專利名稱：篩選改良載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與提高逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝效能的方法有關(guān)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生遠(yuǎn)非高效。一般地，因?yàn)槠渌念w粒不攜帶病毒基因組，在逆轉(zhuǎn)錄病毒原液中不到10％的病毒顆粒是具有感染性的。在野生型病毒中，gag/gag-pol基因產(chǎn)物是由全長(zhǎng)RNA轉(zhuǎn)錄本翻譯的，后者也是包裝的。不良包裝效能的一個(gè)假說在于包裝和翻譯過程之間的競(jìng)爭(zhēng)(Sonstegard和Hackett1996)。這是由于包裝信號(hào)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)過近所致。該gag蛋白質(zhì)與包裝信號(hào)的結(jié)合阻礙核糖體的結(jié)合并且抑制其本身的翻譯過程。在進(jìn)化過程中，未選擇更強(qiáng)的包裝信號(hào)是因?yàn)樗鼘⑴c該gag蛋白質(zhì)更加牢固的結(jié)合并且限制其產(chǎn)生。
但是，在制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的過程中，將gag/gag-pol和基因組成成分分離到不同的表達(dá)盒中(Soneoka等人，1995)。包裝和翻譯過程因此得以分開。這樣，形成具有高度包裝效能的病毒基因組而不危及gag/gag-pol的產(chǎn)生在理論上是可行的。
早先試圖通過復(fù)制活性病毒的連續(xù)傳代(Taplitz和Coffin，1997)或通過體外篩選過程(Allen等人，1996；Berglund等人，1997)來獲取改良新型逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。病毒的連續(xù)傳代需要很長(zhǎng)時(shí)間。至于體外篩選，有很多需要優(yōu)化的參數(shù)。包括需要進(jìn)行誘變和篩選的條件。而且，其經(jīng)常依賴于隨機(jī)突變文庫的大小，后者又反過來依賴于該誘變DNA的成功克隆。
并且，這些早先制備新型逆轉(zhuǎn)錄病毒序列的試圖，沒有一個(gè)致力于提高逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝效能以超過其自然效能。
發(fā)明簡(jiǎn)述在調(diào)查病毒成分的化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)制備逆轉(zhuǎn)錄病毒的影響時(shí)，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以制備如下的病毒原液，其中基本上所有的顆粒都是感染性的，這是通過確保它們都注滿有基因組RNA實(shí)現(xiàn)的。我們的結(jié)果表明這可以通過應(yīng)用與env和基因組相比較低比例的gag/gag-pol構(gòu)建體來實(shí)現(xiàn)。
因此，本發(fā)明提供提高逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝效能的方法，方法包括在生產(chǎn)細(xì)胞中至少表達(dá)編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒gag-pol多肽的第一核苷酸序列、編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒被膜多肽的第二核苷酸序列和編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的第三核苷酸序列，其中第一核苷酸序列與第二和第三核苷酸序列的比例為x∶y∶z，其中x小于1，并且y和z為1。換句話說，第一核苷酸序列與第二和第三核苷酸序列的比例小于1∶1∶1。
編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒gag-pol多肽的第一核苷酸序列與第二和第三核苷酸序列的比例優(yōu)選小于0.8∶1∶1或0.5∶1∶1，更優(yōu)選小于0.2∶1∶1。
感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的數(shù)目與所制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?？倲?shù)目的比例優(yōu)選大于15％，更優(yōu)選大于25％或50％。
本發(fā)明也提供含有逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的組合物，逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒依據(jù)本發(fā)明上述方法制備，并提供生產(chǎn)細(xì)胞，該生產(chǎn)細(xì)胞具有增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝效能，因?yàn)榕cenv和基因組相比，其表達(dá)較低比例的gag/gag-pol構(gòu)建體。
其他增加感染性顆粒的方法是通過修飾包裝信號(hào)改良該基因組的包裝效能。但是到目前為止，識(shí)別自然發(fā)生病毒包裝信號(hào)并將其摻入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中(Adam和Miller，1988)僅僅是嘗試而已。這些載體的包裝效能充其量只能達(dá)到野生型的水平。
因此我們提出篩選具有改良包裝效能的載體基因組的體內(nèi)策略，使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在序列中導(dǎo)入隨機(jī)突變的Epicurian coli誘變株和哺乳動(dòng)物細(xì)胞間穿梭，其中篩選用以尋找更佳的包裝效能(圖2)。
增加包裝效能使病毒原液含有更多感染性顆粒。這達(dá)到高終點(diǎn)滴度，而且，也提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效能，因?yàn)閷⒎催^來阻礙感染性顆粒與靶細(xì)胞受體的結(jié)合的缺陷顆粒變得更少。
我們所述的體內(nèi)篩選方法快速易行。僅從哺乳動(dòng)物和細(xì)菌細(xì)胞中提取和導(dǎo)入DNA。這些是非常成熟和優(yōu)化的過程。
相應(yīng)地，本發(fā)明也提供篩選具有改良包裝效能的改良逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的方法，包括(a)向含有包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)隨機(jī)突變；(b)向表達(dá)包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組所需多肽的宿主細(xì)胞導(dǎo)入該誘變的逆轉(zhuǎn)錄基因組；(c)與含有非-突變包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組相比，檢測(cè)在該細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝效能是否得以改良；(d)篩選具有改良包裝效能的病毒基因組。
