專利名稱：：三糖磷酸酯異構(gòu)化酶、果糖－1,6－二磷酸醛縮酶及果糖－1,6－二磷酸酯酶的共表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說(shuō)涉及計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)基因間共表達(dá)調(diào)控序列、DNA重組和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞等基因工程學(xué)，將來(lái)源于高等植物與固定CO2的Calvin循環(huán)有關(guān)的果糖-1，6-二磷酸酯酶、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶及三糖磷酸酯異構(gòu)化酶三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中使大腸桿菌能高效率共表達(dá)出上述三個(gè)活性酶，為提高藻類等光合生物在高濃度CO2條件下固定CO2效率開(kāi)辟途徑。光合固定CO2的限速步主要集中在暗反應(yīng)，而其中的Calvin循環(huán)(也稱為C3循環(huán))是所有光合生物的碳素光合流動(dòng)過(guò)程的中心環(huán)節(jié)[Hall，D.O.＆Rao，K.K.，Photosynthesis5th，CambridgeUniversityPress(1992)97-126；Jing，Y.X.，Kuang，T.Y.，＆Li，D.B.，MolecularBiologyofPlants，SciencePress，1995]。在Calvin循環(huán)中，從核酮糖二磷酸吸收CO2到合成果糖-6-磷酸要經(jīng)過(guò)六個(gè)酶的連續(xù)催化，即1.核酮糖二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)，2.磷酸甘油酸激酶(PGK)，3.磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，4.三糖磷酸酯異構(gòu)化酶(TPI)，5.果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(ALD)，6.果糖-1，6-二磷酸酯酶(FBPase)。該循環(huán)中有兩個(gè)主要的分支點(diǎn)第一個(gè)分支點(diǎn)位于三碳糖-二羥丙酮磷酸酯(DHAP)的位置上。在這里，DHAP能夠很快地透過(guò)葉綠體的包膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并在其中逐步轉(zhuǎn)化成蔗糖。涉及該分支點(diǎn)的酶是ALD和TPI，且ALD又是固定CO2后第一個(gè)催化3C化合物轉(zhuǎn)化為6C化合物的酶，同時(shí)也是控制光合作用速率的重要酶之一[Iwaki，T.，Wadano，A.，Yokota，A.＆Himeno，M.，PlantCellPhysiol.(1991)32，1083-1091]。最近Monsanto公司的研究人員利用此原理在轉(zhuǎn)基因植物中大量表達(dá)大腸桿菌的ALD基因，使得植物生成淀粉和蔗糖的能力有所提高，從而提高作物產(chǎn)量[Barry，G.F.，Cheikh，N.，＆Kishore，G.M.，PCTIht.Appl.WO9858069Al，1998，23Dec.，77pp]。第二個(gè)分支點(diǎn)位于6-磷酸果糖的位置上，由此源源不斷在葉綠體內(nèi)合成淀粉。涉及該分支點(diǎn)的酶是FBPase，也是控制光合作用的重要酶[Griffin，K.L.＆Seemann，JR0，Chemistry＆Biology(1996)3，245-254]，同時(shí)還是調(diào)控Calvin循環(huán)中PO43-循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，該酶催化的反應(yīng)是不可逆的。因此，構(gòu)建fbp-ald-tpi三基因共表達(dá)體系并轉(zhuǎn)入光合菌對(duì)于提高宿主細(xì)胞固定CO2的效率極有可能產(chǎn)生某些有利的影響。選擇這三個(gè)反應(yīng)作為突破口，除上述考慮外更由于它們是Calvin循環(huán)中最單純的部分，不涉及能量分子ATP的合成，又沒(méi)有要求其他輔助因子(如NADPH)的參與等復(fù)雜因素。關(guān)于多個(gè)外源基因在某一個(gè)宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)中的共表達(dá)，連續(xù)催化幾步化學(xué)反應(yīng)是代謝工程--基因工程的擴(kuò)展--的研究?jī)?nèi)容。比較顯著的例子，如在宿主細(xì)菌中引入葡萄糖氧化酶和2，5-二酮基葡萄糖酸還原酶等基因，并將宿主細(xì)胞染色體上的2-酮基糖醛酸還原酶基因缺失失活改變細(xì)菌的代謝流使它利用D-葡萄糖為原料合成維生素C的前體化合物2-酮基-L-古龍酸(120g/L以上)[AndersonS.etal.，Science(1985)230，144-149；LazarusRA.inBiocatalysis，Ed.byAbramowicz，D.A.，VanNostrandReinholdPress，NewYork，N.Y.(1990)pp.135-55.]。關(guān)于代謝工程我們另有綜述文章專門介紹[唐功利陳海寶，有機(jī)化學(xué)(2000)20(5)，]在代謝工程中，使外源基因在同一宿主細(xì)菌中的共表達(dá)主要有二種方式將不同基因串聯(lián)形成多順?lè)醋涌寺≡谕粋€(gè)啟動(dòng)子下游進(jìn)行共表達(dá)[Newman，J.