專(zhuān)利名稱(chēng)：：外肽酶在可發(fā)酵谷汁生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為1997年2月12日、國(guó)家申請(qǐng)?zhí)枮?7192223.3、發(fā)明名稱(chēng)為“生產(chǎn)可發(fā)酵谷汁的方法”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及從谷物，特別是未發(fā)芽谷物中制備可發(fā)酵谷汁(wort)的方法。本發(fā)明還涉及按照本發(fā)明所述方法制得的谷汁。本發(fā)明又涉及按照本發(fā)明所述方法所制得的谷汁在酒精生產(chǎn)、蒸餾工業(yè)或啤酒釀造中的發(fā)酵反應(yīng)。啤酒是利用發(fā)芽或未發(fā)芽谷物發(fā)酵而生產(chǎn)出來(lái)的。在后一種情形中，谷物在商用酶作用下發(fā)生液化和糖化，產(chǎn)生谷汁，其中含有酵母發(fā)酵所必需的可發(fā)酵糖類(lèi)、氨基酸或其它形式氮(稱(chēng)為“可自由利用性氮”，F(xiàn)reelyAvailableNitrogen，F(xiàn)AN)。例如，Macfadden等(MacfaddenD.P.和ClaytonM.，國(guó)際釀造與飲料工業(yè)(BrewingandBeverageIndustriesInternational)(1989年)，第1卷，77-81頁(yè))建議在利用未發(fā)芽高粱釀造啤酒時(shí)加入一些酶，如α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、真菌類(lèi)α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶等等。MacFadden等還建議在使用未發(fā)芽高粱時(shí)加入酵母食物以進(jìn)行發(fā)酵。Bajomo等(BajomoM.F.和YoungT.W.，釀造學(xué)會(huì)雜志(J.Inst.Brew)，1992年，第88卷，515-523頁(yè)；BajomoM.F.和YoungT.W.，釀造學(xué)會(huì)雜志(J.Inst.Brew)，1994年，第100卷，79-843頁(yè))報(bào)道了利用100％未發(fā)芽高粱粒釀造啤酒的方法，盡管利用未發(fā)芽高粱制得的谷汁中，其FAN含量(51毫克/升)遠(yuǎn)低于利用發(fā)芽大麥所制得麥汁經(jīng)發(fā)酵后的基本水平。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩O92/20777中描述了一種生產(chǎn)酒精的方法，它包括以下步驟在淀粉酶作用下對(duì)未發(fā)芽完整谷物或牲畜飼料進(jìn)行液化，在葡糖淀粉酶和酸性真菌蛋白酶作用下進(jìn)行谷漿糖化。該方法要求在發(fā)酵過(guò)程和糖化過(guò)程中加入蛋白酶。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值在4-5之間，在此條件下，真菌類(lèi)外肽酶是沒(méi)有活性的(LabbeJP，RebeyrotteP.，生物化學(xué)(Biochimie)(1974年)，第56卷，839-844頁(yè)；LehmanK.和UhligH.，HoppeSeyler’sZ.Physiol.Chem(1969年)，第350卷，99-104頁(yè))。因此，上述方法的一個(gè)缺點(diǎn)是，在其反應(yīng)條件下，所用的真菌類(lèi)蛋白酶只進(jìn)行內(nèi)切蛋白酶解，產(chǎn)物主要是寡肽，而游離氨基酸則很少。為對(duì)本領(lǐng)域有一個(gè)一般的了解，可以參考Palmer的綜述(PalmerG.H.，谷類(lèi)科學(xué)與技術(shù)?！肮阮?lèi)科學(xué)與技術(shù)”(1989年)，阿貝丁大學(xué)出版社編輯，阿貝丁，蘇格蘭，61-242頁(yè))。本發(fā)明提供了一種利用未發(fā)芽谷物生產(chǎn)谷汁的方法。通過(guò)這種方法生產(chǎn)的谷汁，其性質(zhì)非常優(yōu)良，如富含可自由利用性氮(后面將用FAN表示)，谷汁的濾過(guò)性好，產(chǎn)量也高。