專利名稱：人長壽保障蛋白和編碼序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人長壽保障蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備方法。
人體及哺乳動物細胞的分裂次數(shù)是固定的。每分裂一次，其子代細胞分裂次數(shù)的潛能減少一次。經(jīng)一定次數(shù)的分裂，細胞不再能分裂而進入老化與凋亡。一般都認為人體除睪丸精原細胞外，很少有例外。但腫瘤細胞有2/3的細胞株，可不受以上機制約束，而具有無限次分裂的潛能，說明了腫瘤細胞持續(xù)分裂可能的機制。目前普遍的認識是正常細胞的分裂次數(shù)，與細胞染色體的端粒長度有關(guān)，每分裂一次，端粒長度減短一次，一定次數(shù)分裂后當(dāng)端?？s短到一定長度時，細胞即停止分裂。但腫瘤細胞或生殖系細胞則具有端粒酶(Telomerase)可在每次分裂后修補其端粒，從而保持其長度。所以，目前認為，哺乳動物細胞必須依賴于端粒酶才能保持細胞的永生化。
然而，酵母細胞的永生化則另有它獨特的機制。酵母細胞的分裂，作為個別細胞來說，也有恒定的分裂次數(shù)，但它的子細胞卻仍保持了親代細胞的分裂次數(shù)的潛能。因此，作為一個群體，酵母細胞是永生化的。這種機制并不依賴于端粒的長度(D′mello N.P.and Jazwinski S.M，J.Bacteriol.1737609-7613，1991)。酵母中存在長壽保障基因Lag1Sc為控制與保證酵母細胞分裂次數(shù)傳代后仍得以保證恒定有關(guān)(D′mello N.P.，Childress D.S.，F(xiàn)ranklin S.P et al，J.Biol.Chem，26915451-15459，1994)。
1998年，Jiang等人從人體細胞基因文庫中分離出與酵母Lag1有一定同源的人的相關(guān)基因Lag1Hs(Jiang J.C.Kirchman P.A.Zagulski M等，Genome Res.8(12)1259-1272，1998。GenBank nos，AF 105005-AF 105009).Lag1Hs在功能上可挽救具有Lag1Δ/Lac1Δ雙缺陷區(qū)酵母細胞株的死亡，恢復(fù)其分裂的能力。上述作者發(fā)現(xiàn)該基因在人腦、肌組織中表達，認為以上基因可能與人的神經(jīng)退行病變有關(guān)。
因此，為治療目的研究和開發(fā)人長壽保障基因和蛋白有重要意義。
癌癥是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預(yù)防腫瘤，目前人們已越來越關(guān)注腫瘤的基因治療。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)研究具有抑癌作用的蛋白及其激動劑/抑制劑。
本發(fā)明的目的是提供一類新的長壽保障蛋白多肽以及其片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的長壽保障蛋白被命名為LAG1 Hs2蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的長壽保障蛋白多肽，它包含具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼上述的長壽保障蛋白多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼的多肽具有SEQ ID NO2氨基酸序列。更佳地，該多核苷酸的序列選自下組SEQ ID NO3的編碼區(qū)序列或全長序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人長壽保障蛋白活性的多肽的制備方法，該方法包含(a)在適合表達長壽保障蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人長壽保障蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的長壽保障蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-800個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的長壽保障蛋白多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療癌癥以及細胞異常增殖等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
在附圖中，


圖1是Lag1Sc、Lag1Ce1、lag1 Hs1、和本發(fā)明的長壽保障蛋白Lag1 Hs2四種蛋白的Lag1基序比較圖。
圖2顯示了Lag1 Hs2的表達譜。
圖3顯示了大腸桿菌T7 S30體外翻譯系統(tǒng)表達Lag1 Hs2的凝膠電泳圖。其中，泳道1為空白對照；泳道2為PinPointTM對照DNA(編碼CAT融合蛋白，約39kDa)；泳道3為pT7X-LAG 1 Hs2(約27kDa)；泳道4為pT7Zza-LAG 1 Hs2(Zza+Sp260融合蛋白，約41kDa)；本發(fā)明采用大規(guī)模cDNA克隆轉(zhuǎn)染癌細胞，在獲得具有抑癌作用的基礎(chǔ)上，經(jīng)測序證明為新的基因，進一步得到全長cDNA克隆。DNA轉(zhuǎn)染試驗證明，本發(fā)明的人長壽保障蛋白(LAG1 Hs2)對癌細胞(肝癌細胞)具有抑制克隆形成的作用。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的LAG1 Hs2蛋白或多肽”是指LAG1 Hs2多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化LAG1 Hs2蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。LAG1 Hs2多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人LAG1 Hs2蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人LAG1 Hs2蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人LAG1 Hs2多肽”指具有人LAG1 Hs2蛋白活性的SEQID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人LAG1 Hs2蛋白相同功能的、SEQ IDNO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人LAG1 Hs2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人LAG1 Hs2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人LAG1 Hs2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人LAG1 Hs2多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人LAG1 Hs2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人LAG1 Hs2多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人LAG1 Hs2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人LAG1Hs2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人LAG1 Hs2蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼人長壽保障蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的DNA序列能用幾種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離DNA。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源性核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。