＆Gutteridge，S.，J.Biol.Chem.(1990)265，15154-15159；WangZ.Z.J.Biol.Chem.(1996)271，27575-27584]或?qū)⒉煌蚩寺〉酵毁|(zhì)粒的不同啟動(dòng)子下游[Belyaev，A.S.，Gene(1995)156，229-233]。本實(shí)驗(yàn)室已于最近先后分別構(gòu)建了果糖-1，6-二磷酸醛縮酶、三糖磷酸酯異構(gòu)化酶和果糖-1，6-二磷酸酯酶三個(gè)酶基因單獨(dú)表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒，并在一種大腸桿菌中都實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)[陳海寶楊春松，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(1997)29，613-616；Tang，G.-L.，Wang，Y.-F.，Bao，J.-S.，＆Chen，H.-B.，ProteinExpression＆Purification(1999)16，432-439，(2000)19，411-418]。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上采用將這三個(gè)酶基因串聯(lián)形成多順?lè)醋涌寺≡谕粋€(gè)啟動(dòng)子下游的方式進(jìn)行共表達(dá)。本發(fā)明的目的是構(gòu)建一個(gè)來(lái)自高等植物的果糖-1，6-二磷酸酯酶、果糖-l，6-二磷酸醛縮酶和三糖磷酸酯異構(gòu)化酶的三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因共表達(dá)體系。本發(fā)明的另一目的是提供上述三基因共表達(dá)的方法，能在大腸桿菌中同時(shí)高效率共表達(dá)這三個(gè)酶。本發(fā)明的目的還提供上述三基因共表達(dá)的用途，即用于連續(xù)催化從磷酸二羥基丙酮直接合成果糖-6-磷酸的三步化學(xué)反應(yīng)，為進(jìn)一步構(gòu)建能轉(zhuǎn)化光合細(xì)菌，使之在高濃度的CO2中提高固定CO2效率開(kāi)辟途徑。本發(fā)明是一種包含在共表達(dá)質(zhì)粒中的三基因共表達(dá)結(jié)構(gòu)，即為包含編碼果糖-l，6-二磷酸酯酶基因(fbp)、果糖-l，6-二磷酸醛縮酶基因(ald)及三糖磷酸酯異構(gòu)化酶基因(tpi)三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因的共表達(dá)結(jié)構(gòu)。具體地說(shuō)，是將來(lái)源于高等植物的fbp、ald和tpi三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后依次按圖1的設(shè)計(jì)序列合成基因間連接的接頭Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，經(jīng)DNA重組于大腸桿菌載體質(zhì)粒的Trc啟動(dòng)子(pTrc)下游，構(gòu)建了此三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因的共表達(dá)質(zhì)粒pTrcFAT，結(jié)構(gòu)如圖2所示，其中從StyⅠ至SalⅠ的結(jié)構(gòu)如圖1所示。此外，(fbp-ald-tpi)n三個(gè)基因相連接的順序及其突變體可以按多聚體形式存在于其他質(zhì)粒中，與所述的質(zhì)粒中基因間相連接的順序有50％以上相同，其中n=1-9。外源基因的操縱子與載體質(zhì)粒摩爾比例為1-9∶1。除此之外，還通過(guò)制備高轉(zhuǎn)化效率大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，采用高濃度的線性片斷較高溫度連接使之先形成分子間聚合體，然后用低濃度低溫連接進(jìn)一步分子內(nèi)環(huán)化的二次連接法將含大腸桿菌強(qiáng)融合啟動(dòng)子trp/lac(Tac啟動(dòng)子)的pTrcFAT三基因共表達(dá)系統(tǒng)連同質(zhì)粒上的lacIq等位基因一同接入大腸桿菌-藍(lán)藻穿梭載體獲得成功。按圖4所示路線構(gòu)建FBPase-ALD-TPI三基因的大腸桿菌-藍(lán)藻穿梭表達(dá)質(zhì)粒，獲得正常的重組質(zhì)粒pDcFAT-1(17.4kb)，還獲得載體質(zhì)粒pDC-8的線性片斷與pTrcFAT的線性片斷形成的含兩組操縱子的質(zhì)粒pDCFAT-2(23.6kb)。本發(fā)明應(yīng)用于在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)上述三個(gè)酶的活性共表達(dá)，即培養(yǎng)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)可同時(shí)獲得果糖-1，6-二磷酸酯酶、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶及三糖磷酸酯異構(gòu)化酶等三個(gè)活性酶，然后接種含上述三基因共表達(dá)質(zhì)粒的宿主菌于培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)生長(zhǎng)后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，并顯示連續(xù)催化三步反應(yīng)即以磷酸二羥基丙酮為原料可直接合成果糖-6-磷酸。