這種方法也可用于發(fā)芽谷物的谷汁生產(chǎn)中，但它在用于未發(fā)芽谷物如未發(fā)芽高粱、未發(fā)芽高粱與玉米混合物的谷汁生產(chǎn)中優(yōu)越性尤其突出。當(dāng)進(jìn)行“混合釀造”，即利用發(fā)芽谷物(如發(fā)芽大麥)與未發(fā)芽谷物(如玉米、稻米或高粱)的混合物生產(chǎn)谷汁時(shí)，這些優(yōu)點(diǎn)仍然存在。因此，本發(fā)明提供了利用谷物生產(chǎn)可發(fā)酵谷汁的方法，此方法包括以下幾個(gè)步驟(a)在α-淀粉酶和/或內(nèi)切蛋白酶活性作用下，將谷物液化形成液化谷漿(mash)；(b)在α-淀粉酶作用下對(duì)所說(shuō)的谷漿進(jìn)行糖化；(c)對(duì)已液化和糖化的谷漿進(jìn)行過(guò)濾產(chǎn)生可發(fā)酵性谷汁。上述步驟(a)、(b)至少其一是在具外肽酶活性的酶存在下進(jìn)行的。具有外肽酶活性的可用酶類(lèi)有外肽酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定的外肽酶如真菌類(lèi)氨肽酶，熱穩(wěn)定的羧肽酶也較有效。根據(jù)本發(fā)明，最好使用曲霉菌類(lèi)特別是黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)或豆曲霉(Aspergillussojae)的內(nèi)源氨肽酶。當(dāng)谷物中未發(fā)芽谷粒占至少20％特別是50％以上時(shí)，比如在高粱粒中摻入未發(fā)芽玉米、稻米或其它谷物時(shí)，這種方法非常有效。根據(jù)本發(fā)明，在谷粒的液化步驟中加入外肽酶是非常有益的。本發(fā)明還提供了一種可發(fā)酵谷汁，它可按照本發(fā)明的方法獲得。本發(fā)明也涉及一種釀造啤酒的方法，其中使用了本發(fā)明的可發(fā)酵谷汁。本發(fā)明還提供了一種釀造酒精類(lèi)飲料如啤酒等的方法，包括按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)谷汁、隨后或同時(shí)對(duì)所說(shuō)的谷汁進(jìn)行發(fā)酵，并由此獲得如啤酒等若干步驟。本發(fā)明還體現(xiàn)在提供了一種通過(guò)酶解方法，從富含谷蛋白和/或醇溶谷蛋白的谷物中產(chǎn)生可自由利用性氮的方法。此方法包括在谷?；蚶盟f(shuō)谷粒生產(chǎn)的液化谷漿中混合加入內(nèi)切蛋白酶和外肽酶組合物這個(gè)步驟。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)酒精的方法。此方法包括在一種能生產(chǎn)酒精的酵母存在下，對(duì)根據(jù)本發(fā)明方法制得的FAN進(jìn)行發(fā)酵的步驟。本發(fā)明可用下列附圖加以說(shuō)明。圖1是來(lái)源于黑曲霉的亮氨酸氨肽酶的pH曲線(xiàn)。圖2是來(lái)源于黑曲霉的苯丙氨酸氨肽酶的pH曲線(xiàn)。圖3是兩種氨肽酶的溫度曲線(xiàn)。下面對(duì)整個(gè)發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。本發(fā)明提供了一種從谷物中生產(chǎn)可發(fā)酵谷汁的方法。在此方法的工作條件下，存在至少一種具有外肽酶活性的蛋白質(zhì)。真菌特別是曲霉菌的內(nèi)源氨肽酶可以作為上述方法的有效酶類(lèi)，這是由于這些酶在pH5-8之間的環(huán)境中都具有足夠的穩(wěn)定性和活性，這恰是液化步驟中的pH范圍。在這種溫度和pH環(huán)境下，羧肽酶的應(yīng)用價(jià)值就不大了。由于糖化步驟比液化步驟中的環(huán)境要稍酸一些，因此，只要羧肽酶在50-60℃最好是50-70℃范圍內(nèi)足夠穩(wěn)定，在糖化步驟中使用羧肽酶也具有一定優(yōu)越性。相比于未加外肽酶的方法，本發(fā)明中外肽酶的使用不僅可提高谷汁中可自由利用性氮(FAN)含量，還可以提高谷汁的可濾過(guò)性和產(chǎn)量。通過(guò)未發(fā)芽谷物生產(chǎn)可發(fā)酵谷汁時(shí)，利用本發(fā)明的方法則優(yōu)點(diǎn)很明顯。