編碼人長壽保障蛋白的特異DNA片段序列產(chǎn)生也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所需多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。當(dāng)需要的多肽產(chǎn)物的整個氨基酸序列已知時，DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。如果所需的氨基酸的整個序列不清楚時，DNA序列的直接化學(xué)合成是不可能的，選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時，即使極少的表達產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因的功能出現(xiàn)或喪失；(3)測定人長壽保障蛋白的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學(xué)技術(shù)或測定生物學(xué)活性，來檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2kb之內(nèi)，較佳地為1kb之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因DNA序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當(dāng)然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測人長壽保障蛋白基因表達的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的核苷酸序列的測定可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)。這類核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復(fù)進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或人長壽保障蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的人長壽保障蛋白多肽(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人長壽保障蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人長壽保障蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人長壽保障蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可包被于細胞內(nèi)、細胞外或在細胞膜上表達或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人長壽保障蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療人長壽保障蛋白功能低下或喪失所致的疾病(尤其是用于抑制腫瘤生長)，和用于篩選促進或?qū)谷碎L壽保障蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。例如，抗體可用于激活或抑制人長壽保障蛋白的功能。用表達的重組人長壽保障蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人長壽保障蛋白功能的多肽分子。
本發(fā)明也提供了篩選藥物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)人長壽保障蛋白的藥劑的方法。激動劑提高人長壽保障蛋白刺激細胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細胞過度增殖有關(guān)的紊亂如各種癌癥。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細胞或表達人長壽保障蛋白的膜制劑與標記的人長壽保障蛋白一起培養(yǎng)。然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
人長壽保障蛋白的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。人長壽保障蛋白的拮抗劑可以與人長壽保障蛋白結(jié)合并消除其功能，或是抑制人長壽保障蛋白的產(chǎn)生，或是與多肽的活性位點結(jié)合使多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能。人長壽保障蛋白的拮抗劑可用于治療用途。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將人長壽保障蛋白加入生物分析測定中，通過測定化合物影響人長壽保障蛋白和其受體之間的相互作用來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，各種惡性腫瘤、和細胞異常增殖等。
本發(fā)明的多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞可以用來作為抗原以生產(chǎn)抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。多克隆抗體可以通過將此多肽直接注射動物的方法得到。制備單克隆抗體的技術(shù)包括雜交瘤技術(shù)，三瘤技術(shù)，人B-細胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。
可以將本發(fā)明的多肽和拮抗劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機構(gòu)許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。人長壽保障蛋白以有效地治療和/或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來給藥。施用于患者的人長壽保障蛋白的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
人長壽保障蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于人長壽保障蛋白的無表達或異常/無活性的人長壽保障蛋白的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達變異的人長壽保障蛋白，以抑制內(nèi)源性的人長壽保障蛋白活性。例如，一種變異的人長壽保障蛋白可以是縮短的、缺失了信號傳導(dǎo)功能域的人長壽保障蛋白，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏信號傳導(dǎo)活性。因此重組的基因治療載體可用于治療人長壽保障蛋白表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將人長壽保障蛋白基因轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶人長壽保障蛋白基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人長壽保障蛋白基因可包裝到脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。
抑制人長壽保障蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細胞中，再將細胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學(xué)或酶進行特異性切割，并進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析。
本發(fā)明還提供了針對人長壽保障蛋白抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。
抗人長壽保障蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標本中的人長壽保障蛋白。
與人長壽保障蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人長壽保障蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人長壽保障蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人長壽保障蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人長壽保障蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人長壽保障蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
