專利名稱：基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測方法和試劑盒。具體的是從基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中提取脫氧核糖核酸(DNA)，應(yīng)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和限制性內(nèi)切酶(R.E.)分析技術(shù)(酶切技術(shù))對基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中的基因改造成分(genetically modifiedorganisms，GMOs)進(jìn)行定性檢測的方法和試劑盒。
1983年，世界上第一例基因改造植物問世，這標(biāo)明生物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)可以使植物遵從人類的意愿生長。1994年，美國Calgene公司研制的基因改造番茄成為世界上第一個(gè)獲準(zhǔn)商品化生產(chǎn)的基因改造農(nóng)作物。此后，在美國、加拿大、阿根廷和歐洲，先后有數(shù)十種基因改造農(nóng)作物獲準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，這主要包括基因改造的大豆、玉米、棉花、油菜、馬鈴薯、西葫蘆、番木瓜、番茄和南瓜等。在我國，目前有五種基因改造農(nóng)作物獲準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，其中三種為基因改造的番茄，另外兩種是基因改造的甜椒和棉花，還有一種基因改造的花卉——矮牽牛也獲準(zhǔn)了商品化生產(chǎn)。
基因改造農(nóng)作物由于具有抗蟲、抗除草劑、抗病毒以及品質(zhì)改善等優(yōu)點(diǎn)而得到大面積推廣。據(jù)統(tǒng)計(jì)，去年全球基因改造農(nóng)作物的種植面積已達(dá)到4000萬公頃，其中超過半數(shù)為基因改造的大豆，另有近30％為基因改造的玉米。作為全球最大的基因改造農(nóng)作物種植國，美國出口的食品中約60％含有基因改造成分。
1998年英國的一位科學(xué)家實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，老鼠食用了基因改造的馬鈴薯后，體重減輕，器官出現(xiàn)異常，且免疫系統(tǒng)受到破壞。這在英國引起了軒然大波，盡管后來其所在的實(shí)驗(yàn)室對這一結(jié)果進(jìn)行了更正，但基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的安全性依然引起人們的質(zhì)疑盡管目前沒有直接的證據(jù)顯示基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品對人類有現(xiàn)實(shí)的危害，但科學(xué)家們也無法證明已食用的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品對人類的未來不存在危害。
因此，在西方發(fā)達(dá)國家，尤其是歐洲，人們對基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的抵觸情緒。政府也采取相應(yīng)的措施，對基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行檢測并加以標(biāo)簽，標(biāo)明是否含有基因改造成份及其含量，使消費(fèi)者具有知情權(quán)，可以自由選擇基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品。
但由于在基因改造農(nóng)作物中基因改造成分在農(nóng)作物的基因組中所占的比例是非常微小的，且由于產(chǎn)品加工過程中的高溫高壓處理對基因的破壞，以及所加工的產(chǎn)品中存在的抑制因子，因此對基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中基因改造成分的檢測是很困難的。
在國外，科學(xué)家們正在努力研究與改進(jìn)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的檢測方法，以適應(yīng)種類繁多的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品。而在我國，目前政府還未出臺與基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品相關(guān)的法規(guī)和管理標(biāo)準(zhǔn)，在基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的檢測方法上還是空白。
本發(fā)明的目的旨在提供通用的對基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行定性檢測的方法及試劑盒。
本發(fā)明的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測方法如下標(biāo)準(zhǔn)的檢測流程包括四個(gè)部分基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提?。焕肞CR技術(shù)擴(kuò)增出基因改造成分；利用酶切技術(shù)對所擴(kuò)增的基因改造成分進(jìn)行鑒定；對檢測結(jié)果進(jìn)行科學(xué)的通用的解釋。
為防止PCR結(jié)果對樣品的污染，DNA的提取、PCR的準(zhǔn)備、PCR的運(yùn)行及PCR結(jié)果的分析要分開不同的房間進(jìn)行。
第一步、基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取(一)待測樣品的前處理粉末狀的待測樣品不需處理；非粉末狀的固體待測樣品要處理成粉末狀；液態(tài)待測樣品采用冷凍干燥法干燥并研碎成粉末狀；新鮮的待測樣品清洗干凈即可。如對于堅(jiān)硬的食品，例如黃豆、玉米粒等，采用食品加工機(jī)或研缽進(jìn)行研磨，成為粉末狀；對于固體的非堅(jiān)硬食品，例如餅干、薯片等，采用研缽或鑷子將其搗碎，成為粉末狀；對于固體的粉末狀的食品，例如豆粉、面粉等，可直接用于分析；對于半固體的食品，例如番茄醬、腐乳等，采用冷凍干燥法，并研碎成為粉末；對于液體的食品，例如豆奶、啤酒等，采用冷凍干燥法，并研碎成為粉末；對于新鮮的食品，例如新鮮的馬鈴薯、番茄等，可清洗干凈后，直接用于分析。
在進(jìn)行前處理的時(shí)候，每處理完一個(gè)樣品，要及時(shí)清理器具，采用洗滌液、酒精及高溫滅菌等方式，防止食品的交叉污染。