當(dāng)所用的是未發(fā)芽高粱時(shí)，這種優(yōu)點(diǎn)尤其突出。并且該谷物中還可選擇性地添加其它谷類(lèi)，如玉米、小麥、燕麥或稻米。本發(fā)明所提及的谷類(lèi)包括高粱、小麥、大麥、燕麥、稻米、玉米及其它類(lèi)似物。由于外肽酶能提高發(fā)酵物的感官特性(口感和/或氣味)，因而在通常的既含發(fā)芽谷物又含未發(fā)芽粗谷物(比如發(fā)芽谷物可達(dá)80％甚至90％以上，其余為未發(fā)芽谷物)的混合釀造中，按照本發(fā)明的方法加入外肽酶也是頗具優(yōu)越性的。已經(jīng)證實(shí)，利用發(fā)芽谷物、未發(fā)芽谷物或它們的混合物釀造時(shí)，這些優(yōu)點(diǎn)是很普遍的。釀造時(shí)利用外肽酶能顯著提高可自由利用性氮含量、濾過(guò)性、產(chǎn)率和感官特性的谷物都富含醇溶谷蛋白和谷蛋白組分。除高粱外，稻米也屬于此類(lèi)(其中谷蛋白含量約80％)。使用高粱時(shí)，應(yīng)注意選用那些多酚含量相對(duì)較低的品種。除加入外肽酶外，谷汁(比如為釀造啤酒用)的生產(chǎn)可按通常方法進(jìn)行。一般說(shuō)來(lái)，整個(gè)方法包括粗谷物的液化產(chǎn)生谷漿(mash)及隨后的谷漿糖化產(chǎn)生谷汁幾個(gè)步驟。在發(fā)酵前進(jìn)行過(guò)濾是很重要的。液化過(guò)程通常包括以下步驟，即先將粗谷物粉碎產(chǎn)生合適顆粒大小的面粉，然后加入一至四份優(yōu)選是三份的水進(jìn)行水化處理，最后根據(jù)所使用的內(nèi)切蛋白酶需要，選擇性地添加50至300ppm優(yōu)選是200ppm的Ca2+。嗜熱脂肪芽孢桿菌來(lái)源酶可能對(duì)Ca2+依賴(lài)性較小，因而在這種情況下不再補(bǔ)加Ca2+。經(jīng)粉碎的谷物顆粒大小應(yīng)不超過(guò)3毫米，超過(guò)1.3mm大小的顆粒應(yīng)不多于3.5％，小于0.25mm的顆粒也不多于1.5％。另外可利用的酶類(lèi)有纖維素酶、β-葡聚糖酶和/或其它一些植物細(xì)胞壁降解酶。液化培養(yǎng)基通常利用如氫氧化鈣等物質(zhì)調(diào)節(jié)pH至5-8優(yōu)選是6-7之間。重要的是在液化培養(yǎng)基中加入量至少足以部分水解谷物淀粉的α-淀粉酶(最好是熱穩(wěn)定的α-淀粉酶)及量足以部分降解蛋白質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶。使用B.A.T.S.時(shí)，其適宜用量約為0.5-2.0公斤/噸，優(yōu)選為1-1．5公斤/噸。使用BrewersProtease2000時(shí)，其酶用量要大于0.5公斤/噸谷物，優(yōu)選用量為大于1公斤/噸。使用Panstimase400時(shí)，其酶用量要大于2公斤/噸，優(yōu)選為大于5公斤/噸，最優(yōu)選為大于10公斤/噸。在液化過(guò)程中，一系列步驟通常是在較高的溫度下進(jìn)行的加入α-淀粉酶和蛋白酶后，在40-65℃，優(yōu)選是45-55℃，最優(yōu)選是50℃條件下將混合物保溫直至充分液化。保溫時(shí)間長(zhǎng)短取決于所用的谷物或谷類(lèi)混合物，通常30分鐘到2小時(shí)就足夠了。隨后，混合物溫度以不需太精確的速率逐漸升至90-95℃并在此溫度下保溫30分鐘至1小時(shí)。接著，混合物溫度降至糖化作用可允許范圍，通常是50至70℃，優(yōu)選是55-65℃，最優(yōu)選是60℃。根據(jù)糖化過(guò)程中所使用的酶的熱穩(wěn)定性的具體情況，混合物溫度也可降至稍高于70℃的范圍。當(dāng)溫度降至適宜范圍時(shí)，加入糖化酶如BrewersFermex(α-淀粉酶)或Novamyl(重組β-淀粉酶)。BrewersFermex的用量范圍通常為400克/噸至1公斤/噸。葡糖淀粉酶也較常使用。糖化反應(yīng)進(jìn)行30分鐘至2小時(shí)，隨后將溫度升至大約75-85℃范圍，并在此溫度下保溫約10分鐘以滅活酶及不需要的微生物。這一時(shí)間并非十分關(guān)鍵。由此制得的谷漿利用本領(lǐng)域熟知設(shè)備進(jìn)行過(guò)濾。使用帶Schleicher和Schuell濾紙的漏斗能有效完成過(guò)濾工作。