人長壽保障蛋白單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產(chǎn)抗人長壽保障蛋白的單鏈抗體。
能與人長壽保障蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人長壽保障蛋白分子進行標記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人長壽保障蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人長壽保障蛋白水平，可以用作解釋人長壽保障蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷人長壽保障蛋白起作用的疾病。
人長壽保障蛋白的多聚核苷酸可用于人長壽保障蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，人長壽保障蛋白的多聚核苷酸可用于檢測人長壽保障蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下人長壽保障蛋白的異常表達。如人長壽保障蛋白DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷人長壽保障蛋白的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用人長壽保障蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測人長壽保障蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測人長壽保障蛋白基因的突變也可用于診斷人長壽保障蛋白相關(guān)的疾病。人長壽保障蛋白突變的形式包括與正常野生型人長壽保障蛋白DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點?，F(xiàn)在，只有很少的基于實際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標記物可用于標記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細胞會產(chǎn)生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現(xiàn)亞定位?？捎糜谌旧w定位的其它類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預(yù)篩選和雜交預(yù)選，從而構(gòu)建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術(shù)的綜述，參見Verma等，Human Chromosomesa Manualof Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接著，需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變，而該突變在任何正常個體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結(jié)構(gòu)的變化，如從染色體水平可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據(jù)目前的物理作圖和基因定位技術(shù)的分辨能力，被精確定位至與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對應(yīng)于一個基因)。
本發(fā)明的人長壽保障蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
在本發(fā)明的一個實施例中，從人肝臟cDNA文庫中分離出一個與酵母Lag1在氨基酸序列具有44％(83/183)同源的克隆，定名為LAG1 Hs2。與Jiang等報導(dǎo)的人相關(guān)基因LAG1 Hs在氨基酸具有46％(89/191)同源，但同樣具有人與酵母共有的Lag1P基序。因此，從生物信息學(xué)可以判定新發(fā)現(xiàn)的LAG1 Hs2是一個新的與酵母LAG1人體同源基因(命名為“人長壽保障基因”)。在功能上，發(fā)現(xiàn)LAG1 Hs2可在體外抑制人肝癌細胞生長，并在裸鼠體內(nèi)同樣對癌的生長有一定抑制作用。此外，Northern雜交證明，本發(fā)明的LAG1 Hs2基因在人腎、肝組織有mRNA高水平表達；在腦、心、胎盤、肺組織中低水平表達；肌肉、結(jié)腸、胸腺、脾、小腸、外周血白細胞中不表達。原位雜交結(jié)果還顯示，與肝癌組織相比較，正常肝的表達水平高于癌旁肝組織，癌旁肝組織高于肝癌的表達，證明人肝癌中存在該基因的表達下調(diào)。
鑒于LAG1 Hs2具有抑制癌細胞生長的作用。因此，它不僅有調(diào)控細胞分裂的作用，而且具有對惡性腫瘤治療與診斷的應(yīng)用價值。此外，由于本發(fā)明的人長壽保障蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族蛋白相比，預(yù)計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1LAG1 Hs2 cDNA克隆的分離及對人肝癌細胞的生長抑制從GIBC0 BRL公司購得人肝cDNA文庫(目錄號.10422-012)，第一輪隨機挑取cDNA克隆，其后以高豐度cDNA克隆和已證明有抑癌細胞生長功能的cDNA克隆為探針，雜交篩選cDNA文庫，挑取弱陽性及陰性克隆。用Qiagen 96孔板質(zhì)粒抽提試劑盒，按廠家說明書進行質(zhì)粒DNA的提取。質(zhì)粒DNA和空載體同時轉(zhuǎn)染肝癌細胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后，加6μl H2O溶解，待轉(zhuǎn)染。每份DNA樣品中加0.74μl脂質(zhì)體及9.3μl無血清培液，混勻后，室溫放置10分鐘。每管中加150μl無血清培液，均分加入3孔生長于96孔板的7721細胞中，37℃放置2小時，每孔再加50μl無血清培液，37℃24小時。每孔換100μl全培液，37℃24小時，換含G418的全培液100μl，37℃24-48小時，邊觀察，邊換G418濃度不等的培液。約2-3次后，直到鏡檢細胞有克隆形成，計數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP260 cDNA克隆有抑制克隆形成的功能(空載體克隆形成數(shù)為38、40、42，SP260 cDNA克隆為1，7，17)。
對cDNA克隆SP260采用雙脫氧終止法，在ABI377 DNA自動測序儀上測定其一端近500bp的核苷酸序列。分析后，確定為新基因克隆進行另一端測序，仍未獲得全長cDNA序列，設(shè)計引物，再次進行測序，直到獲得全長序列。
對SP260 cDNA克隆序列分析后發(fā)現(xiàn)基因尚不完整，采用Clontech公司SMARTRACE cDNA擴增試劑盒(Cat.No.K1811-1)，基因特異引物為5′GGAAGGGGGAAGAGGCCAGAGAAAG 3′和5′TCCCAGTACAGCCCCCACTTTTTG 3′，按說明書進行操作，獲得全長克隆，命名為LAG 1 Hs2。
實施例2LAG1 Hs2 cDNA的序列分析實施例1獲得的cDNA全長為2007核苷酸，含閱讀框架690(第415-1105位)個核苷酸，編碼一個由230個氨基酸(不包括終止密碼子)組成的蛋白。