所使用的培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基或2xYT培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中添加山梨醇使獲得的三酶體系的活性可達(dá)705u/l左右。通常山梨醇的濃度為0.1-1.0mol/1。接種含重組質(zhì)粒pDCFAT的大腸桿菌HBl01于LB培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩組質(zhì)粒均獲得了穩(wěn)定的表達(dá)，但表達(dá)量有明顯的差異，其中pDCFAT-2的表達(dá)量比pDCFAT-1高出很多如圖5所示。具體的三基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下1．a(chǎn)ld-tpi雙基因共表達(dá)克隆質(zhì)粒pClAT-1的構(gòu)建含tpi結(jié)構(gòu)基因的克隆質(zhì)粒pC1TPIa[Tang，G.-L.，Wang，Y.-F.，Bao，J.-S.，＆Chen，H.-B.，ProteinExpression＆Purification(1999)16，432-439]經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ酶解，1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離含結(jié)構(gòu)基因的片段，再與寡核苷酸片段CTAGATTACTAGGCGGA-CTTCACGGTGGCGGAGTTGATGATATCGATA(a)與AATTTATCGATATCATCAACTCCG-CCACCGTGAAGTCCGCCTAGTAAT(b)的配對(duì)產(chǎn)物連接以消去EcoRⅠ酶切位點(diǎn)并同時(shí)產(chǎn)生XbaⅠ粘端。該基因片段與克隆質(zhì)粒pC1Rfba[陳海寶等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(1997)29，613-616]的EcoRⅠ/XbaⅠ酶解所得的結(jié)構(gòu)基因片段連接，產(chǎn)物克隆進(jìn)載體質(zhì)粒pUC1802的EcoRⅠ/BamHⅠ多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83，得到tpi-ald雙基因共表達(dá)克隆質(zhì)粒pC1AT-1。2．a(chǎn)ld-tpi雙基因共表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)tpi-ald雙基因共表達(dá)克隆質(zhì)粒pC1AT-1經(jīng)EcoRⅠ/SalⅠ酶切，分離含tpi-ald雙基因結(jié)構(gòu)基因的片段，重組入pPLc2833的EcoRⅠ/SalⅠ克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌C600(pCI857)，得到相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒pE1AT-1見(jiàn)圖3-1，其熱誘導(dǎo)表達(dá)見(jiàn)圖3-2。表達(dá)質(zhì)粒pE1AT-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌C600(pcI857)后取單菌落接于10mlLB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml，硫酸卡那霉素50μg/ml)，30℃振搖過(guò)夜。次日，用相同培養(yǎng)液稀釋100倍后30℃培養(yǎng)至A600nm約0.6左右，42℃誘導(dǎo)表達(dá)4～6小時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物用15％SDS-PAGE檢測(cè)。表達(dá)4小時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物可達(dá)總蛋白量的20％[Aldolase10％+TPI10％]左右(圖3-2)。3．三基因共表達(dá)質(zhì)粒pTrcFAT的構(gòu)建質(zhì)粒pC1AT-1經(jīng)EcoRⅠ/SalⅠ雙酶解，1％瓊脂糖凝膠電泳分離含結(jié)構(gòu)基因的片段，同時(shí)以BamHⅠ/SalⅠ雙酶解質(zhì)粒pTrcFBP[Tang，G.-L.，Wang，Y.-F.，Bao，J.-S.，＆Chen，H.-B.，ProteinExpression＆Purification(2000)19，411-418]，1％瓊脂糖凝膠電泳分離純化大片段(含載體質(zhì)粒和fbp結(jié)構(gòu)基因)，然后上述二片段與寡核苷酸GATCTTTT(c)和AATTAAAA(d)形成的配對(duì)產(chǎn)物連接成三基因共表達(dá)質(zhì)粒pTrcFAT如圖2所示，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl獲得含該質(zhì)粒的大腸桿菌TGl(pTrcFAT)。含三基因共表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌TGl(pTrcFAT)已于2000年7月5日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CGMCCNO.0471，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacola)。4．