(二)提取待測樣品的DNA，方法一如下1.稱取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)離心管中，緩慢加入700微升(μl)CTAB提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/LCTAB，pH8.0，使用前加入體積比為1％的巰基乙醇)，充分混勻。
若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有700μl提取緩沖液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩沖液中搗碎食品。
2.將離心管置于60℃水浴中，放置45分鐘，期間混勻數(shù)次。
3.加入等體積氯仿，充分混勻。
4.室溫下12,000rpm離心10min。
5.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，重復(fù)氯仿抽提過程一遍。
6.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入1ml樹脂，例如Promega公司的Resin，充分混勻。
7.將混合液通過一個(gè)過濾柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
8.用2ml清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過濾柱，重復(fù)一遍。
9.室溫下11,000rpm離心過濾柱2min。
10.向過濾柱上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘。
11.室溫下11,000rpm離心過濾柱2min。
12.收集洗脫液。
13.用紫外分光光度計(jì)測定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，備用。
提取待測樣品的DNA的方法二如下1.稱取200mg食品粉末，放入1.5ml離心管中，緩慢加入860μl提取緩沖液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)，充分混勻。
若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有860μl提取緩沖液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩沖液中搗碎食品。
2.加入100μl 5M鹽酸胍溶液，混勻。
3.加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻。
4.將離心管置于60℃水浴中，放置3小時(shí)，期間混勻數(shù)次。
5.在室溫下冷卻5分鐘。
6.室溫下13,000rpm離心10min。
7.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入等體積氯仿，充分混勻。
8.室溫下12,000rpm離心10min。
9.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，重復(fù)氯仿抽提過程一遍。
10.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入1ml樹脂，例如Promega公司的Resin，充分混勻。
11.將混合液通過一個(gè)過濾柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
12.用2ml清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過濾柱，重復(fù)一遍。
13.室溫下11,000rpm離心過濾柱2min。
14.向過濾柱上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘。
15.室溫下11,000rpm離心過濾柱2min。
16.收集洗脫液。
17.用紫外分光光度計(jì)測定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，備用。
第二步、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出基因改造成分(一)檢測標(biāo)記及對照基因的確定由于在植物基因轉(zhuǎn)化過程中所使用的大部分的植物轉(zhuǎn)化中間載體均含有CaMV35S啟動(dòng)子、Nos終止子、抗生素篩選標(biāo)記基因NPTII以及除草劑篩選標(biāo)記基因Bar，因此可以將它們作為通用的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品檢測標(biāo)記。另外由于Monsanto公司的“Roundup Ready”抗除草劑大豆和Novartis公司的“Event176”抗蟲玉米在基因改造農(nóng)作物的市場上占有較大的份額，因此“Roundup Ready”所含有的基因改造成分EPSPS基因和CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)，以及“Event 176”所含有的CryIA(b)基因也可以作為特定的含有“Roundup Ready”大豆或“Event 176”玉米以及其它的含有這些基因改造成分的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的檢測標(biāo)記。還有一些基因由于能夠提供抗蟲、抗病毒、耐貯存及改善品質(zhì)等特點(diǎn)，而在農(nóng)作物的基因改造中被廣泛使用，因此它們也可以作為基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品檢測標(biāo)記，例如存在于基因改造的抗蟲馬鈴薯中的CryIIIA基因；存在于基因改造的月桂酸含量增高的油菜中的ACP基因；存在于基因改造的耐貯存的番茄中的CaMV 35S-反義PG基因結(jié)構(gòu)；存在于基因改造的抗病毒的煙草中的CaMV 35S-TMV CP基因結(jié)構(gòu)。
為防止基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品檢測中的假陰性結(jié)果，需要設(shè)立一系列的對照基因，包括針對所有農(nóng)作物的DNA降解對照，例如來源于植物的葉綠體特異性基因UAA，和針對基因改造大豆的大豆特異基因Lectin基因，針對基因改造玉米的玉米特異基因Zein和Invertase基因。
(二)鑒定檢測體系的可靠性和靈敏度在開始對樣品進(jìn)行檢測以前，應(yīng)首先進(jìn)行檢測體系的可靠性和靈敏度的鑒定。
