專利名稱：二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的測(cè)定方法及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域內(nèi)對(duì)二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的檢測(cè)，尤其涉及利用酶比色法及酶(偶)聯(lián)法測(cè)定二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的方法，以及由此制得的二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，屬于二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血清中的二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶，主要在肝臟表達(dá)，其作用是水解組織中磷酸酯。血清中的二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶與人體中的高、低密度脂蛋白代謝有關(guān)。二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶可以保護(hù)低密度脂蛋白，避免氧化修飾，所以，可以認(rèn)為，二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶是一種具有抗動(dòng)脈粥樣硬化以及抗炎作用的酶。血漿二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性的增加，使血漿中抗氧化修飾型低密度脂蛋白的自身抗體水平降低18.8％，而高密度脂蛋白上二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性的增加，使高密度脂蛋白水平升高9.1％。
吸煙者體內(nèi)的二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶的活性濃度較之非吸煙者或戒煙者的活性濃度低，因而抗氧化作用也隨之降低，導(dǎo)致血管中產(chǎn)生較多膽固醇沉積，而多余的膽固醇可以導(dǎo)致血管堵塞，最終導(dǎo)致心臟病或中風(fēng)發(fā)生。除吸煙之外，糖尿病和衰老也與二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶水平降低有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)測(cè)定二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的方法，采用以下步驟進(jìn)行首先，將測(cè)定的樣品與含有苯乙酸酯、醛脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，
然后，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。
上述利用利用酶比色法及酶(偶)聯(lián)法測(cè)定二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的方法中，所述還原型輔酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一種。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩沖液20～500mmol/L，穩(wěn)定劑5～100g/ml，還原型輔酶0.1～0.35mmol/L，醛脫氫酶 1000～80000U/L，苯乙酸酯 1～50mmol/L。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將以上單劑中的各種成分進(jìn)行組合配制成雙劑，比如

雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分還原型輔酶、苯乙酸酯，可以放在試劑II；試劑II中的醛脫氫酶也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將試劑配成如下三試劑

與雙劑類似，三劑的配方也不僅僅限于上述配方，其中試劑I中的還原型輔酶可以放在試劑II或試劑III中，試劑II中的苯乙酸酯可以放在試劑I或試劑III中，試劑III中的醛脫氫酶也可以放到試劑I或者試劑II中，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II、三劑的試劑I/試劑II/試劑III當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，活性濃度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v范圍之內(nèi)。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一種。
研究表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的診斷/檢測(cè)試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液100mmol/L，穩(wěn)定劑2mol/L，還原型輔酶0.25mmol/L，醛脫氫酶 8000U/L，苯乙酸酯 16mmol/L。
本發(fā)明利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶比色法及酶(偶)聯(lián)法測(cè)定二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確；(2)參與反應(yīng)的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試過(guò)程精確度高；(3)該方法簡(jiǎn)便、易操作，可快速得到檢測(cè)結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會(huì)污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀上便可快速檢測(cè)，不需要特殊或額外儀器，測(cè)試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測(cè)定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑等多種形式的試劑，用于測(cè)定各種樣品中二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的大小；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷/檢測(cè)試劑盒，穩(wěn)定性好，很好地保證了應(yīng)用測(cè)試效果。配成雙劑或者三劑以后，能夠進(jìn)一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測(cè)結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明一種二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的測(cè)定方法及二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，利用二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶(Paraoxonase；EC 3.1.1.2)酶(偶)聯(lián)醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.4；EC 1.2.1.5)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶酶解苯乙酸酯反應(yīng)產(chǎn)生乙酸，再通過(guò)(偶)聯(lián)合醛脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。
實(shí)施例一(單劑)按以下成分和用量配制二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，硫酸銨 80g/ml，NADH 0.25mmol/L，醛脫氫酶 8000U/L，苯乙酸酯 16mmol/L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶樣品與試劑的體積比為1∶25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。
實(shí)施例二(雙劑)按以下成分和用量配制二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 2mol/L，thio-NADH0.25mmol/L，
苯乙酸酯 12mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，丙二醇 50％v/v，醛脫氫酶 12000U/L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶樣品與試劑I、試劑II的體積比為2∶20∶5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值-2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。
實(shí)施例三(三劑)按以下成分和用量配制二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，硫酸銨 80g/ml，NADPH0.25mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，乙二醇 2mol/L，
苯乙酸酯 20mmol/L；試劑III——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 50％v/v，醛脫氫酶 6000U/L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶樣品與試劑I、試劑II、試劑III的體積比例為4∶40∶5∶5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值-2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的測(cè)定方法，包括以下步驟①將測(cè)定的樣品與含有苯乙酸酯、醛脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，②將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。
2.二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液 20～500mmol/L，穩(wěn)定劑 0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，還原型輔酶 0.1～0.35mmol/L，醛脫氫酶1000～80000U/L，苯乙酸酯1～50mmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為硫酸銨、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一種。
5.權(quán)利要求2～4中任意一種二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或者三劑。
6.權(quán)利要求2～4中任意一種二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒為干粉試劑盒或液體試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶活性濃度的測(cè)定方法及二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，利用二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶酶(偶)聯(lián)醛脫氫酶酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法，二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶酶解苯乙酸酯反應(yīng)產(chǎn)生乙酸，再通過(guò)(偶)聯(lián)合醛脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶氧化成為輔酶，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，測(cè)算二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。該方法測(cè)試結(jié)果精確、準(zhǔn)確性好。試劑盒成分包括緩沖液、還原型輔酶、苯乙酸酯、醛脫氫酶及穩(wěn)定劑；將診斷試劑盒制成雙劑或三劑可減少各成分的交叉影響，本發(fā)明完全可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1975383SQ20061016122
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司