該方法優(yōu)選包括附加步驟(e)，測(cè)定所有或部分病毒基因組序列以識(shí)別該包裝信號(hào)的序列。
步驟(a)優(yōu)選在將隨機(jī)突變導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的細(xì)菌株中進(jìn)行。特別優(yōu)選的細(xì)菌株是Epicurian coli誘變株。
步驟(b)和(c)中優(yōu)選的宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。尤其優(yōu)選的實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞至少含有(i)編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒gag-pol多肽的第一核苷酸序列；(ii)編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒被膜多肽的第二核苷酸序列；和(iii)編碼含有非-突變包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的第三核苷酸，其中第三核苷酸作為缺少可選擇標(biāo)記的核酸載體部分；該誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組作為含有可選擇標(biāo)記的核酸載體部分；含有第三核苷酸的載體與含有該誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的載體的比例大于2∶1，優(yōu)選大于5∶1。
該包裝效能，表示為感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒數(shù)目與所制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒總數(shù)目的比例，優(yōu)選大于25％，更優(yōu)選大于50％。應(yīng)用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可測(cè)定在病毒原液中感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的數(shù)目(即滴度)。通過例如逆轉(zhuǎn)錄測(cè)定可檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的總數(shù)目。
本發(fā)明還提供通過本發(fā)明篩選方法獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組具有包裝效能，該效能表示為感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒數(shù)目與所制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?？倲?shù)目的比例，優(yōu)選大于25％，更優(yōu)選大于50％。
可以從該改良的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中或其測(cè)定的并用來合成包裝信號(hào)的序列中，克隆該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包裝信號(hào)，用以制備改良的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。因此本發(fā)明也提供逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)，用本發(fā)明方法篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可獲取該包裝信號(hào)。
本發(fā)明還提供非-自然發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄包裝信號(hào)，當(dāng)作為部分逆轉(zhuǎn)錄病毒組測(cè)定時(shí)，具有至少15％包裝效能，優(yōu)選至少20、25、35或50％。
另外，本發(fā)明還提供含有本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)的核酸以及含有本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。該病毒載體可以是慢病毒載體。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)細(xì)胞，該細(xì)胞含有本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明還提供含有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的組合物，其是根據(jù)本發(fā)明方法和/或應(yīng)用通過本發(fā)明方法獲取的改良的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組產(chǎn)生的。例如，可以將這樣的成分用于治療中。發(fā)明詳述盡管大體上此處所提到的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，需具體參見Sambrook等人，分子克隆(Moleucular Cloning)實(shí)驗(yàn)室操作指南(A Laboratory Manual)(1989)和Ausubel等人，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(Current Protocols in Moleucular Biology)(1995)John Wiley和Sons，Inc。逆轉(zhuǎn)錄病毒可以從任何適宜的逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生或衍化依據(jù)本發(fā)明方法用以制備誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒。大量不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒已得以識(shí)別。例如鼠白血病病毒(MLV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒、人類T-細(xì)胞白血病病毒(HTLV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、小鼠乳癌病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、Fujnami肉瘤病毒(FuSV)、莫羅尼鼠類白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫羅尼鼠類肉瘤病毒(Mo-MLV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓細(xì)胞增多癥病毒-29(MC29)和禽有核紅細(xì)胞增多癥病毒(AEV)。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細(xì)列表可見Coffin等人，1997，“逆轉(zhuǎn)錄病毒”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社JM Coffin、SM Hughes、HE Varmus pp 758-763。