A核苷酸序列(SEQ ID NO1)長度2007bp1 CTAGAATTCA GCGGCCGCTG AATTCTAGAA GCCGATCTAG AAGACCGAGA51 TGGACGTGTC TACGCCAAAG CCTCAGATCT CTATATCACG CTGCCCCTGG101 CCTTGCTCTT CCTCATCGTT CGATACTTCT TTGAGCTGTA CGTGGCTACA151 CCACTGGCTG CCCTCTTGAA CATAAAGGAG AAAACTCGGC TGCGGGCACC201 TCCCAACGCC ACCTTGGAAC ATTTCTACCT GACCAGTGGC AAGCAGCCCA251 AGCAGGTGGA AGTAGAGCTT TTGTCCCGGC AGAGCGGGCT CTCTGGCCGC301 CAGGTAGAGC GTTGGTTCCG TCGCCGCCGC AACCAGGACC GGCCCAGTCT351 CCTCAAGAAG TTCCGAGAAG CCAGCTGGAG ATTCACATTT TACCTGATTG401 CCTTCATTGC CGGCATGGCC GTCATTGTGG ATAAACCCTG GTTCTATGAC451 ATGAAGAAAG TTTGGGAGGG ATATCCCATA CAGAGCACTA TCCCTTCCCA501 GTATTGGTAC TACATGATTG AACTTTCCTT CTACTGGTCC CTGCTCTTCA551 GCATTGCCTC TGATGTCAAG CGAAAGGATT TCAAGGAACA GATCATCCAC601 CATGTGGCCA CCATCATTCT CATCAGCTTT TCCTGGTTTG CCAATTACAT651 CCGAGCTGGG ACTCTAATCA TGGCTCTGCA TGACTCTTCC GATTACCTGC701 TGGAGTCAGC CAAGATGTTT AACTACGCGG GATGGAAGAA CACCTGCAAC751 AACATCTTCA TCGTCTTCGC CATTGTTTTT ATCATCACCC GACTGGTCAT801 CCTGCCCTTC TGGATCCTGC ATTGCACCCT GGTGTACCCA CTGGAGCTCT851 ATCCTGCCTT CTTTGGCTAT TACTTCTTCA ATTCCATGAT GGGAGTTCTA901 CAGCTGCTGC ATATCTTCTG GGCCTACCTC ATTTTGCGCA TGGCCCACAA951 GTTCATAACT GGAAAGCTGG TAGAAGATGA ACGCAGTGAC CGGGAAGAAA1001 CAGAGAGCTC AGAGGGGGAG GAGGCTGCAG CTGGGGGAGG AGCAAAGAGC1051 CGGCCCCTAG CCAATGGCCA CCCCATCCTC AATAACAACC ATCGTAAGAA1101 TGACTGAACC ATTATTCCAG CTGCCTCCCA GATTAATGCA TAAAGCCAAG1151 GAACTACCCT GCTCCCTGCG CTATAGGGTC ACTTTAAGCT CTGGGGAAAA1201 AGGAGAAAGT GAGAGGAGAG TTCTCTGCAT CCTCCCTCCT TGCTTGTCAC1251 CCAGTTGCCT TTAAACCAAA TTCTAACCAG CCTATCCCCA GGTAGGGGGG1301 ACGTTGGTTA TATTCTGTTA GAGGGGGACG GTCGTATTTT CCTCCCTACC1351 CGCCAAGTCA TCCTTTCTAC TGCTTTTGAG GCCCTCCCTC AGCTCTCTGT1401 GGGTAGGGGT TACAATTCGC ATTCCTTATT CTGAGAATTT GGCCCCAGCT1451 GTTTGCCTTT GACTCCCTGA CCTCCAGAGC CAGGGTTGTG CCTTATTGTC1501 CCATCTGTGG GCCTCATTCT GCCAAAGCTG GACCAAGGCT AACCTTTCTA1551 AGCTCCCTAA CTTGGGCCAG AAACCAAAGC TGAGCTTTTA ACTTTCTCCC1601 TCTATGACAC AAATGAATTG AGGGTAGGAG GAGGGTGCAC ATAACCCTTA1651 CCCTACCTCT GCCAAAAAGT GGGGGCTGTA CTGGGGACTG CTCGGATGAT1701 CTTTCTTAGT GCTACTTCTT TCAGCTGTCC CTGTAGCGAC AGGTCTAAGA1751 TCTGACTGCC TCCTTTCTCT GGCCTCTTCC CCCTTCCCTC TTCTCTTCAG1801 CTAGGCTAGC TGGTTTGGAG TAGAATGGCA ACTAATTCTA ATTTTTATTT1851 ATTAAATATT TGGGGTTTTG GTTTTAAAGC CAGAATTACG GCTAGCACCT1901 AGCATTTCAG CAGAGGGACC ATTTTAGACC AAAATGTACT GTTAATGGGT1951 TTTTTTTTAA AATTAAAAGA TTAAATAAAA AATATTAAAT AAAAAAAAAA2001 AAAAAAAB氨基酸序列(SEQ ID NO2)長度230個氨基酸1 MAVIVDKPWF YDMKKVWEGY PIQSTIPSQY WYYMIELSFY WSLLFSIASD51 VKRKDFKEQI IHHVATIILI SFSWFANYIR AGTLIMALHD SSDYLLESAK101 MFNYAGWKNT CNNIFIVFAI VFIITRLVIL PFWILHCTLV YPLELYPAFF151 GYYFFNSMMG VLQLLHIFWA YLILRMAHKF ITGKLVEDER SDREETESSE201 GEEAAAGGGA KSRPLANGHP ILNNNHRKNDC克隆名稱LAG 1 Hs 2(SEQ ID NO3)起始編碼子415 ATG 終止編碼子1107 TGA蛋白質(zhì)分子量26912.781 CTA GAA TTC AGC GGC CGC TGA ATT CTA GAA GCC GAT CTA GAA GAC CGA 4849 GAT GGA CGT GTC TAC GCC AAA GCC TCA GAT CTC TAT ATC ACG CTG CCC 9697 CTG GCC TTG CTC TTC CTC ATC GTT CGA TAC TTC TTT GAG CTG TAC GTG 144145 GCT ACA CCA CTG GCT GCC CTC TTG AAC ATA AAG GAG AAA ACT CGG CTG 192193 CGG GCA CCT CCC AAC GCC ACC TTG GAA CAT TTC TAC CTG ACC AGT GGC 240241 AAG CAG CCC AAG CAG GTG GAA GTA GAG CTT TTG TCC CGG CAG AGC GGG 288289 CTC TCT GGC CGC CAG GTA GAG CGT TGG TTC CGT CGC CGC CGC AAC CAG 336337 GAC CGG CCC AGT CTC CTC AAG AAG TTC CGA GAA GCC AGC TGG AGA TTC 384385 ACA TTT TAC CTG ATT GCC TTC ATT GCC GGC ATG GCC GTC ATT GTG GAT 4321 Met Ala Val Ile Val Asp 6433 AAA CCC TGG TTC TAT GAC ATG AAG AAA GTT TGG GAG GGA TAT CCC ATA 4807 Lys Pro Trp Phe Tyr Asp Met Lys Lys Val Trp Glu Gly Tyr Pro Ile 22481 CAG AGC ACT ATC CCT TCC CAG TAT TGG TAC TAC ATG ATT GAA CTT TCC 52823 Gln Ser Thr Ile Pro Ser Gln Tyr Trp Tyr Tyr Met Ile Glu Leu Ser 38529 TTC TAC TGG TCC CTG CTC TTC AGC ATT GCC TCT GAT GTC AAG CGA AAG 57639 Phe Tyr Trp Ser Leu Leu Phe Ser Ile Ala Ser Asp Val Lys Arg Lys 54577 GAT TTC AAG GAA CAG ATC ATC CAC CAT GTG GCC ACC ATC ATT CTC ATC 62455 Asp Phe Lys Glu Gln Ile Ile His His Val Ala Thr Ile Ile Leu Ile 70625 AGC TTT TCC TGG TTT GCC AAT TAC ATC CGA GCT GGG ACT CTA ATC ATG 67271 Ser Phe Ser Trp Phe Ala Asn Tyr Ile Arg Ala Gly Thr Leu Ile Met 86673 GCT CTG CAT GAC TCT TCC GAT TAC CTG CTG GAG TCA GCC AAG ATG TTT 72087 Ala Leu His Asp Ser Ser Asp