選定混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米(購自歐洲的Joint Research Center，Institute for Reference Material and Measurements)，作為標(biāo)準(zhǔn)來鑒定基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品檢測體系的可靠性和靈敏度。按照前面所述的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取方法，分別提取它們的DNA，然后對各個(gè)檢測標(biāo)記和對照基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立用重蒸水代替DNA模板的空白對照。只有當(dāng)檢測結(jié)果如下時(shí)，才能證明檢測體系的可靠性，同時(shí)可以確定檢測體系的靈敏度以重蒸水代替DNA模板的空白對照，不能擴(kuò)增出任何檢測標(biāo)記和對照基因片段。
“Roundup Ready”0％的大豆，可以擴(kuò)增出植物通有的UAA基因和大豆特異的Lectin基因片段。
“Event 176”0％的玉米，可以擴(kuò)增出植物通有的UAA基因和玉米特異的Zein或Invertase基因片段(Zein和Invertase，可以二者任選其一)。
“Roundup Ready”0.1％和以上的大豆，可以擴(kuò)增出大豆特異的Lectin基因、CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)片段(EPSPS和CaMV 35S-CTP，可以二者任選其一)。則此時(shí)檢測體系的靈敏度為0.1％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.1％的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品。若無法從“Roundup Ready”0.1％的大豆中擴(kuò)增出CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)片段，而可以從“Roundup Ready”0.5％和以上的大豆中擴(kuò)增出這些基因片段，則檢測的靈敏度為0.5％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.5％的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品。依此類推。
“Event 176”0.1％和以上的玉米，可以擴(kuò)增出玉米特異的Zein或Invertase基因、CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子、CryIA(b)基因片段，則此時(shí)檢測體系的靈敏度為0.1％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.1％的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品。若無法從“Event 176”0.1％的玉米中擴(kuò)增出CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子、CryIA(b)基因片段，而可以從“Event 176”0.5％和以上的玉米中擴(kuò)增出這些基因片段，則此時(shí)檢測體系的靈敏度為0.5％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.5％的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品。依此類推。
(三)確定基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測PCR引物和限制性內(nèi)切酶由于產(chǎn)品的加工過程會(huì)對DNA造成降解，因此所擴(kuò)增的檢測標(biāo)記和對照基因片段應(yīng)控制在200堿基對(bp)以內(nèi)，且該片段內(nèi)最好含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于隨后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定。PCR引物的長度應(yīng)控制在18-30bp之間，GC含量應(yīng)控制在30-50％之間。我們選定符合以上條件的PCR引物的位置范圍和限制性內(nèi)切酶如下表基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測PCR引物位置范圍和限制性內(nèi)切酶列表(表一)
(表一)針對上面列表中的PCR引物位置范圍，我們尋找到最佳的引物序列基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測最佳PCR引物和限制性內(nèi)切酶列表(表二)
(表二)(四)確定PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系如下PCR buffer1×
MgCl22.1mMdNTPS0.2mMTaq DNA polymerase 0.5UPfu DNA polymerase 0.5UPrimer 0.5μMDNA template100ng重蒸水 補(bǔ)至20μl(五)確定PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)條件如下預(yù)變性 94℃ 2分鐘變性94℃ 40秒復(fù)性50-62℃ 40秒延伸72℃ 40秒40個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘。
PCR產(chǎn)物在3％瓊脂糖膠上，110V恒壓下電泳30分鐘。在紫外燈下檢測電泳結(jié)果。
第三步、利用酶切技術(shù)對所擴(kuò)增的基因改造成分進(jìn)行鑒定為避免所擴(kuò)增的基因改造成分(即PCR產(chǎn)物)的假陽性情況，需要采用合適的限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，只有通過酶切得到相應(yīng)的基因片段，才能證實(shí)PCR產(chǎn)物的正確性。對于擴(kuò)增片段過短，而無法通過酶切鑒定的，可以通過雜交或測序進(jìn)行PCR產(chǎn)物的鑒定。
酶切體系如下PCR產(chǎn)物15μl限制性內(nèi)切酶buffer 2μl重蒸水 2μl限制性內(nèi)切酶 1μl(10U)總反應(yīng)體系 20μl在37℃保溫3個(gè)小時(shí)。然后在3％瓊脂糖膠上，110V恒壓下電泳30分鐘。在紫外燈下檢測電泳結(jié)果。