本領(lǐng)域可見關(guān)于一些逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)的詳細(xì)情況。例如，可從NCBI Genbank(分別為基因組登記號(hào)AF033819和AF033811)發(fā)現(xiàn)關(guān)于HIV和Mo-MLV的詳細(xì)情況。
甚至可將慢病毒組分為“靈長(zhǎng)類”和“非-靈長(zhǎng)類”。靈長(zhǎng)類慢病毒的例子有人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類自身免疫缺陷綜合征(AIDS)病原體和猿猴免疫缺陷病毒。非-靈長(zhǎng)類慢病毒組包括原型“慢病毒”腦膜炎/呼吸困難病毒(VMV)和相關(guān)山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)和最近描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒家族和其他類型逆轉(zhuǎn)錄病毒的差別是慢病毒具有感染分裂和非-分裂細(xì)胞的能力(Lewis等人，1992 EMBO.J 113053-3058；Lewis和Emerman 1994病毒學(xué)雜志68510-516)。相比之下，其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如MLV，不能感染例如那些組成肌肉、腦、肺和肝組織的非-分裂細(xì)胞。
本發(fā)明方法優(yōu)化的優(yōu)選載體是重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，尤其是重組慢病毒載體，具體地是最小慢病毒載體，與其相關(guān)教導(dǎo)見WO99/32646和WO98/17815。
逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)是5’LTR和3’LTR，在其之間或之中存在包裝該基因組的包裝信號(hào)、引物結(jié)合位點(diǎn)、使整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中的整合位點(diǎn)以及編碼包裝成分的gag、pol和env基因，該成分是組裝病毒顆粒所需的多肽。更復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有其它特點(diǎn)，例如，HIV中的rev和RRE序列，使從感染的靶細(xì)胞的核向細(xì)胞漿中高效輸出該整合的前病毒的RNA轉(zhuǎn)錄體成為可能。
在前病毒中，在這些基因的兩端側(cè)有稱為長(zhǎng)末端重復(fù)(LTRs)的區(qū)域。該LTRs與前病毒整合及轉(zhuǎn)錄有關(guān)。LTRs也作為增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列并能控制病毒基因的表達(dá)。由于在病毒基因組5’端的psi序列，該逆轉(zhuǎn)錄病毒發(fā)生殼體化。
該LTRs本身是可以分為三個(gè)元件的相同序列，稱為U3、R和U5。U3來自RNA 3’端的獨(dú)有序列。R是來自該RNA兩端的重復(fù)序列，而U5是來自該RNA 5’端獨(dú)有序列。在不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒中，該三元件的大小可以是非常不同的。
在缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組中，gag、pol和env可以是缺失的或是無功能的。在RNA兩端的R區(qū)域是重復(fù)序列。U5和U3分別代表該RNA 5’和3’端的獨(dú)有序列。
在一般用于基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒中，從該病毒中切除至少部分一個(gè)或多個(gè)復(fù)制必需的gag、pol和env蛋白質(zhì)編碼區(qū)域。這將使該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生復(fù)制缺陷。甚至可以用目的核苷酸序列(NOI)來代替該切除部分，例如編碼治療產(chǎn)物的核苷酸序列，以產(chǎn)生能向宿主中整合其基因組的病毒，但是由于缺乏結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)該修飾病毒基因組不能使自己擴(kuò)增。當(dāng)將其整合于宿主基因組中時(shí)，該NOI表達(dá)，導(dǎo)致例如治療和/或診斷效應(yīng)。因此一般通過向重組病毒載體中整合該NOI；將該修飾的病毒載體包裝進(jìn)病毒體被膜中并進(jìn)行例如靶細(xì)胞或靶細(xì)胞群等目的位點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)來完成NOI向目的位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移。
因此，本發(fā)明所用的最小逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括(5’)R-U5-一個(gè)或多個(gè)第一核苷酸序列-U3-R(3’)。但是，在宿主細(xì)胞/包裝細(xì)胞中用于制備該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的質(zhì)粒載體也將包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，其可操作性地與逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組相連以指導(dǎo)該基因在宿主細(xì)胞/包裝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。這些調(diào)節(jié)基因可以是與該轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，即5’U3區(qū)相關(guān)的自然序列，或者它們可能是不同種類的啟動(dòng)子，如其它病毒啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子的異種啟動(dòng)子。
一些逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組需要高效制備病毒的附加序列。例如，就HIV而言，優(yōu)選含有rev和RRE序列。但是優(yōu)化密碼子能減少或排除對(duì)rev和RRE的需求。