Tyr Leu Leu Glu Ser Ala Lys Met Phe 102721 AAC TAC GCG GGA TGG AAG AAC ACC TGC AAC AAC ATC TTC ATC GTC TTC 768103 Asn Tyr Ala Gly Trp Lys Asn Thr Cys Asn Asn Ile Phe Ile Val Phe 118769 GCC ATT GTT TTT ATC ATC ACC CGA CTG GTC ATC CTG CCC TTC TGG ATC 816119 Ala Ile Val Phe Ile Ile Thr Arg Leu Val Ile Leu Pro Phe Trp Ile 134817 CTG CAT TGC ACC CTG GTG TAC CCA CTG GAG CTC TAT CCT GCC TTC TTT 864135 Leu His Cys Thr Leu Val Tyr Pro Leu Glu Leu Tyr Pro Ala Phe Phe 150865 GGC TAT TAC TTC TTC AAT TCC ATG ATG GGA GTT CTA CAG CTG CTG CAT 912151 Gly Tyr Tyr Phe Phe Asn Ser Met Met Gly Val Leu Gln Leu Leu His 166913 ATC TTC TGG GCC TAC CTC ATT TTG CGC ATG GCC CAC AAG TTC ATA ACT 960167 Ile Phe Trp Ala Tyr Leu Ile Leu Arg Met Ala His Lys Phe Ile Thr 182961 GGA AAG CTG GTA GAA GAT GAA CGC AGT GAC CGG GAA GAA ACA GAG AGC1008183 Gly Lys Leu Val Glu Asp Glu Arg Ser Asp Arg Glu Glu Thr Glu Ser 1981009 TCA GAG GGG GAG GAG GCT GCA GCT GGG GGA GGA GCA AAG AGC CGG CCC1056199 Ser Glu Gly Glu Glu Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ala Lys Ser Arg Pro 2141057 CTA GCC AAT GGC CAC CCC ATC CTC AAT AAC AAC CAT CGT AAG AAT GAC1104215 Leu Ala Asn Gly His Pro Ile Leu Ash Ash Asn His Arg Lys Asn Asp 2301105 TGA ACC ATT ATT CCA GCT GCC TCC CAG ATT AAT GCA TAA AGC CAA GGA1152231 *** 2311153 ACT ACC CTG CTC CCT GCG CTA TAG GGT CAC TTT AAG CTC TGG GGA AAA12001201 AGG AGA AAG TGA GAG GAG AGT TCT CTG CAT CCT CCC TCC TTG CTT GTC12481249 ACC CAG TTG CCT TTA AAC CAA ATT CTA ACC AGC CTA TCC CCA GGT AGG12961297 GGG GAC GTT GGT TAT ATT CTG TTA GAG GGG GAC GGT CGT ATT TTC CTC13441345 CCT ACC CGC CAA GTC ATC CTT TCT ACT GCT TTT GAG GCC CTC CCT CAG13921393 CTC TCT GTG GGT AGG GGT TAC AAT TCG CAT TCC TTA TTC TGA GAA TTT14401441 GGC CCC AGC TGT TTG CCT TTG ACT CCC TGA CCT CCA GAG CCA GGG TTG14881489 TGC CTT ATT GTC CCA TCT GTG GGC CTC ATT CTG CCA AAG CTG GAC CAA15361537 GGC TAA CCT TTC TAA GCT CCC TAA CTT GGG CCA GAA ACC AAA GCT GAG15841585 CTT TTA ACT TTC TCC CTC TAT GAC ACA AAT GAA TTG AGG GTA GGA GGA16321633 GGG TGC ACA TAA CCC TTA CCC TAC CTC TGC CAA AAA GTG GGG GCT GTA16801681 CTG GGG ACT GCT CGG ATG ATC TTT CTT AGT GCT ACT TCT TTC AGC TGT17281729 CCC TGT AGC GAC AGG TCT AAG ATC TGA CTG CCT CCT TTC TCT GGC CTC17761777 TTC CCC CTT CCC TCT TCT CTT CAG CTA GGC TAG CTG GTT TGG AGT AGA18241825 ATG GCA ACT AAT TCT AAT TTT TAT TTA TTA AAT ATT TGG GGT TTT GGT18721873 TTT AAA GCC AGA ATT ACG GCT AGC ACC TAG CAT TTC AGC AGA GGG ACC19201921 ATT TTA GAC CAA AAT GTA CTG TTA ATG GGT TTT TTT TTA AAA TTA AAA19681969 GAT TAA ATA AAA AAT ATT AAA TAA AAA AAA AAA AAA AAA2007D.同源比較本發(fā)明的LAG1 Hs2 cDNA克隆，含全長cDNA序列。它與酵母的LAG1的氨基酸相同性(Identity)22％(42/185)，相似性(Positiveness)為43％(82/185)。與已報導(dǎo)的人LAG1 Hs I相同性為28％(54/191)，相似性為46％(89/191)。(1)LAG1Hs 2的氨基酸序列與酵母、C.Elegans相關(guān)基因的同源性比較Query＝LAG I Hs2 Sbjct＝LAG1Ce-1(C.Elegans)＞LAG1Ce-1長度＝368分值＝134 bits(334)，預(yù)計值＝2e-36相同性＝71/194(36％)，相似性＝104/194(53％)，缺口＝14/194(7％)Query 3 VIVDKPWFYDMKKVWEGYPIQSTIPSQYWYYMIELSFYWSLLFSIASDVKRKDFKEQIIH 62V+ + W YD+K+ W GYP + +WYYMIE FY+SLL DV+R DF + ++HSbjct112 VMKNSSWLYDVKQCWIGYPFHPVPDTIWWYYMIETGFYYSLLIGSTFDVRRSDFWQLMVH 171Query 63 HVATIILISFSWFANYIRAGTLIMALHDSSDYLLESAKMFNY-AGWKNTCNNXXXXXXXX 121HV TI L+S SW N++R GTLI+ HD SD LE K+ Y A KN NSbjct172 HVITIFLLSSSWTINFVRVGTLILLSHDVSDVFLEGGKLVRYDAHNKNMTNFMFVLFFSS 231Query122 XXXTRLVILPFWILHCT------------LVYPLELYPAFFGYYFFNSMMGVLQLLHIFW 169TRL+ PF ++ +++ +L P + +++ +L LHIFWSbjct232 WVATRLIYYPFIVIRSAVTEAAALIQPDYILWDYQLSPPYAPRLIVFALI-LLFFLHIFW 290Query170 AYLILRMAHKFITG 183++ILR+A++ TGSbjct291 TFIILRIAYRTSTG 304Query＝LAG 1 Hs2 Sbjct＝Lag1Sc(酵母)＞Lag1Sc長度＝411分值＝60.5 bits(144)，預(yù)計值＝5e-14相同性＝42/185(22％)，相似性＝82/185(43％)，缺口＝13/185(7％)Query 9 WFYDMKKVWEGYPIQSTIPSQYWYYMIELSFYWS---LLFSIASDVKRKDFKEQIIHHVA 65W + K ++ YP+ T P + + + + +W++ + + RKD+KE + HH+Sbjct200 WLFKTKPMYRTYPV-ITNPFLFKIFYLGQAAFWAQQACVLVLQLEKPRKDYKELVFHHIV 258Query 66 TIILISFSWFANYIRAGTLIMALHDSSDYLLESAKMFNYAGWKNTCNNXXXXXXXXXXXT 125T++LI S+ ++ + G ID SD+ L +K NY TSbjct289 TLLLIWSSYVFHFTKMGLAIYITMDVSDFFLSLSKTLNYLNSVFTPFVFGLFVFFWIYLR 318Query126 RLV-ILPFWIL--------HCTLVYPLELYPAFFGYYFFNSMMGVLQLLHIFWAYLILRM 176+V I W ++ L + + Y +++ LQL++++W +LILR+Sbjct319 HVVNIRILWSVLTEFRHEGNYVLNFATQQYKCWISLPIVFVLIAALQLVNLYWLFLILRI 378Query177 AHKFI 181