三基因共表達(dá)培養(yǎng)過(guò)夜的含三基因共表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌TGl(pTrcFAT)，經(jīng)50～100倍稀釋于含氨芐青霉素180mg/l的LB培養(yǎng)基，37℃生長(zhǎng)至A6000.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.25mmol/l，繼續(xù)培養(yǎng)8～10小時(shí)后，破菌上清液經(jīng)SDS變性的15％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明該上清液(圖5的泳道2和3)含有主要的蛋白質(zhì)泳距與TPI，ALD和FBPase配成的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(圖5的泳道4)的泳距是一致的。另外該上清液經(jīng)三酶體系活性測(cè)定表明1升培養(yǎng)液的破菌上清液每分鐘可催化磷酸二羥基丙酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)生700微摩爾果糖-6-磷酸(表1)。5．大腸桿菌和藍(lán)藻的穿梭共表達(dá)質(zhì)粒pDCFAT的構(gòu)建質(zhì)粒pDC-8作為大腸桿菌和藍(lán)藻的穿梭質(zhì)粒載體，含卡那霉素和新霉素抗性。將三基因共表達(dá)質(zhì)粒pTrcFAT與此載體分別用限制性內(nèi)切酶SalⅠ消化后分離線性質(zhì)粒片段再相連接，就可獲得含外源基因的穿梭質(zhì)粒(圖4)。采用二次連接法0.2～0.3pmolpDC-8/SalⅠ線性質(zhì)粒和三基因共表達(dá)質(zhì)粒pTrcFAT/SalⅠ線性片斷按1∶1摩爾比例在20μl反應(yīng)體系含50mmol/1Tris·HCl，pH7.6，1mmol/lDTT，0.5mmol/lATP，5mmol/lMgCl2和lWiss單位T4DNA連接酶，～20℃連接24小時(shí)。取2μl經(jīng)10倍稀釋后，在50mmol/lTris.HCl，pH7.6，1mmol/lDTT，l0mmol/lATP，10mmol/lMgCl2的緩沖液中加入lWiss單位T4DNA連接酶，16℃連接24小時(shí)后轉(zhuǎn)化經(jīng)PiPe-MgCl2-CaCl2-KCl方法制備的大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞即可獲得大腸桿菌和藍(lán)藻的穿梭共表達(dá)質(zhì)粒pDCFAT。此穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化光合細(xì)菌將可應(yīng)用于在高濃度CO2條件下提高光合固定CO2的效率。圖1是本發(fā)明的三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因共表達(dá)結(jié)構(gòu)及接頭區(qū)域堿基順序。圖2是本發(fā)明的一種包括三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因的共表達(dá)質(zhì)粒pTrcFAT圖，其中從StyⅠ至SalⅠ的結(jié)構(gòu)如圖1所示。圖3是pE1AT-1的熱誘導(dǎo)表達(dá)，其中3-1是tpi-ald雙基因共表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒pE1AT-1，3-2是pE1AT-1的SDS-PAGE(15％)熱誘導(dǎo)表達(dá)分析圖中說(shuō)明含有C600(pE1AT-1，pCI857)的培養(yǎng)液，30℃搖蕩3小時(shí)至A650nm達(dá)0.7，升高溫度到42℃誘導(dǎo)表達(dá)。不同的誘導(dǎo)時(shí)間取樣，樣品經(jīng)15％SDS-PAGE分離后，蛋白用考馬斯亮蘭R-250染色。誘導(dǎo)時(shí)間分別為泳道30min；泳道415min；泳道530min；泳道660min；泳道7120min；泳道8240min。泳道1C600(pcI857，pPLc2833)42℃誘導(dǎo)4小時(shí)。泳道2蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，Aldolase蛋白和TPI蛋白。圖4是三基因共表達(dá)的大腸桿菌-藍(lán)藻穿梭表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及結(jié)構(gòu)圖中說(shuō)明質(zhì)粒pTrcFAT和pDC-8分別經(jīng)SalⅠ酶解，分離線性大片段經(jīng)二次連接法連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，經(jīng)氨芐青霉素100μg/ml和硫酸卡那霉素50μg/ml平板篩選、鑒定獲得穿梭共表達(dá)質(zhì)粒pDCFAT-1和pDCFAT-2。圖5是三基因共表達(dá)的SDS-PAGE(15％)分析圖中說(shuō)明泳道1pTrc99B；泳道2pTrcFAT(LB培養(yǎng)基)；泳道3pTrcFAT(2xYT培養(yǎng)基+0.4mol/l山梨醇)；泳道4標(biāo)準(zhǔn)蛋白，F(xiàn)BPase(38.9KDa)，ALD(38.5KDa)和TPI(25.2KDa)；泳道5蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)自上而下依次為97.4，66.2，43.0，31.0，20.1和14.4KDa.