第四步、對檢測結(jié)果進(jìn)行解釋在檢測體系的可靠性得到確認(rèn)以后，對基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的檢測結(jié)果解釋如下如果得到相應(yīng)的Lectin基因片段，則證明該樣品中含有大豆成分；如果得到相應(yīng)的Zein或Invertase基因片段，則證明該樣品中含有玉米成分；
如果得到相應(yīng)的CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子和NPTII基因片段中的一個(gè)或幾個(gè)，則證明該樣品中含有基因改造成分；如果得到相應(yīng)的EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)片段，則證明該樣品含有基因改造成分，且為EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)；如果得到相應(yīng)的CryIA(b)基因片段，則證明該樣品含有基因改造成分，且為CryIA(b)基因；如果僅得到相應(yīng)的UAA基因片段，則證明該樣品不含有基因改造成分；如果沒有得到任何相應(yīng)的片段，則證明從該樣品提取的DNA中含有PCR反應(yīng)的抑制成分，所提取的DNA需要進(jìn)一步純化。
本發(fā)明的實(shí)施基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測方法的試劑盒由如下試劑構(gòu)成DNA提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；樹脂；過濾柱(column)；清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；PCR緩沖液；MgCl2；dNTPS；Taq DNA polymerase；Pfu DNA polymerase；PCR引物，為表一或表二中的引物的全部或部分組合；限制性內(nèi)切酶，為表一或表二中的限制性內(nèi)切酶的全部或部分組合。
采用本發(fā)明的方法和試劑盒，可以方便準(zhǔn)確地判定一種農(nóng)作物或其加工產(chǎn)品是否含有基因改造成分。
實(shí)施例用于實(shí)施基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品定性檢測方法的試劑盒由下列試劑組成提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；樹脂；過濾柱(column)；清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；PCR緩沖液；MgCl2；dNTPS；Taq DNA polymerase；Pfu DNA polymerase；表二中的CaMV35啟動(dòng)子引物1，Nos終止子引物1，NPTII引物1，CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)引物1，CryIA(b)基因引物1，UAA基因引物，Lectin基因引物1和Invertase基因引物；限制性內(nèi)切酶EcoRV，AflIII，NciI，PvuII，StyI和NaeI。
所檢測的食品為購自超市的進(jìn)口薯片。用研缽磨成粉末狀，采用前述基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取方法一，得到樣品的DNA，同時(shí)提取混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米的DNA。按照前述PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，分別利用各對引物對各個(gè)檢測標(biāo)記和對照基因進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行檢測系統(tǒng)可靠性和靈敏度的鑒定。最后對各個(gè)PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定。按照前述對檢測結(jié)果的解釋整理出相應(yīng)的檢測報(bào)告。
權(quán)利要求
1.基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測方法，步驟包括第一步、基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取(一)待測樣品的前處理粉末狀的待測樣品不需處理；非粉末狀的固體待測樣品要處理成粉末狀；液態(tài)待測樣品采用冷凍干燥法干燥并研碎成粉末狀；新鮮的待測樣品清洗干凈即可；(二)提取基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的DNA，方法如下(1)稱取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)離心管中，緩慢加入700微升(μl)CTAB提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0，使用前加入體積比為1％的巰基乙醇)，充分混勻；若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有700μl提取緩沖液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩沖液中搗碎食品；(2)將離心管置于60℃水浴中，放置45分鐘，期間混勻數(shù)次；(3)加入等體積氯仿，充分混勻；(4)室溫下12,000rpm離心10min；(5)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，重復(fù)氯仿抽提過程一遍；(6)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入1ml樹脂，充分混勻；(7)將混合液通過一個(gè)過濾柱(column)；(8)用2ml清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過濾柱(column)，重復(fù)一遍；(9)室溫下11,000rpm離心過濾柱(column)2min；(10)向過濾柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘；(11)室溫下11,000rpm離心過濾柱(column)2min；(12)收集洗脫液；(13)用紫外分光光度計(jì)測定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，備用；提取DNA還可以采取如下方法(1)稱取200mg食品粉末，放入1.5ml離心管中，緩慢加入860μl提取緩沖液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)，充分混勻；若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有860μl提取緩沖液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩沖液中搗碎食品；(2)加入100μl 