優(yōu)化密碼子增加密碼子的應(yīng)用。例如，病毒成分編碼序列的改變可增進(jìn)該序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其它細(xì)胞中密碼子的應(yīng)用，這些細(xì)胞作為制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞。包括HIV和其它慢病毒在內(nèi)的許多病毒，應(yīng)用大量稀有密碼子，將其改變使之與普遍應(yīng)用的哺乳動(dòng)物密碼子相符，可以完成該包裝成分在生產(chǎn)細(xì)胞中的高表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞和一些其它生物體的密碼子的用法表是本領(lǐng)域已知的。
應(yīng)用優(yōu)化密碼子gag和優(yōu)化密碼子pol或優(yōu)化密碼子env可制備該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
輔助基因編碼多種輔助蛋白質(zhì)，后者能夠?qū)δ孓D(zhuǎn)錄病毒復(fù)制和感染性的多個(gè)方面進(jìn)行調(diào)節(jié)。在Coffin等人，第6、7章中有關(guān)于這些蛋白質(zhì)的討論。慢病毒載體中輔助蛋白質(zhì)，例如包括但不限于tat、rev、nef、vpr、vpu、vif、vpx。本發(fā)明所用的慢病毒載體的一個(gè)實(shí)例就是只保留rev而去除所有的輔助基因。
一旦將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組整合入其靶細(xì)胞基因組作為前病毒DNA，就需要表達(dá)該目的核苷酸序列。逆轉(zhuǎn)錄病毒中，啟動(dòng)子位于該前病毒的5’LTR U3區(qū)域。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，驅(qū)動(dòng)治療基因表達(dá)的啟動(dòng)子可以是5’U3區(qū)域的天然逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子，或者是導(dǎo)入載體內(nèi)的可選擇啟動(dòng)子?？蛇x擇啟動(dòng)子可物理性替代逆轉(zhuǎn)錄病毒天然5’U3啟動(dòng)子，或者可以摻入載體基因組如LTRs之間的不同位置。
這樣，也將NOI可操作地與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列相連使NOI在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中該控制序列一般是有活性的。例如該控制序列可以是如天然病毒啟動(dòng)子或CMV啟動(dòng)子的病毒啟動(dòng)子或者可以是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。特別優(yōu)選應(yīng)用優(yōu)先在具體細(xì)胞類型或組織類型中有活性的啟動(dòng)子，待治療的病毒最初感染該細(xì)胞。因此在一實(shí)施方案中可應(yīng)用組織-特異性調(diào)節(jié)序列。驅(qū)動(dòng)一個(gè)或多個(gè)第一核苷酸序列表達(dá)的調(diào)控序列可以是結(jié)構(gòu)性或調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。其他特別優(yōu)選的調(diào)節(jié)構(gòu)建體有如WO99/15684中所述的低氧反應(yīng)性元件，其內(nèi)容在此引用供作參考。
一般通過將包裝或輔助細(xì)胞系與重組載體相結(jié)合來增殖復(fù)制-缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如制備適宜滴度的隨后用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。也就是說，以反式可提供此三種包裝蛋白質(zhì)。生產(chǎn)細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞含有產(chǎn)生感染性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒所需的所有元件。這些元件可以永久地穩(wěn)定存在于細(xì)胞中(如整合于細(xì)胞基因組中或以附加體的形式存在)和/或例如通過轉(zhuǎn)染臨時(shí)提供。
相比之下，包裝細(xì)胞表達(dá)一個(gè)或多個(gè)包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA所需的病毒成分，但是缺少psi區(qū)。包裝細(xì)胞系一般組成逆轉(zhuǎn)錄病毒gag、pol和env基因中的一個(gè)或多個(gè)基因。因此，該包裝細(xì)胞系產(chǎn)生包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA所需的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，但是由于缺少psi區(qū)，其不能產(chǎn)生包殼作用。但是當(dāng)向該包裝細(xì)胞系導(dǎo)入攜帶含有psi區(qū)和一般一個(gè)興趣核苷酸序列(NOI)的缺陷病毒基因組的重組載體時(shí)，該輔助蛋白質(zhì)能包裝此psi-陽性重組載體以制備重組病毒原液。此病毒原液可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞而將NOI導(dǎo)入靶細(xì)胞的基因組中。因?yàn)槠湟驯憩F(xiàn)出能增加病毒滴度的能力，所以優(yōu)選應(yīng)用psi包裝信號(hào)，稱為psi+，范圍為從拼接供體上游到GAG起始密碼子下游的附加序列。
該重組病毒的基因組缺少制造病毒蛋白質(zhì)所需的所有基因，只能轉(zhuǎn)導(dǎo)一次且不能增殖。將這些僅能進(jìn)行一次靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒載體稱為復(fù)制缺陷載體。這樣，將NOI導(dǎo)入該宿主/靶細(xì)胞基因組中但不產(chǎn)生具有潛在有害性的逆轉(zhuǎn)錄病毒。關(guān)于可提供的包裝系統(tǒng)的總結(jié)見Coffin等人，1997。
用單獨(dú)表達(dá)質(zhì)粒攜帶gag、pol和env病毒編碼區(qū)，并將其獨(dú)立地轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，優(yōu)選應(yīng)用該包裝細(xì)胞系。該策略有時(shí)稱為三質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄方法(Soneoka等人，1995)，可以減少產(chǎn)生復(fù)制-活性病毒的可能性，因?yàn)楫a(chǎn)生野生型病毒需要三次重組事件。因?yàn)橥纯纱蟠蟠龠M(jìn)重組，也能應(yīng)用減少或排除該基因組載體和輔助者之間的同源性的方法來減少產(chǎn)生復(fù)制活性輔助病毒的問題。