圖6三基因穿梭共表達(dá)體系在大腸桿菌中的SDS-PAGE(15％)表達(dá)分析圖中說(shuō)明泳道1pTrc99B(TGl)；泳道2pTrcFAT(TGl)；泳道3pDC-8；泳道4和5pDCFAT-2；泳道6和7pDCFAT-1；泳道8標(biāo)準(zhǔn)蛋白，F(xiàn)BPase(38.9KDa)，ALD(38.5KDa)和TPI(25.2KDa)。該表達(dá)是在普通LB培養(yǎng)基中進(jìn)行的，未添加山梨醇。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，首次將來(lái)源于高等植物，與固定CO2的Calvin循環(huán)有關(guān)的三糖磷酸酯異構(gòu)化酶、果糖-l，6-二磷酸醛縮酶及果糖-1，6-二磷酸酯酶三個(gè)酶基因構(gòu)建成共表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌后成功地實(shí)現(xiàn)了這三個(gè)酶的活性高效共表達(dá)。所使用的酶來(lái)源廣泛，共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)方法有效，獲得的三酶體系的活性可達(dá)705u/l左右，為進(jìn)一步構(gòu)建能轉(zhuǎn)化光合細(xì)菌，使之在高濃度的CO2中提高固定CO2效率開(kāi)辟了途徑。以下實(shí)施例有助于理解本發(fā)明，但不限于本發(fā)明的內(nèi)容材料1．試劑、工具酶寡核苷酸片段CTAGATTACTAGGCGGACTTCACGGTGGCGGAGTTGATGATATCGATA(a)，AATTTATCGATATCATCAACTCCGCCAC-CGTGAAGTCCGCCTAGTAAT(b)，GATCTTTT(c)和AATTAAAA(d)按亞磷酰胺三酯法在DNA合成儀上合成純化。煙酰胺腺苷二磷酸鹽(NADP+)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和果糖-1，6-二磷酸(FDP)購(gòu)自伯奧生物技術(shù)公司；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)化酶(PGI)，牛血清蛋白(BSA)，溶菌酶，考馬斯亮蘭R-250，對(duì)甲基苯磺酰氟(PMSF)，Dowex-1型陰離子交換樹(shù)脂，Dowex50x8H+型離子交換樹(shù)脂購(gòu)自Sigma公司；各種限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，多核苷酸磷酸化激酶，NADH，NAD+，哌嗪-N，N’-雙(2-乙磺酸)(Pipes)，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自華美生物工程公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自BoehringerMannheim公司；蛋白質(zhì)定量Bradford試劑購(gòu)自Bio-Rad公司；β-巰基乙醇購(gòu)自Fluka公司；其他無(wú)機(jī)鹽和常用化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?．底物磷酸二羥基丙酮(DHAP)是以二羥基丙酮為原料經(jīng)POCl3磷酸化成鋇鹽，經(jīng)Dowex50x8(H+)離子交換柱處理得到DHAP，平時(shí)保存于pH＜4.5，臨用時(shí)以1mol/lNaOH調(diào)至pH7.0。參考文獻(xiàn)EffenbergerF，StraubA.TetrahedronLett.1987，281641-1644。3．菌種與質(zhì)粒含F(xiàn)BPase結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒pTrcFBP[Tang，G.-L.，Wang，Y.-F.，Bao，J.-S.，＆Chen，H.-B.，ProteinExpressionPurif.(2000)19，411-418]，含TPI結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒pClTPIa[Tang，G.-L.，Wang，Y.-F.，Bao，J.-S.，＆Chen，H.-B.，ProteinExpressionPurif.(1999)16，432-439]及含ALD結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒pClRfba[陳海寶，楊春松.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(1997)29，613-616]均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。質(zhì)粒pTrc99B[Amann，E.，Ochs，B.，＆Abel，K.J.，Gene.(1988)69，301-315]和大腸桿菌TGl由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所王恩多教授贈(zèng)送。質(zhì)粒pDC-8[wolk，C.P.，etal.，J.Bacteriol.(1988)170，1239-1244]及大腸桿菌菌種HBl01由中國(guó)科學(xué)院植物研究所光合室施定基教授提供。實(shí)施例1三基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建我們將mRNA3’-端相對(duì)穩(wěn)定、表達(dá)量高且成為比活高的tpi置于下游，表達(dá)量相對(duì)較低的fbp置于上游，ald處于中間，在Trc啟動(dòng)子調(diào)控下構(gòu)建了共表達(dá)質(zhì)粒pTrcFAT獲得成功。