5M鹽酸胍溶液，混勻；(3)加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻；(4)將離心管置于60℃水浴中，放置3小時(shí)，期間混勻數(shù)次；(5)在室溫下冷卻5分鐘；(6)室溫下13,000rpm離心10min；(7)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入等體積氯仿，充分混勻；(8)室溫下12,000rpm離心10min；(9)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，重復(fù)氯仿抽提過程一遍；(10)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入1ml樹脂，充分混勻；(11)將混合液通過一個(gè)過濾柱(column)；(12)用2ml清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過濾柱(column)，重復(fù)一遍；(13)室溫下11,000rpm離心過濾柱(column)2min；(14)向過濾柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘；(15)室溫下11,000rpm離心過濾柱(column)2min；(16)收集洗脫液；(17)用紫外分光光度計(jì)測定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，備用；第二步、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出基因改造成分，方法如下(一)確定檢測標(biāo)記及對照基因選定下列要素作為檢測標(biāo)記存在于植物基因轉(zhuǎn)化過程中所使用的大部分的植物轉(zhuǎn)化中間載體中的CaMV35S啟動(dòng)子、Nos終止子、抗生素篩選標(biāo)記基因NPTII以及除草劑篩選標(biāo)記基因Bar；存在于Monsanto公司的“Roundup Ready”抗除草劑大豆中的基因改造成分EPSPS基因和CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)；存在于Novartis公司的“Event 176”抗蟲玉米中的CryIA(b)基因；存在于基因改造的抗蟲馬鈴薯中的CryIIIA基因；存在于基因改造的月桂酸含量增高的油菜中的ACP基因；存在于基因改造的耐貯存的番茄中的CaMV 35S-反義PG基因結(jié)構(gòu)；存在于基因改造的抗病毒的煙草中的CaMV 35S-TMV CP基因結(jié)構(gòu)；設(shè)立一系列的對照基因，包括針對所有農(nóng)作物的DNA降解對照，例如來源于植物的葉綠體特異性基因UAA，針對基因改造大豆的大豆特異基因Lectin基因，針對基因改造玉米的玉米特異基因Zein和Invertase基因；(二)鑒定檢測體系的可靠性和靈敏度選定混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，作為標(biāo)準(zhǔn)來鑒定基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品檢測體系的可靠性和靈敏度；按照前面所述的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取方法，分別提取它們的DNA，然后對各個(gè)檢測標(biāo)記和對照基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立用重蒸水代替DNA模板的空白對照；只有當(dāng)檢測結(jié)果如下時(shí)，才能證明檢測體系的可靠性，同時(shí)可以確定檢測體系的靈敏度以重蒸水代替DNA模板的空白對照，不能擴(kuò)增出任何檢測標(biāo)記和對照基因片段；“Roundup Ready”0％的大豆，可以擴(kuò)增出植物通有的UAA基因和大豆特異的Lectin基因片段；“Event 176”0％的玉米，可以擴(kuò)增出植物通有的UAA基因和玉米特異的Zein或Invertase基因片段(Zein和Invertase，可以二者任選其一)；如果“Roundup Ready”0.1％和以上的大豆，可以擴(kuò)增出大豆特異的Lectin基因、CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)片段(EPSPS和CaMV 35S-CTP，可以二者任選其一)，則此時(shí)檢測體系的靈敏度為0.1％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.1％的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品；若無法從“Roundup Ready”0.1％的大豆中擴(kuò)增出CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)片段，而可以從“RoundupReady”0.5％和以上的大豆中擴(kuò)增出這些基因片段，則檢測的靈敏度為0.5％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.5％的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品；依此類推；如果“Event 176”0.1％和以上的玉米，可以擴(kuò)增出玉米特異的Zein或Invertase基因、CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子、CryIA(b)基因片段，則此時(shí)檢測體系的靈敏度為0.1％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.1％的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品；若無法從“Event 176”0.1％的玉米中擴(kuò)增出CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子、CryIA(b)基因片段，而可以從“Event 176”0.5％和以上的玉米中擴(kuò)增出這些基因片段，則此時(shí)檢測體系的靈敏度為0.5％，即該檢測體系最低可以檢測出基因改造成分含量為0.5％的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品；依此類推；(三)確定PCR引物和限制性內(nèi)切酶所擴(kuò)增的檢測標(biāo)記和對照基因片段應(yīng)控制在200堿基對(bp)以內(nèi)，且該片段內(nèi)最好含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；PCR引物的長度應(yīng)控制在18-30bp之間，GC含量應(yīng)控制在30-50％之間；我們選定符合以上條件的PCR引物的位置范圍和限制性內(nèi)切酶如下表基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測PCR引物位置范圍和限制性內(nèi)切酶列表(表一)