可應(yīng)用暫時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞代替穩(wěn)定轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系。當(dāng)發(fā)展載體時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可有助于測(cè)定載體制備水平。在此方面，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染避免了用于如生成穩(wěn)定載體生產(chǎn)細(xì)胞系時(shí)的較長(zhǎng)時(shí)間，并且也可以在該載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝成分對(duì)細(xì)胞有毒性時(shí)應(yīng)用它。產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一般所用的成分包括編碼gag/pol蛋白質(zhì)的質(zhì)粒、編碼env蛋白質(zhì)的質(zhì)粒及含有NOI的質(zhì)粒。制備載體包括將一個(gè)或多個(gè)此成分瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入含有其它所需成分的細(xì)胞中。如果載體編碼有毒基因或干擾宿主細(xì)胞復(fù)制的基因，如細(xì)胞循環(huán)抑制劑或誘導(dǎo)凋亡基因，產(chǎn)生穩(wěn)定載體-制備細(xì)胞系是困難的，但是在細(xì)胞死亡之前可應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染制備該載體，應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而生成的細(xì)胞系產(chǎn)生的載體滴度水平與在穩(wěn)定-制備細(xì)胞系中獲得的水平相當(dāng)。
通過向包裝細(xì)胞導(dǎo)入制備任何感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒所需的殘留病毒成分而產(chǎn)生的包裝細(xì)胞能制備生產(chǎn)細(xì)胞或者通過向非-包裝細(xì)胞例如293T細(xì)胞導(dǎo)入感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒制備所需的所有成分來制備之。
產(chǎn)生細(xì)胞/包裝細(xì)胞可以是任何適宜的細(xì)胞類型。一般應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但也不排除其它細(xì)胞例如昆蟲細(xì)胞。顯然該生產(chǎn)細(xì)胞將需要能夠高效翻譯env和gag、pol mRNA。許多適宜的產(chǎn)生/包裝細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的。技術(shù)人員也能通過例如向細(xì)胞系中穩(wěn)定導(dǎo)入編碼包裝成分的核苷酸構(gòu)建體的方法夠制造適宜的包裝細(xì)胞系。
在試驗(yàn)性和實(shí)際應(yīng)用中，使用高滴度的病毒制劑是非常理想的。增加病毒滴度的技術(shù)包括應(yīng)用上述PSI+包裝信號(hào)和濃縮病毒原液。此外，不同被膜蛋白質(zhì)，例如皰疹性-口腔炎病毒G蛋白質(zhì)的應(yīng)用已將病毒滴度提高至濃度109/ml。但是，一般情況下將選擇包裝蛋白質(zhì)使病毒顆粒優(yōu)先感染該病毒感染的細(xì)胞，該病毒是治療所需的。例如將HIV載體用于治療HIV感染，所用的env蛋白質(zhì)將為HIV env蛋白質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄基因組的誘變最近多關(guān)注于體外進(jìn)化。其包括在篩選過程之后將隨機(jī)突變導(dǎo)入DNA序列，從而產(chǎn)生具有改良或新型功能的基因(Joyce，1992)。該技術(shù)的加強(qiáng)在于此事實(shí)，即為提高對(duì)其進(jìn)行改變或改良毋需知道基因是如何行使功能的。所有必需的是在DNA序列中高頻產(chǎn)生隨機(jī)突變和篩選預(yù)期改變的過程。有幾個(gè)產(chǎn)生隨機(jī)突變的方法。包括錯(cuò)誤傾向PCR(Beaudry和Joyce，1992)，DNA重排(Stemmer，1994)及最近Epicurian coli誘變株的轉(zhuǎn)換(Bornscheuer等人，1998)。本領(lǐng)域中還已知用于產(chǎn)生突變的其它技術(shù)(如應(yīng)用離子放射或化學(xué)誘變劑)。在本發(fā)明內(nèi)容中提出應(yīng)用誘變菌株如Epicurian coli誘變株在逆轉(zhuǎn)錄病毒中導(dǎo)入突變。
一般情況下，該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組表現(xiàn)為部分核酸載體。其中誘變?cè)谒拗骷?xì)胞中發(fā)生，在體內(nèi)，選擇與宿主細(xì)胞相容的核酸載體。特別優(yōu)選應(yīng)用穿梭載體，即能在超過一種類型的宿主(如細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中擴(kuò)增的載體。這將使誘變發(fā)生在如菌株中，然后應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提取和純化該誘變載體，在導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞之前無需任何克隆。
因此第一階段是將該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組進(jìn)行誘變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這通過將逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化進(jìn)Epicurian Coli細(xì)胞中如XL1-Red(Stratagene)來實(shí)現(xiàn)。然后應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如大規(guī)模質(zhì)粒分離方法提取生成的突變體。篩選一般情況下，將誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組合并物導(dǎo)入能夠包裝該基因組的宿主細(xì)胞中(見上面包裝細(xì)胞和生產(chǎn)細(xì)胞的詳述)。通過共轉(zhuǎn)染該宿主細(xì)胞來建立包裝競(jìng)爭(zhēng)，該宿主細(xì)胞具有表現(xiàn)為部分載體的非-誘變逆轉(zhuǎn)錄基因組，該載體缺少適宜用于宿主細(xì)胞中的可選擇的標(biāo)記。相比之下，該誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組表現(xiàn)為含有可選擇性標(biāo)記的部分載體。優(yōu)選地，非誘變基因組的量至少為兩倍，更優(yōu)選地，至少5倍誘變基因組的量。