采用基因重組的方法，將ald-tpi共表達(dá)克隆質(zhì)粒pClAT-1的結(jié)構(gòu)基因重組入含fbp結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)質(zhì)粒pTrcFBP中，使之置于fbp結(jié)構(gòu)基因的下游，使三個(gè)基因共同置于Trc啟動(dòng)子調(diào)控下獲得三基因共表達(dá)質(zhì)粒pTrcFAT。如圖2所示。實(shí)施例2三基因共表達(dá)培養(yǎng)過(guò)夜的含pTrcFAT質(zhì)粒的大腸桿菌TGl(pTrcFAT)或JM83(pTrcFAT)經(jīng)50～100倍稀釋于含氨芐青霉素180mg/l的LB培養(yǎng)基，37℃生長(zhǎng)至A6000.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.25mmol/l，繼續(xù)培養(yǎng)8～10小時(shí)。15％SDS-PAGE檢測(cè)，三基因均獲得較高表達(dá)如圖3所示，各占全菌蛋白的5％左右。改用100倍稀釋于含氨芐青霉素180mg/l的2xYT培養(yǎng)基，37C生長(zhǎng)至A6000.8，加入0.4mol/l山梨醇繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，加入IPTG至終濃度為0.25mmol/l，繼續(xù)培養(yǎng)8～10小時(shí)。15％SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物TPI和ALD量顯著增加，但FBPase變化不明顯。蛋白定量采用Bradford微量定量法，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。目的蛋白表達(dá)量占的初步確定采用SDS-PAGE分離，考馬斯亮蘭R-250染色后經(jīng)黑度掃描確定。實(shí)施例3三基因共表達(dá)體系的功能測(cè)定離心收集表達(dá)的菌體，超聲破菌，破菌液100mmol/lTris.HCl，pH7.8，1mmol/lEDTA，1mmol/lβ-巰基乙醇，1mmol/lMgCl2，離心收集上清，對(duì)上清液分別以磷酸二羥基丙酮(DHAP)和果糖-l，6-二磷酸(FBP)為底物進(jìn)行功能測(cè)定。該三酶體系催化的反應(yīng)如下測(cè)活方法以DHAP為底物，生成的果糖-6-磷酸酯以酶偶聯(lián)方法檢測(cè)。1ml測(cè)活反應(yīng)體系中含有100mmol/lTris.HCl，pH8.8，10mmol/lMgCl2，0.5mmol/lEDTA，0.1mg/mlBSA，0.3mmol/lNADP+，0.6uG-6-PDH，1.24uPGI，1.4mmol/lDHAP，待測(cè)酶溶液加入引發(fā)反應(yīng)，25℃反應(yīng)幾分鐘后記錄A340nm的變化[Nishizawa，A.N.，Boihon，C.Y.andBuchanan，B.B，MethodsinChloroplastMolecularBiology，ElsevierBiomedicalPress，1982，pp.707-713；Kelly，G.J.，Zimmermann，G.andLatzko，E.，MethodsinEnzymology(1982)90，371-378；Rodriguez-Suarez，R.J.andWolosiuk，R.A.，Photosyn.Res.(1995)46，313~322；Sahrawy，M.，Chueca，A.andLópezGorgé，PlantSci.(1995)106，81-89]。以FBP為底物測(cè)定FBPase的活性，生成的果糖-6-磷酸酯以類似方法檢測(cè)。1ml測(cè)活反應(yīng)體系中含有100mmol/lTris.HCl，pH8.8，10mmol/lMgCl2，0.5mmol/lEDTA，0.1mg/mlBSA，0.3mmol/lNADP+，0.6uG-6-PDH，1.24uPGI及待測(cè)酶溶液，25℃溫育5分鐘，加入FBP至終濃度為0.7mmol/l引發(fā)反應(yīng)，25℃反應(yīng)，記錄A340nm的變化。表1三酶共表達(dá)體系的功能測(cè)定1三酶體系的活性以DHAP為底物測(cè)得，1單位定義為25℃，以DHAP為底物每分鐘生成1.0μmol果糖-6-磷酸。2FBPase的活性以FBP為底物測(cè)得，1單位定義為25℃，以FBP為底物每分鐘生成1.0μmol果糖-6-磷酸。從測(cè)活數(shù)據(jù)我們注意到一個(gè)現(xiàn)象即在2xYT培養(yǎng)基添加山梨醇的條件下，以FBP為底物測(cè)得的FBPase活性僅為180u/l左右，而以DHAP為底物測(cè)得的三酶體系的活性為705u/l左右，二者有相當(dāng)大的差別，而LB培養(yǎng)基不加山梨醇則無(wú)此現(xiàn)象。實(shí)施例4大腸桿菌-藍(lán)藻穿梭共表達(dá)質(zhì)粒pDCFAT的構(gòu)建到目前為止，外源基因在藍(lán)藻中的表達(dá)所用啟動(dòng)子主要是PpsbA啟動(dòng)子ElhaiJ，WolkCP.Gene.1988，68119-138，該啟動(dòng)子來(lái)自葉綠體，在葉綠體、大腸桿菌和藍(lán)藻中均有較強(qiáng)的啟動(dòng)基因表達(dá)的功能。但由于該啟動(dòng)子不需要誘導(dǎo)，使表達(dá)的不可調(diào)控性往往是表達(dá)量低的原因之一WackettLP，SadowskyMJ，NewmanLM，HurHG，LiS.Nature.1994，368627-629?，F(xiàn)已證明，有些大腸桿菌的啟動(dòng)子也可在藍(lán)藻中發(fā)揮作用ElhaiJ.FEMSMicrobiolLett.1993，114(2)179-84。