++ISbjct379 LYRLI 383(2)與人LAG1Hs的氨基酸序列及核苷酸序列比較與Lag1Hs氨基酸序列比較＞Lag1Hs 長度＝350分值＝77.3 bits(187)，預(yù)計值＝4e-19相同性＝54/191(28％)，相似性＝89/191(46％)，缺口＝11/191(5％)Query 6 DKPWFYDMKKVWEGYPIQSTIPSQYWY-YMIELSFYW-SLLFSIASDVKRKDFKEQIIHH 63D P+F+D V+ + +P Y+++ SFY S+ ++ D RKD++HHSbjct124 DYPFFHDPPSVFYDWTPGMAVPRDIAAAYLLQGSFYGHSIYATLYMDTWRKDSVVMLLHH 183Query 64 VATIILISFSWFANYIRAGTLIMALHDSSDYLLESAKMFNYAGWKNTCNNXXXXXXXXXX 123V T+ILI S+ Y G L++ LHD SD LE K+ Y ++Sbjct184 VVTLILIVSSYAFRYHNVGILVLFLHDISDVQLEFTKLNIYFKSRGGSYHRLHALAADLG 243Query124 XT---------RLVILPFWILHCTLVYPLELYPAFFGYYFFNSMMGVLQLLHIFWAYLIL 174RL P +L+ TL PY+FFN+++ +L L++++W I+Sbjct244 CLSFGFSWFWFRLYWFPLKVLYATSHCSLRTVPDIPFYFFFNALLLLLTLMNLYWFLYIV 303Query175 RMAHKFITGKL 185A K +TG++Sbjct304 AFAAKVLTGQV 314F基序分析如
圖1所示，本發(fā)明的LAG1 Hs2 cDNA序列，在53至104號氨基酸序列中，含與酵母Lag1P基序高度同源的特征性序列(RKDFKEQIIHHVATIILISFSWFANYIRAGTLIMALHDSSDYLLESAKMFNY)，酵母屬Lag基因及已報導(dǎo)的LAG1 Hs I即長壽保障基因中的共有保守序列的基序。因此，本發(fā)明的LAG1 Hs2蛋白具有Lag1基序，這暗示它具有與酵母長壽保障蛋白相同或相近的功能。
實施例3LAG1 Hs2對移植性人肝癌裸鼠體內(nèi)生長抑制皮下接種人肝癌移植瘤于裸鼠，待瘤長至直徑為0.5cm左右(約一周)，隨機分組，每組6只，設(shè)一組為對照組，即生理鹽水組，一組為實驗組。LAG1 Hs2基因克隆于真核表達載體pBKCMV中，構(gòu)建成表達質(zhì)粒。對照組瘤周注射100μl生理鹽水/次/周，實驗組瘤周注射100μl溶解于生理鹽水中的GE7基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包裹的0.2μg LAG1 Hs2表達質(zhì)粒/次/周，共注射四次，最后一次注射后一周，處死裸鼠，取瘤稱重，求±SD，進行統(tǒng)計處理。結(jié)果如表所示，LAG1 Hs2基因有29.4％抑瘤率。
W±SD 抑制率對照組 4.01±0.53LAG1Hs2 2.83±1.55 29.4％實施例4LAG1 Hs2在人組織中mRNA表達譜用LAG 1 Hs2基因為探針，于多種組織mRNA膜片(Clontech)進行雜交。結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明的LAG1 Hs2 cDNA，用Northern雜交，證明該基因在人腎、肝組織有mRNA高水平表達；在腦、心、胎盤、肺組織中低水平表達；肌肉、結(jié)腸、胸腺、脾、小腸、外周血白細胞中不表達。
原位雜交結(jié)果還顯示，與肝癌組織相比較，正常肝的表達水平高于癌旁肝組織，癌旁肝組織高于肝癌的表達，證明人肝癌中存在該基因的表達下調(diào)。
實施例5體外翻譯系統(tǒng)表達LAG1 Hs2蛋白(1)LAG1 Hs2基因克隆于含T7啟動子的表達載體在本實施例中采用非融合和融合表達兩種形式。在非融合表達中，設(shè)計LAG 1Hs2基因開放閱讀框架(ORF)的一對特異引物，5′端引物含有NcoI酶切點，3′端引物含有HindIII酶切點，以LAG 1 Hs2克隆質(zhì)?；騌T-PCR的擴增產(chǎn)物為模板擴增片段PCR，產(chǎn)物經(jīng)NcoI和HindIII酶切。非融合表達質(zhì)粒為含有T7啟動子的p22450(該載體為中科院上海生物工程中心構(gòu)建)，載體也經(jīng)NcoI和HidnIII酶切，與PCR酶切片段連接，組建非融合表達質(zhì)粒。
在融合表達中，設(shè)計LAG 1 Hs2基因開放閱讀框架(ORF)的一對特異引物，5′端引物含有EcoRI酶切點，3′端引物含有HindIII酶切點，以LAG 1 Hs2克隆質(zhì)?；騌T-PCR的擴增產(chǎn)物為模板擴增PCR片段，產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和HindIII酶切。融合表達所用載體為pT7zza(該載體為上海生物工程中心構(gòu)建)，載體經(jīng)EcoRI和HindIII酶切后與PCR酶切片段連接，組建融合表達質(zhì)粒。
(2)體外翻譯表達用上述構(gòu)建的兩種表達質(zhì)粒，采用E.coli T7 S30 Exaact System for CircularDNA(Promega，Cat#L1130)，并利用TranscendTM Colorimetric TranslationDetection System(Promema，Cat.#L5070)，體外表達LAG1 Hs2蛋白。
1.建立體外翻譯反應(yīng)體系
質(zhì)粒DNA 1-4μg完全氨基酸t(yī)RNA混合液 5μl無氨基酸的S30預(yù)混合液 20μlTranscendTMtRNA*1μlT7 S30細胞裂解液 15μl無核酸酶無菌水加至終濃度 50μl*TranscendTMtRNA是e-NH2被生物素標記的Lys-tRNA。
37℃反應(yīng)1-2小時。
2.體外翻譯產(chǎn)物的分析SDS-PAGE電泳分析15％分離膠，4％濃縮膠。
電轉(zhuǎn)移至PVDF100V，60分鐘。
利用Streptavidin-Alkaline Phosphatase(鏈霉抗生物素-堿性磷酸脂酶)結(jié)合含生物素的翻譯蛋白，并通過Western Blue Stablized Substrate for AlkalinePhosphatase(堿性磷酸脂酶固定化染色劑)顯色。
結(jié)果顯示正對照樣品CAT融合蛋白表達質(zhì)粒在39KD處有蛋白條帶，LAG1 Hs2蛋白表達質(zhì)粒pT7X-LAG1 Hs2在27KD處有蛋白條帶，LAG1 Hs2與ZZ融合蛋白表達質(zhì)粒pT2Zza-LAG1 Hs2在41KD處有蛋白條帶，分子量與預(yù)計相符(圖3)。這表明用體外表達系統(tǒng)表達了LAG1 Hs2蛋白。