然后將宿主細(xì)胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒用于轉(zhuǎn)導(dǎo)更多的細(xì)胞，例如COS細(xì)胞。任何產(chǎn)生的新霉素-抗性細(xì)胞含有誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，該基因組將比野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組更有效的包裝。通過這些細(xì)胞產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒可試驗(yàn)用于測(cè)定其上述包裝效能。
可分離篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒克隆并將其用于其它誘變/篩選步驟。也可分離篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒克隆并且確定其核苷酸序列以建立可以提高包裝效能的具體突變或變異。一般情況下，這些將在該包裝信號(hào)序列中。
該改良的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可用作構(gòu)建改良逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基礎(chǔ)，例如用于向病人導(dǎo)入治療基因。具體的，可將該修飾序列克隆進(jìn)現(xiàn)有的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。應(yīng)用本發(fā)明方法的應(yīng)用可以生產(chǎn)含有較現(xiàn)有技術(shù)更高比例的感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的組合物。
該感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?？珊幸粋€(gè)或多個(gè)編碼治療產(chǎn)物的編碼序列。治療產(chǎn)物包括，但不限于細(xì)胞因子、激素、抗體、免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)、酶、免疫共-刺激分子、反義RNA、靶蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)陰性突變體、毒素、條件毒素、抗原、單鏈抗體、腫瘤抑制蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)因子。當(dāng)其包括在內(nèi)時(shí)，將此編碼序列操作性地與適宜的啟動(dòng)子連接。
優(yōu)選病毒顆粒與藥用可接受載體或稀釋劑結(jié)合來產(chǎn)生藥用組合物。這樣，本發(fā)明還提供治療個(gè)體的藥用組合物，其中該組合物含有治療有效劑量的本發(fā)明的病毒顆粒，及藥用可接受的載體、稀釋液、賦形劑或佐劑。該藥用組合物可用于人或動(dòng)物。
考慮到預(yù)想的給藥途徑或標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐，可以進(jìn)行藥用載體、賦形劑或稀釋劑的選擇。適宜的載體和稀釋劑包括等滲鹽水，如磷酸鹽-緩沖鹽水。該藥用組合物可含有-或除了-載體、賦形劑或稀釋液任何的粘合劑、滑潤(rùn)劑、懸浮劑、包衣材料、增溶劑和其它可幫助或增加病毒進(jìn)入該靶點(diǎn)(如脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng))的載體試劑。
藥物組合物可以配制成供腸道外、肌肉、靜脈、顱內(nèi)、皮下、眼內(nèi)或透皮給藥。
合適的情況下，藥物組合物可以通過如下一種或多種方式給藥吸入、以栓劑或陰道藥栓形式給藥、局部以洗劑、溶液、乳油、軟膏或粉劑的形式通過皮膚給藥、以含有賦形劑如淀粉或乳糖藥片的形式口服、或放于膠囊或珠或單獨(dú)或與賦形劑混合、或以含有調(diào)味品或著色劑的丹藥、溶液或懸浮液的形式、或能將其胃腸外注射，例如鼻腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下給藥。就胃腸外給藥而言，該成分最好以無菌水溶液的形式應(yīng)用，其可以含有其它物質(zhì)，例如足夠的鹽或單糖，使該溶液與血液等滲。就口腔或舌下給藥而言，可以以藥片或錠劑的形式給藥，它們能以傳統(tǒng)的方式配制。
病毒給予的劑量一般在103到1010pfu的范圍內(nèi)，優(yōu)選105到108pfu，更優(yōu)選106到107pfu。當(dāng)注射給藥時(shí)，一般給予1-10μl藥用可接受的適宜載體或稀釋液中的病毒。
其中該治療序列在可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)序列控制之下，治療過程中只要求誘導(dǎo)基因表達(dá)即可。一旦該疾病經(jīng)過治療，去除該誘導(dǎo)物NOI的表達(dá)將停止。這將具有明顯臨床優(yōu)勢(shì)。該系統(tǒng)可以，例如給予抗生素四環(huán)素，通過其對(duì)tet阻遏物/VP16融合蛋白質(zhì)的影響來激活基因表達(dá)。
將在下面實(shí)施例中進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明加以描述，目的是只將其作為示例而不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例參照以下附圖。


圖1-病毒滴度及編碼病毒成分DNA量的圖解圖2-對(duì)從不同劑量的三種成分中制備的病毒原液的逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定。
印跡1，0.1μg的所有三種質(zhì)粒；2，1μg pHIT60、0.1μg pHIT111和pHIT456；3，1μg pHIT111、0.1μg pHIT60和pHIT456；4，1μgpHIT456、0.1μg pHIT60和pHIT111；5，1μg三種質(zhì)粒；6，0.1μgpHIT60、1μg pHIT111和pHIT456。盡管其逆轉(zhuǎn)錄酶活性較低，樣本6與樣本5滴度相似。
圖3-體內(nèi)篩選具有較高包裝性能的載體。
圖4-穿梭載體pMEL的示意圖。
圖5-檢測(cè)穿梭載體方案的圖示。
首先，我們檢測(cè)三種病毒成分均不飽和的情況。
圖1所示的結(jié)果表明因?yàn)樵?.1μg的每一質(zhì)粒中該病毒成分都不飽和，0.1μg將是適宜的起始點(diǎn)，可以從此點(diǎn)開始提高每一成分的量。
與其他兩個(gè)相比，升高一種質(zhì)粒的劑量，然后檢測(cè)病毒滴度，并比較在應(yīng)用等量的三種質(zhì)粒時(shí)所產(chǎn)生的病毒的滴度。
通過對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞的X-gal染色法來測(cè)定感染性顆粒的數(shù)目，而病毒顆粒的總數(shù)目則通過逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定法來檢測(cè)。