因此我們?cè)噲D將含大腸桿菌強(qiáng)融合啟動(dòng)子trp/lac(Tac啟動(dòng)子)的pTrcFAT三基因共表達(dá)系統(tǒng)連同質(zhì)粒上的lacIq等位基因(保證trp/lac融合啟動(dòng)子的完全阻遏)一同接入穿梭載體，試探該啟動(dòng)子在藍(lán)藻中的可調(diào)控表達(dá)。通常大質(zhì)粒的連接和轉(zhuǎn)化效率均較低，我們采用常規(guī)的方法嘗試了幾次均未能成功。最后通過(guò)制備高轉(zhuǎn)化效率大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞InoueH，NojimaH，OkayamaH.Gene.1990，9623-28(轉(zhuǎn)化效率1～3×109cfu/μgpBR322DNA)，采用高濃度的線性片斷較高溫度連接使之先形成分子間聚合體，然后低濃度低溫連接進(jìn)一步分子內(nèi)環(huán)化的二次連接法TanDY，DengSS，MengL，ZanRG.Prog.Biochem.Biophys.1997，24(3)281-283獲得成功。按圖4所示路線構(gòu)建FBPase-ALD-TPI三基因的大腸桿菌-藍(lán)藻穿梭表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果除獲得正常的重組質(zhì)粒pDcFAT-2(17.4kb)外，還意外地獲得了載體質(zhì)粒pDC-8的線性片斷與pTrcFAT的線性片斷按l∶2摩爾比例形成的含兩組操縱子的質(zhì)粒pDCFAT-1(23.6kb)。二次連接法0.2～0.3pmolpDC-8/SalⅠ線性質(zhì)粒和三基因共表達(dá)質(zhì)粒pTrcFAT/SalⅠ線性片斷按1∶1摩爾比例在20μl反應(yīng)體系含50mmol/lTris.HCl，pH7.6，1mmol/lDTT，0.5mmol/lATP，5mmol/lMgCl2和lWiss單位T4DNA連接酶，～20℃連接24小時(shí)。取2μl經(jīng)10倍稀釋后，在50mmol/lTris.HCl，pH7.6，lmmol/lDTT，10mmol/lATP，10mmol/lMgCl2的緩沖液中加入1Wiss單位T40DNA連接酶，16℃連接24小時(shí)后轉(zhuǎn)化經(jīng)PiPe-MgCl2-CaCl2-KCl方法制備的大腸桿菌HBl01感受態(tài)細(xì)胞。高轉(zhuǎn)化效率大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備取低溫保存的HBl01菌種，在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)至菌落直徑2～3mm，約需20小時(shí)。挑取單菌落于250mlSOB*培養(yǎng)基中在2L搖瓶200-250rpm，18℃搖蕩至A600nm0.6，約需50小時(shí)。4℃離心2500g收集菌體，充分渦旋，使菌體均勻重懸于80ml冰冷的TB*溶液，冰中放置10分鐘。4℃離心(2500g)收集菌體，輕輕重懸于20ml冰冷的TB溶液，加入二甲亞砜(DMSO)使其終濃度為7％，輕輕混勻，冰中放置10分鐘，分裝，插入干冰中速凍后于-70℃保存。轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1～3×109cfu/μgpBR322DNA。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞室溫融化后加入連接產(chǎn)物，冰中放置30分鐘，42℃熱休克30秒后轉(zhuǎn)入冰浴，加入0.8mlSOC*培養(yǎng)基，37℃搖蕩＜250rpm1小時(shí)。取適量涂布于含適當(dāng)抗生素的LB平板或轉(zhuǎn)入滅菌的試管，加入3ml融化的、47℃LB固體培養(yǎng)基，混勻后均勻傾倒在含適當(dāng)抗生素的LB平板上，揮發(fā)干后倒置，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。*SOB培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨20g，酵母提取物5g，氯化鈉0.5g，加入NaOH調(diào)pH值至7.2，充分溶解后加入2.5mol/lKCl溶液1ml，定容至990ml，高壓滅菌。使用前加入滅菌的1mol/lMgCl2溶液1Oml。*SOC培養(yǎng)基SOB培養(yǎng)基含20mmol/l葡萄糖。*TB溶液10mmol/lPipes，55mmol/lMnCl2，15mmol/lCaCl2，250mmol/lKCl。除MnCl2外，其余各組分混合后用1mol/lKOH溶液調(diào)至pH6.7，MnCl2再加入。各鹽均以固體形式加入。溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后于4℃保存。實(shí)施例5穿梭共表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)接種含重組質(zhì)粒pDCFAT的大腸桿菌HBl01于LB培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩組質(zhì)粒均獲得了穩(wěn)定的表達(dá)，但表達(dá)量有明顯的差異，其中pDCFAT-2的表達(dá)量比pDCFAT-1高出很多如圖6所示。