現(xiàn)金顆粒在QCM表面的固定；(6)用pH值為7.0的1％的氯金酸PBS緩沖溶液與0.1mol/L的羥胺水溶液對固定于QCM表面的金顆粒進行二次擴增，每次擴增時間2分鐘。實驗結果如下表
實施例3(1)納米金顆粒的生物探針1的制備在20℃的條件下，用2mL、10nm的金顆粒水溶液與0.5mL、10μg/mL的pH值為5.5的鏈親和素的PBS緩沖溶液混合24小時制得金顆粒探針1；(2)探針2在檢測儀器的樣品臺表面的固定將80μg/mL的巰基DNA:5’-SH-(CH2)6-ATGGGCCT-3’(探針2)在20℃的條件下，浸泡QCM的表面20小時，實現(xiàn)探針2在檢測儀器的樣品臺表面的固定；(3)用丁硫醇/巰基丁醇的混合溶液，在20℃的條件下對QCM的表面進行封閉6小時；(4)在20℃的條件下，用pH值為5.5的不同濃度被檢測的核酸分子cDNA:5’-ATGAACCTGAGGCCCAT-3’的PBS緩沖溶液浸泡QCM的表面1小時；(5)在20℃的條件下，將50μg/mL的生物素化DNA:5’CAGGTTCAT-Biotin-3’與固定在QCM表面的cDNA混合2小時，并在20℃的條件下，用探針1浸泡QCM的表面2小時，實現(xiàn)金顆粒在QCM表面的固定；(6)用10％、pH值為5.5的氯金酸PBS緩沖溶液與1mol/L的羥胺水溶液對固定于QCM表面的金顆粒進行二次擴增，每次擴增時間10分鐘。實驗結果如下表
權利要求
1.一種納米金顆粒原位多次擴增檢測生物分子的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)將顆粒度小于30nm的金顆粒水溶液與濃度大于0.01μg/mL、pH值為5-9的巰基DNA緩沖溶液，或與濃度大于0.01μg/mL、pH值為5-9的配體分子緩沖溶液，按照金顆粒與巰基DNA或與配體分子的摩爾比為1∶1-1000的比例，在20-660℃的條件下混合，時間大于30分鐘，制備成納米金顆粒的生物探針1；(2)用與待檢測的DNA分子互補的巰基DNA或配體分子制備探針2在20-60℃的條件下，用濃度大于0.1μg/mL、pH值為5-9的巰基DNA緩沖溶液，或與濃度大于0.1μg/mL的pH值為5-9的配體分子緩沖溶液，浸泡檢測儀器的樣品臺表面，時間大于2小時，使探針2固定在檢測儀器的樣品臺表面；(3)用pH值為5-9的待檢測的DNA分子緩沖溶液，或pH值為5-9的待檢測蛋白受體分子緩沖溶液，在20-60℃的條件下，浸泡已經(jīng)固定了探針2的檢測儀器的樣品臺表面，時間大于30分鐘，使待檢測的DNA分子或者待檢測的蛋白受體分子結合在探針2上；(4)在20-60℃的條件下，用納米金顆粒的生物探針1浸泡檢測儀器的樣品臺表面，時間大于30分鐘，使納米金顆粒固定在檢測儀器的樣品臺表面；(5)配制濃度大于0.001％的氯金酸水溶液或pH值為4-9的氯金酸緩沖溶液以及濃度大于0.01mmol/L的羥胺水溶液或羥胺緩沖溶液作為擴增試劑，對固定在檢測儀器的樣品臺表面上的納米金顆粒進行原位多次擴增，使納米金顆粒的尺寸增大，每次擴增時間大于0.5分鐘，即可進行對生物分子的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納米金顆粒原位多次擴增檢測生物分子的方法,首先制備成納米金顆粒的生物探針1,用與待檢測的DNA分子互補的巰基DNA或配體分子制備探針2,然后使待檢測的DNA分子或者待檢測的蛋白受體分子結合在探針2上,再使納米金顆粒固定在檢測儀器的樣品臺表面,最后使用擴增試劑對納米金顆粒進行原位多次擴增,即可進行對生物分子的檢測。本發(fā)明方法具有檢測靈敏度高、操作簡便、快速等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK1321776SQ0111813
公開日2001年11月14日 申請日期2001年5月18日 優(yōu)先權日2001年5月18日
發(fā)明者馬占芳, 隋森芳 申請人:清華大學