(表一)(四)確定PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系如下PCR buffer 1×MgCl22.1mMdNTPS0.2mMTaq DNA polymerase 0.5UPfu DNA polymerase 0.5UPrimer 0.5μMDNA template100ng重蒸水 補(bǔ)至20μl(五)確定PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)條件如下預(yù)變性 94℃ 2分鐘變性94℃ 40秒復(fù)性50-62℃ 40秒延伸72℃ 40秒40個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物在3％瓊脂糖膠上、110V恒壓下電泳30分鐘，在紫外燈下檢測電泳結(jié)果；第三步、利用酶切技術(shù)對所擴(kuò)增的基因改造成分進(jìn)行鑒定采用合適的、可以避免所擴(kuò)增的基因改造成分(即PCR產(chǎn)物)假陽性情況的限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，只有通過酶切得到相應(yīng)的基因片段，才能證實(shí)PCR產(chǎn)物的正確性；對于擴(kuò)增片段過短，而無法通過酶切鑒定的，可以通過雜交或測序進(jìn)行PCR產(chǎn)物的鑒定；酶切體系如下PCR產(chǎn)物15μl限制性內(nèi)切酶buffer 2μl重蒸水 2μl限制性內(nèi)切酶 1μl(10U)總反應(yīng)體系 20μl在37℃保溫3個(gè)小時(shí)，然后在3％瓊脂糖膠上、110V恒壓下電泳30分鐘，在紫外燈下檢測電泳結(jié)果；第四步、對檢測結(jié)果進(jìn)行解釋在檢測體系的可靠性得到確認(rèn)以后，對基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的檢測結(jié)果解釋如下如果得到相應(yīng)的Lectin基因片段，則證明該樣品中含有大豆成分；如果得到相應(yīng)的Zein或Invertase基因片段，則證明該樣品中含有玉米成分；如果得到相應(yīng)的CaMV 35S啟動(dòng)子、Nos終止子和NPTII基因片段中的一個(gè)或幾個(gè)，則證明該樣品中含有基因改造成分；如果得到相應(yīng)的EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)片段，則證明該樣品含有基因改造成分，且為EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因結(jié)構(gòu)；如果得到相應(yīng)的CryIA(b)基因片段，則證明該樣品含有基因改造成分，且為CryIA(b)基因；如果僅得到相應(yīng)的UAA基因片段，則證明該樣品不含有基因改造成分；如果沒有得到任何相應(yīng)的片段，則證明從該樣品提取的DNA中含有PCR反應(yīng)的抑制成分，所提取的DNA需要進(jìn)一步純化。
2.如權(quán)利要求1所述的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測方法，其特征在于PCR引物序列和限制性內(nèi)切酶如下表基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測最佳PCR引物和限制性內(nèi)切酶列表(表二)
(表二)
3.一種實(shí)施如權(quán)利要求1或2所述的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測方法的試劑盒，其特征在于試劑盒由如下試劑構(gòu)成提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％SDS，pH8.0)；樹脂；過濾柱(column)；清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；PCR緩沖液；MgCl2；dNTPS；Taq DNA polymerase；Pfu DNA polymerase；用于擴(kuò)增出基因改造成分的PCR引物，為表一或表二中的PCR引物的全部或部分組合；用于酶切鑒定PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶，為表一或表二中的限制性內(nèi)切酶的全部或部分組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定性檢測方法和試劑盒,屬分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域。具體的是從基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中提取脫氧核糖核酸(DNA),應(yīng)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和限制性內(nèi)切酶(R.E.)分析技術(shù)(酶切技術(shù))對基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中的基因改造成分(genetically modified organisms,GMOs)進(jìn)行定性檢測的方法和試劑盒。采用本發(fā)明的方法和試劑盒,可以方便準(zhǔn)確地判定一種農(nóng)作物或其加工產(chǎn)品是否含有基因改造成分。
文檔編號C12Q1/68GK1370842SQ0110421
公開日2002年9月25日 申請日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月26日
發(fā)明者安利忻 申請人:安利忻