實(shí)施例6穿梭共表達(dá)體系的活性測(cè)定收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，STE10mol/lTris.HCl，pH8.0，1mmol/lEDTA，5mmol/lNaCl，洗滌后超聲破菌，破菌液l00mmol/1Tris.HCl，pH7.8，lmmol/lEDTA，1mmol/lβ-巰基乙醇，1mmol/lMgCl2，取上清，以DHAP為底物，采用酶偶聯(lián)法檢測(cè)生成的果糖-6-磷酸?；钚詼y(cè)定結(jié)果如下表。pDCFAT-2的總活性大約是pDCFAT-1的兩倍，其原因可能是由于FBPase-ALD-TPI三基因的操縱子在前者中是二聚體，表達(dá)量大約是后者的兩倍。表2三基因共表達(dá)的大腸桿菌-藍(lán)藻穿梭共表達(dá)質(zhì)粒在藍(lán)藻中表達(dá)的功能測(cè)定<tablesid="table2"num="002"><table>質(zhì)粒DHAP-活性(u/l培養(yǎng)基)pDC-8pDCFAT-2pDCFAT-10100±545±5</table></tables>權(quán)利要求1．一種包含在共表達(dá)質(zhì)粒中的三基因共表達(dá)結(jié)構(gòu)，其特征是包含編碼果糖-1，6-二磷酸酯酶基因(fbp)、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶基因(ald)及三糖磷酸酯異構(gòu)化酶基因(tpi)三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因的共表達(dá)結(jié)構(gòu)，是將高等植物的fbp、ald和tpi三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因與連接的接頭Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ及啟動(dòng)子依次按如下的設(shè)計(jì)序列連接SalⅠ為載體質(zhì)粒原有的多接頭區(qū)的克隆位點(diǎn)2．如權(quán)利要求1所述的三基因共表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于其載體質(zhì)?？梢允莗Trc99B或pDC-8。3．如權(quán)利要求1所述的三基因共表達(dá)結(jié)構(gòu)，其特征在于一種包含上述三基因共表達(dá)結(jié)構(gòu)和載體的共表達(dá)質(zhì)?？梢允琴|(zhì)粒pTrcFAT，結(jié)構(gòu)如下所示其中從StyⅠ至SalⅠ的結(jié)構(gòu)如權(quán)利要求1所示。4．如權(quán)利要求1所述的三基因共表達(dá)結(jié)構(gòu)，其特征在于所述的共表達(dá)質(zhì)粒的宿主菌可以是大腸桿菌TG1、大腸桿菌JM83或藍(lán)藻。5．如權(quán)利要求1所述的三基因共表達(dá)結(jié)構(gòu)，其特征在于(fbp-ald-tpi)n三個(gè)基因相連接的順序及其突變體可以按多聚體形式存在于其他質(zhì)粒中，與所述的共表達(dá)質(zhì)粒中基因間相連接的順序有50％以上相同，其中n=1-9。6．一種如權(quán)利要求1所述的三基因共表達(dá)的方法，其特征是采用基因重組的方法，使果糖-1，6-二磷酸酯酶基因(fbp)、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶基因(ald)及三糖磷酸酯異構(gòu)化酶基因(tpi)三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因共同置于啟動(dòng)子調(diào)控下獲得三基因共表達(dá)質(zhì)粒，其中穿梭共表達(dá)質(zhì)粒中外源基因的操縱子與載體質(zhì)粒摩爾比例為1-9∶1，然后接種含上述三基因共表達(dá)質(zhì)粒的宿主菌于培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)生長(zhǎng)后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。7．一種如權(quán)利要求6所述的三基因共表達(dá)的方法，其特征是所述的啟動(dòng)子可以是啟動(dòng)子pTrc或啟動(dòng)子Tac。8．一種如權(quán)利要求6所述的三基因共表達(dá)的方法，其特征是所述的培養(yǎng)基可以是LB培養(yǎng)基、2xYT培養(yǎng)基。9．一種如權(quán)利要求6所述的三基因共表達(dá)的方法，其特征是在培養(yǎng)基中添加山梨醇，山梨醇的濃度為0.1-1.0mol/l。10．一種如權(quán)利要求1所述的三基因共表達(dá)的用途，其特征是用于光合固定CO2。全文摘要本發(fā)明是將高等植物的果糖二磷酸酯酶、果糖二磷酸醛縮酶及三糖磷酸酯異構(gòu)化酶三個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因依次重組于啟動(dòng)子下游,構(gòu)建成此三基因共表達(dá)質(zhì)粒,質(zhì)?？梢允莗TrcFAT或大腸桿菌－藍(lán)藻穿梭表達(dá)質(zhì)粒。上述三個(gè)基因相連接的順序及其突變體可以按多聚體形式存在于其他質(zhì)粒中。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,實(shí)現(xiàn)了上述三酶的高活性共表達(dá)。使光合生物在高濃度的CO文檔編號(hào)C12N15/61GK1283698SQ0012520公開(kāi)日2001年2月14日申請(qǐng)日期2000年9月15日優(yōu)先權(quán)日2000年9月15日發(fā)明者陳海寶,唐功利申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所