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人上海市腫瘤研究所(ii)發(fā)明名稱人長壽保障蛋白和編碼序列及其用途(iii)序列數(shù)目3(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度2007bp(B)類型核苷酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核苷酸(ix)序列描述SEQ ID NO.1CTAGAATTCA GCGGCCGCTG AATTCTAGAA GCCGATCTAG AAGACCGAGA TGGACGTGTC60TACGCCAAAG CCTCAGATCT CTATATCACG CTGCCCCTGG CCTTGCTCTT CCTCATCGTT 120CGATACTTCT TTGAGCTGTA CGTGGCTACA CCACTGGCTG CCCTCTTGAA CATAAAGGAG 180AAAACTCGGC TGCGGGCACC TCCCAACGCC ACCTTGGAAC ATTTCTACCT GACCAGTGGC 240AAGCAGCCCA AGCAGGTGGA AGTAGAGCTT TTGTCCCGGC AGAGCGGGCT CTCTGGCCGC 300CAGGTAGAGC GTTGGTTCCG TCGCCGCCGC AACCAGGACC GGCCCAGTCT CCTCAAGAAG 360TTCCGAGAAG CCAGCTGGAG ATTCACATTT TACCTGATTG CCTTCATTGC CGGCATGGCC 420GTCATTGTGG ATAAACCCTG GTTCTATGAC ATGAAGAAAG TTTGGGAGGG ATATCCCATA 480CAGAGCACTA TCCCTTCCCA GTATTGGTAC TACATGATTG AACTTTCCTT CTACTGGTCC 540CTGCTCTTCA GCATTGCCTC TGATGTCAAG CGAAAGGATT TCAAGGAACA GATCATCCAC 600CATGTGGCCA CCATCATTCT CATCAGCTTT TCCTGGTTTG CCAATTACAT CCGAGCTGGG 660ACTCTAATCA TGGCTCTGCA TGACTCTTCC GATTACCTGC TGGAGTCAGC CAAGATGTTT 720AACTACGCGG GATGGAAGAA CACCTGCAAC AACATCTTCA TCGTCTTCGC CATTGTTTTT 780ATCATCACCC GACTGGTCAT CCTGCCCTTC TGGATCCTGC ATTGCACCCT GGTGTACCCA 840CTGGAGCTCT ATCCTGCCTT CTTTGGCTAT TACTTCTTCA ATTCCATGAT GGGAGTTCTA 900CAGCTGCTGC ATATCTTCTG GGCCTACCTC ATTTTGCGCA TGGCCCACAA GTTCATAACT 960GGAAAGCTGG TAGAAGATGA ACGCAGTGAC CGGGAAGAAA CAGAGAGCTC AGAGGGGGAG 1020GAGGCTGCAG CTGGGGGAGG AGCAAAGAGC CGGCCCCTAG CCAATGGCCA CCCCATCCTC 1080AATAACAACC ATCGTAAGAA TGACTGAACC ATTATTCCAG CTGCCTCCCA GATTAATGCA 1140TAAAGCCAAG GAACTACCCT GCTCCCTGCG CTATAGGGTC ACTTTAAGCT CTGGGGAAAA 1200AGGAGAAAGT GAGAGGAGAG TTCTCTGCAT CCTCCCTCCT TGCTTGTCAC CCAGTTGCCT 1260TTAAACCAAA TTCTAACCAG CCTATCCCCA GGTAGGGGGG ACGTTGGTTA TATTCTGTTA 1320GAGGGGGACG GTCGTATTTT CCTCCCTACC CGCCAAGTCA TCCTTTCTAC TGCTTTTGAG 1380GCCCTCCCTC AGCTCTCTGT GGGTAGGGGT TACAATTCGC ATTCCTTATT CTGAGAATTT 1440GGCCCCAGCT GTTTGCCTTT GACTCCCTGA CCTCCAGAGC CAGGGTTGTG CCTTATTGTC 1500CCATCTGTGG GCCTCATTCT GCCAAAGCTG GACCAAGGCT AACCTTTCTA AGCTCCCTAA 1560CTTGGGCCAG AAACCAAAGC TGAGCTTTTA ACTTTCTCCC TCTATGACAC AAATGAATTG 1620AGGGTAGGAG GAGGGTGCAC ATAACCCTTA CCCTACCTCT GCCAAAAAGT GGGGGCTGTA 1680CTGGGGACTG CTCGGATGAT CTTTCTTAGT GCTACTTCTT TCAGCTGTCC CTGTAGCGAC 1740AGGTCTAAGA TCTGACTGCC TCCTTTCTCT GGCCTCTTCC CCCTTCCCTC TTCTCTTCAG 1800CTAGGCTAGC TGGTTTGGAG TAGAATGGCA ACTAATTCTA ATTTTTATTT ATTAAATATT 1860TGGGGTTTTG GTTTTAAAGC CAGAATTACG GCTAGCACCT AGCATTTCAG CAGAGGGACC 1920ATTTTAGACC AAAATGTACT GTTAATGGGT TTTTTTTTAA AATTAAAAGA TTAAATAAAA 1980AATATTAAAT AAAAAAAAAA AAAAAAA 2007(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度230氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(ix)序列描述SEQ ID NO.2MAVIVDKPWF YDMKKVWEGY PIQSTIPSQY WYYMIELSFY WSLLFSIASD 50VKRKDFKEQI IHHVATIILI SFSWFANYIR AGTLIMALHD SSDYLLESAK 100MFNYAGWKNT CNNIFIVFAI VFIITRLVIL PFWILHCTLV YPLELYPAFF 150GYYFFNSMMG VLQLLHIFWA YLILRMAHKF ITGKLVEDER SDREETESSE 200GEEAAAGGGA KSRPLANGHP ILNNNHRKND230(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度2007bp(B)類型核苷酸(C)鏈性雙鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核苷酸(ix)序列描述SEQ ID NO.31 CTA GAA TTC AGC GGC CGC TGA ATT CTA GAA GCC GAT CTA GAA GAC CGA 4849 GAT GGA CGT GTC TAC GCC AAA GCC TCA GAT CTC TAT ATC ACG CTG CCC 9697 CTG GCC TTG CTC TTC CTC ATC GTT CGA TAC TTC TTT GAG CTG TAC GTG 144145 GCT ACA CCA CTG GCT GCC CTC TTG AAC ATA AAG GAG AAA ACT CGG CTG 192193 CGG GCA CCT CCC AAC GCC ACC TTG GAA CAT TTC TAC CTG ACC AGT GGC 240241 AAG CAG CCC AAG CAG GTG GAA GTA GAG CTT TTG TCC CGG CAG AGC GGG 288289 CTC TCT GGC CGC CAG GTA GAG CGT TGG TTC CGT CGC CGC CGC AAC CAG 336337 GAC CGG CCC AGT CTC CTC AAG AAG TTC CGA GAA GCC AGC TGG AGA TTC 384385 ACA TTT TAC CTG ATT GCC TTC ATT GCC GGC ATG GCC GTC ATT GTG GAT 4321 Met Ala Val Ile Val Asp 6433 AAA CCC TGG TTC TAT GAC ATG AAG AAA GTT TGG GAG GGA TAT CCC ATA 4807 Lys Pro Trp Phe Tyr Asp Met Lys Lys Val Trp Glu Gly Tyr Pro Ile 22481 CAG AGC ACT ATC CCT TCC CAG TAT TGG TAC TAC ATG ATT GAA CTT TCC 52823 Gln Ser Thr Ile Pro Ser Gln Tyr Trp Tyr Tyr Met Ile Glu Leu Ser 38529 TTC TAC TGG TCC CTG CTC TTC AGC ATT GCC TCT GAT GTC AAG CGA AAG 57639 Phe Tyr Trp Ser Leu Leu Phe Ser Ile Ala Ser Asp Val Lys Arg Lys 54577 GAT TTC AAG GAA CAG ATC ATC CAC CAT GTG GCC ACC ATC ATT CTC ATC 62455 Asp Phe Lys Glu Gln Ile Ile His His Val Ala Thr Ile Ile Leu Ile 70625 AGC TTT TCC TGG TTT GCC