表1所示的結(jié)果表明基因組是有限的并基因組滴度增加10倍。也發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用等量的三種成分相比，應(yīng)用1/10 gag/gag-pol成分可生成相似的滴度(表1)。但是與后者相比，前一病毒原液含有較低的逆轉(zhuǎn)錄酶活性(圖2中5和6泳道)，表明應(yīng)用較少gag/gag-pol所產(chǎn)生的該病毒原液含有較大的感染性-顆粒和總-顆粒的比值。該結(jié)果表明通過確保使顆粒裝滿基因組RNA，產(chǎn)生所有顆粒均有感染性顆粒的病毒原液是可能的。
表1.每一成分對(duì)病毒滴度的影響。
a在6cm盤中應(yīng)用FuGene6轉(zhuǎn)染試劑(Boehringer Mannheim)用不同劑量質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。
b通過X-gal染色法觀察，以1acZ形成單位(l.f.u.)/ml數(shù)值形式測(cè)定病毒滴度。實(shí)施例2-篩選具有改良包裝效能的載體基因組的體內(nèi)方案。
我們也提出篩選具有改良包裝效能的載體基因組的體內(nèi)方案，使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在Epicurian coli誘變株中穿梭，其中在其序列中導(dǎo)入隨機(jī)突變，并且篩選哺乳動(dòng)物細(xì)胞以產(chǎn)生更佳的包裝效能(圖3)。通過對(duì)含有現(xiàn)存包裝信號(hào)的載體包裝的競(jìng)爭(zhēng)影響篩選。
通過將細(xì)菌ColE1復(fù)制起始點(diǎn)克隆進(jìn)pLXSN多克隆位點(diǎn)構(gòu)建穿梭逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。通過用來自pEGFPN1的Sfi I-RsrII片段代替SfiI-RsrII片段，將細(xì)菌啟動(dòng)子插入新霉素抗性基因的上游(Clontech)，以產(chǎn)生在細(xì)菌中具有卡那霉素抗性的載體。在卡那霉素的篩選下，能在E.coli細(xì)胞中復(fù)制該產(chǎn)生的載體。當(dāng)將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入表達(dá)SV40大-T抗原的細(xì)胞時(shí)，在新霉素的篩選下，其以染色體外形式復(fù)制。將含有載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞-E.coli-LTR稱為pMEL(圖4)，其具有以下特點(diǎn)(1)卡那霉素/新霉素抗性在E.coli中可以用卡那霉素選擇，在真核細(xì)胞中用G418選擇。(2)ColE1復(fù)制起始點(diǎn)允許在E.coli中高拷貝數(shù)量復(fù)制。(3)SV40復(fù)制起始點(diǎn)允許在表達(dá)SV40大T抗原的真核細(xì)胞，例如COS7細(xì)胞中以染色體外形式復(fù)制。
將pMEL轉(zhuǎn)化入Epicurian Coli XL1-Red細(xì)胞(stratagene)中以在其序列中導(dǎo)入隨機(jī)突變。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)大規(guī)模質(zhì)粒分離方法來提取該突變體合并物。
通過用等量gag-pol表達(dá)質(zhì)粒、env表達(dá)質(zhì)粒、Neo-負(fù)pMEL和1/10誘變的pMEL共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞建立包裝競(jìng)爭(zhēng)。將包裝的載體基因組用于轉(zhuǎn)導(dǎo)COS細(xì)胞。然后將其從新霉素抗性細(xì)胞中分離并用于轉(zhuǎn)化XL1-Red細(xì)胞。為獲得具有較高包裝效能的載體基因組將該過程重復(fù)。
表2
apLXSN衍生載體，其含有CD8標(biāo)記代替新霉素抗性基因。
b大小與pLXSCD8相似的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。
該穿梭載體第一輪篩選結(jié)果見上表2。
觀察到在pLXSCD8存在的情況下滴度的降低，這樣成功地建立pMEL對(duì)包裝的競(jìng)爭(zhēng)。更高效地包裝從該篩選和競(jìng)爭(zhēng)過程中出現(xiàn)的載體基因組。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA過程來生產(chǎn)產(chǎn)生較高滴度的載體系統(tǒng)，能將該新的高效包裝位點(diǎn)導(dǎo)入任何相同病毒起源的載體基因組中。
上述說明中提到的所有出版物在此引用供作參考。在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的多種改進(jìn)和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。盡管應(yīng)用具體優(yōu)選的實(shí)施方案來闡述本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍不限于這些具體的實(shí)施方案。實(shí)際上，所附權(quán)利要求書意在包括對(duì)分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的實(shí)施本發(fā)明方式的各種改進(jìn)。
參考文獻(xiàn)Adam，M.A.and A.D.Miller(1998)“足以使非逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA包裝入病毒體的鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒中的信號(hào)的鑒別”病毒學(xué)雜志(JVirol)62(10)3802-6.
Allen，P.，B.Collins，D.Brown，Z.Hostomsky and L.Gold(1996).“通過HIV-1核殼體蛋白(NCp7)介導(dǎo)高親和力結(jié)合的一特殊RNA結(jié)構(gòu)基序”病毒學(xué)(Virology)225306-315.
Beaudry，A.A.andG.F.Joyce(1992).“RNA酶的定向進(jìn)化”科學(xué)(Science)257635-641.
Berglund，J.A.，B.charpentier and m.rosbash(1997)“HIV-核衣殼蛋白高度親和力結(jié)合位點(diǎn)”核酸研究(Nucl eic acidresearch)25(5)1042-1049.
Bornscheuer，U.T.，M.M.Enzelberger，J.Alterbuchner andH.H.MEYER(1998).“應(yīng)用XL1-Red突變株產(chǎn)生質(zhì)粒變異體”策略(Strategies)11(1)16-17.