AAT TAC ATC CGA GCT GGG ACT CTA ATC ATG 67271 Ser Phe Ser Trp Phe Ala Ash Tyr Ile Arg Ala Gly Thr Leu Ile Met 86673 GCT CTG CAT GAC TCT TCC GAT TAC CTG CTG GAG TCA GCC AAG ATG TTT 72087 Ala Leu His Asp Ser Ser Asp Tyr Leu Leu Glu Ser Ala Lys Met Phe 102721 AAC TAC GCG GGA TGG AAG AAC ACC TGC AAC AAC ATC TTC ATC GTC TTC 768103 Asn Tyr Ala Gly Trp Lys Asn Thr Cys Asn Asn Ile Phe Ile Val Phe 118769 GCC ATT GTT TTT ATC ATC ACC CGA CTG GTC ATC CTG CCC TTC TGG ATC 816119 Ala Ile Val Phe Ile Ile Thr Arg Leu Val Ile Leu Pro Phe Trp Ile 134817 CTG CAT TGC ACC CTG GTG TAC CCA CTG GAG CTC TAT CCT GCC TTC TTT 864135 Leu His Cys Thr Leu Val Tyr Pro Leu Glu Leu Tyr Pro Ala Phe Phe 150865 GGC TAT TAC TTC TTC AAT TCC ATG ATG GGA GTT CTA CAG CTG CTG CAT 912151 Gly Tyr Tyr Phe Phe Asn Ser Met Met Gly Val Leu Gln Leu Leu His 166913 ATC TTC TGG GCC TAC CTC ATT TTG CGC ATG GCC CAC AAG TTC ATA ACT 960167 Ile Phe Trp Ala Tyr Leu Ile Leu Arg Met Ala His Lys Phe Ile Thr 182961 GGA AAG CTG GTA GAA GAT GAA CGC AGT GAC CGG GAA GAA ACA GAG AGC1008183 Gly Lys Leu Val Glu Asp Glu Arg Ser Asp Arg Glu Glu Thr Glu Ser 1981009 TCA GAG GGG GAG GAG GCT GCA GCT GGG GGA GGA GCA AAG AGC CGG CCC1056199 Ser Glu Gly Glu Glu Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ala Lys Ser Arg Pro 2141057 CTA GCC AAT GGC CAC CCC ATC CTC AAT AAC AAC CAT CGT AAG AAT GAC1104215 Leu Ala Ash Gly His Pro Ile Leu Ash Asn Asn His Arg Lys Asn Asp 2301105 TGA ACC ATT ATT CCA GCT GCC TCC CAG ATT AAT GCA TAA AGC CAA GGA1152231 *** 2311153 ACT ACC CTG CTC CCT GCG CTA TAG GGT CAC TTT AAG CTC TGG GGA AAA12001201 AGG AGA AAG TGA GAG GAG AGT TCT CTG CAT CCT CCC TCC TTG CTT GTC12481249 ACC CAG TTG CCT TTA AAC CAA ATT CTA ACC AGC CTA TCC CCA GGT AGG12961297 GGG GAC GTT GGT TAT ATT CTG TTA GAG GGG GAC GGT CGT ATT TTC CTC13441345 CCT ACC CGC CAA GTC ATC CTT TCT ACT GCT TTT GAG GCC CTC CCT CAG13921393 CTC TCT GTG GGT AGG GGT TAC AAT TCG CAT TCC TTA TTC TGA GAA TTT14401441 GGC CCC AGC TGT TTG CCT TTG ACT CCC TGA CCT CCA GAG CCA GGG TTG14881489 TGC CTT ATT GTC CCA TCT GTG GGC CTC ATT CTG CCA AAG CTG GAC CAA15361537 GGC TAA CCT TTC TAA GCT CCC TAA CTT GGG CCA GAA ACC AAA GCT GAG15841585 CTT TTA ACT TTC TCC CTC TAT GAC ACA AAT GAA TTG AGG GTA GGA GGA16321633 GGG TGC ACA TAA CCC TTA CCC TAC CTC TGC CAA AAA GTG GGG GCT GTA16801681 CTG GGG ACT GCT CGG ATG ATC TTT CTT AGT GCT ACT TCT TTC AGC TGT17281729 CCC TGT AGC GAC AGG TCT AAG ATC TGA CTG CCT CCT TTC TCT GGC CTC17761777 TTC CCC CTT CCC TCT TCT CTT CAG CTA GGC TAG CTG GTT TGG AGT AGA18241825 ATG GCA ACT AAT TCT AAT TTT TAT TTA TTA AAT ATT TGG GGT TTT GGT18721873 TTT AAA GCC AGA ATT ACG GCT AGC ACC TAG CAT TTC AGC AGA GGG ACC19201921 ATT TTA GAC CAA AAT GTA CTG TTA ATG GGT TTT TTT TTA AAA TTA AAA19681969 GAT TAA ATA AAA AAT ATT AAA TAA AAA AAA AAA AAA AAA200權(quán)利要求
1.一種分離的長壽保障蛋白，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2的氨基酶序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼的多肽具有SEQID NO2的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組SEQ ID NO3的編碼區(qū)序列或全長序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它是選自下組的一種宿主細胞(a)用權(quán)利要求6所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞；(b)用權(quán)利要求3所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。
8.一種具有長壽保障蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達長壽保障蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有長壽保障蛋白活性的多肽。
9.一種核酸分子，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸中連續(xù)的10-800個核苷酸。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類新的人長壽保障蛋白,編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生該多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽用于治療多種疾病如癌癥等的方法。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了編碼這類新的人長壽保障蛋白的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N15/12GK1342713SQ0012519
公開日2002年4月3日 申請日期2000年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月14日
發(fā)明者顧健人, 楊勝利 申請人:上海市腫瘤研究所