Cepko，C.L.，B.E.Roberts and R.C.Mulligan.(1984).Cell.37(3)1053-62.
Coffin et al“Retroviruses”1997Cold Spring HarbourLaboratory Press EdsJM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp758-763.
Joyces，G.F.(1992).”定向分子進(jìn)化”科學(xué)美國人(ScientificAmerican)December48-55.
Miller，A.D.(1997).逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體的發(fā)展和應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviruses).J.M.Coffin，S.H.Hughes and H.E.Varmus，ColdHarbor Press437-473.
Soneoka Y，P.M.Cannon，E.E.Ramsdale，J.C.Griffiths.Romano，S.M.Kingsman和A.J.Kingsman(1995).“制備高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的瞬時(shí)三-質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)”核酸研究23(4)628-33Sonstegard T S和P B.Hackett(1996)“勞氏肉瘤病毒Pr76gagRNA翻譯和包裝的自身調(diào)節(jié)”病毒學(xué)雜志.706642-6652.
Stemmer，W.P.C.(1994).“通過體內(nèi)DNA穿梭形成的蛋白質(zhì)的快速進(jìn)化”自然(Nature)370389-391.
TAPLITZ，R.A.和J.M.COFFIN(1997).“具有擴(kuò)大受體應(yīng)用范圍的禽逆轉(zhuǎn)錄病毒突變的篩選”病毒學(xué)雜志71(10)7814-9。
權(quán)利要求
1.篩選具有改良包裝效能的改良逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的方法，該方法包括(a)向含有包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)隨機(jī)突變；(b)向表達(dá)包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組所需多肽的宿主細(xì)胞導(dǎo)入該誘變的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組；(c)與含有非-突變包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組相比，測(cè)定在該細(xì)胞中的包裝效能是否得以改良；(d)篩選具有改良包裝效能的病毒基因組。
2.權(quán)利要求1的方法，其中附加步驟(e)是測(cè)定該病毒基因組的所有或部分序列以識(shí)別包裝信號(hào)序列。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟(a)在細(xì)菌株中進(jìn)行，該細(xì)菌株將隨機(jī)突變導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中。
4.權(quán)利要求3的方法，其中該細(xì)菌株為Epicurian coli的誘變株。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中宿主細(xì)胞至少含有(i)編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒gag-pol多肽的第一核苷酸序列；(ii)編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒被膜多肽的第二核苷酸序列；和(iii)編碼含有非-突變包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的第三核苷酸，其中第三核苷酸作為缺少可選擇標(biāo)記的部分核酸載體；該誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組作為含有可選擇標(biāo)記的部分核酸載體；含有第三核苷酸的載體與含有該誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的載體的比例大于2∶1，優(yōu)選大于5∶1。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中該包裝效能，表示為感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒數(shù)目與所產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒總數(shù)目的比值，該值大于25％。
8.應(yīng)用前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法獲取的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。
9.權(quán)利要求8的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，具有包裝效能，表示為感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒數(shù)目與所產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒總數(shù)目的比值，此值大于25％。
10.從權(quán)利要求8或9的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)。
11.含有權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)的核酸。
12.含有權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
13.權(quán)利要求12的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其用于制備感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
14.權(quán)利要求12或13的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其是慢病毒載體。
15.含有權(quán)利要求8或9的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組、權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)或權(quán)利要求12、13或14的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)細(xì)胞。
16.提高逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝效能的方法，其包括在生產(chǎn)細(xì)胞中至少表達(dá)編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒gag-pol多肽的第一核苷酸序列、編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒被膜多肽的第二核苷酸序列和編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的第三核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列的比例及第一和第三核苷酸序列的比例分別是x∶y和x∶z，其中x小于1，y和z為1。
17.權(quán)利要求16的方法，其中x小于0.5。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中包裝效能，表示為感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒數(shù)目與所產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒總數(shù)目的比值，此值大于25％。
19.含有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的組合物，這些顆粒是根據(jù)權(quán)利要求16到18任一項(xiàng)的方法制備的。
20.權(quán)利要求19的組合物，其用于治療。
21.至少表達(dá)編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒gag-pol多肽的第一核苷酸序列、編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒被膜多肽的第二核苷酸序列和編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的第三核苷酸的生產(chǎn)細(xì)胞，其中第一和第二核苷酸序列的比例及第一和第三核苷酸序列的比例分別是x∶y和x∶z，其中x小于1，y和z為1。
全文摘要
提供篩選具有改良包裝效能的改良逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的方法,該方法包括(a)向含有包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)隨機(jī)突變;(b)向表達(dá)包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組所需多肽的宿主細(xì)胞導(dǎo)入該誘變的逆轉(zhuǎn)錄基因組;(c)與含有非－突變包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組相比,測(cè)定在該細(xì)胞中的包裝效能是否得以改良;(d)篩選具有改良包裝效能的病毒基因組。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1353764SQ00807880
公開日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2000年5月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月21日
發(fā)明者A·J·金斯曼, J·斯林斯比, M·雅普 申請(qǐng)人:牛津生物醫(yī)學(xué)(英國)有限公司