過(guò)濾后，谷汁中加入合適的酵母進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵反應(yīng)條件取決于所使用的酵母菌株和發(fā)酵的最終目的。除釀造啤酒外，本發(fā)明還用于作為生物燃料或酒精類(lèi)飲料的酒精生產(chǎn)中。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知應(yīng)使用何種酵母株，選用何種反應(yīng)條件。制備如釀造啤酒用的谷汁時(shí)，在谷物粗品的液化步驟中加入外肽酶是非常有用的。然而，在糖化步驟中，相比于不加外肽酶，外肽酶的加入同樣具有上述優(yōu)點(diǎn)，比如能提高谷汁的FAN含量、濾過(guò)性和產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明的方法，反應(yīng)相的pH值和溫度條件應(yīng)能保證真菌類(lèi)外肽酶的活性。合適的外肽酶一般是真菌內(nèi)源酶，曲霉菌內(nèi)源酶則更為有效。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些曲霉菌包括黑曲霉、米曲霉和豆曲霉的內(nèi)源氨肽酶是非常有用的。上述敘述清楚表明，在谷汁制備過(guò)程中的液化和/或糖化步驟加入具外肽酶活性的酶類(lèi)，能生產(chǎn)具良好濾過(guò)性、高產(chǎn)率及高FAN含量的谷汁。當(dāng)釀造啤酒、生產(chǎn)酒精類(lèi)飲料(酒類(lèi))和生產(chǎn)酒精(用作生物燃料)所用的谷物中未發(fā)芽谷物占絕大部分甚至全部時(shí)，這種方法尤其吸引人。在麥芽進(jìn)口受限或費(fèi)用較高的國(guó)家，采用未發(fā)芽谷物對(duì)釀酒者們將是非常有利的。特別是在非洲，釀造啤酒通常采用含有大量高粱的谷物粗品(混和物)。另外，利用在液化或糖化步驟(或同時(shí)兩個(gè)步驟)中使用外肽酶制備的谷汁生產(chǎn)出的啤酒，其感官特性(口感和氣味)都有所提高。當(dāng)使用發(fā)芽谷物如傳統(tǒng)的大麥芽釀造啤酒或進(jìn)行混合啤酒釀造(如利用發(fā)芽和未發(fā)芽谷類(lèi)混和物)時(shí)，外肽酶的使用也明顯具有上述優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)A.熱穩(wěn)定α-淀粉酶(液化反應(yīng))根據(jù)本發(fā)明的方法，在液化步驟中使用的α-淀粉酶是一種能切割淀粉中α-1，4葡葡糖苷鍵的酶。通常選用具熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶。使用Gist-Brocades公司來(lái)自地衣芽孢桿菌的商標(biāo)名為BrewersAmyliqThermoStable(B.A.T.S)的商品酶能取得非常好的效果。B.內(nèi)切蛋白酶(液化反應(yīng))根據(jù)本發(fā)明的方法，在液化步驟中使用的內(nèi)切蛋白酶通常是能在液化步驟初期的pH和溫度條件下(pH5-6，溫度范圍45-55℃)切割蛋白質(zhì)肽鍵的酶類(lèi)。選用Gist-Brocades公司來(lái)自解淀粉芽孢桿菌的商標(biāo)名為Brewer’sProtease2000的中性蛋白酶商品能取得非常好的效果。也可使用來(lái)自弗氏鏈霉菌的蛋白水解酶，如PanstimaseSARL公司商標(biāo)名為Panstimase400的商品。C.外肽酶(液化反應(yīng)和/或糖化反應(yīng))本發(fā)明方法的液化步驟中使用的外肽酶通常是一些能切割多肽或蛋白質(zhì)的N-末端鍵的酶類(lèi)。使用來(lái)自曲霉菌種的制品能取得非常好的效果。下面將公開(kāi)一種從黑曲霉中制備氨肽酶的方法。C.1酶活性的測(cè)定外肽酶活性用亮氨酸氨肽酶單位或苯丙氨酸氨肽酶單位表示1單位亮氨酸氨肽酶(Leu-AP)為在pH7.2、20℃條件下將L-亮氨酸對(duì)硝基苯胺以1微摩爾/分鐘的速率生成對(duì)硝基苯胺所需的酶量；*苯丙氨酸氨肽酶單位1單位苯丙氨酸氨肽酶(Phe-AP)為在pH7.2、20℃條件下將L-苯丙氨酸對(duì)硝基苯胺以1微摩爾/分鐘的速率生成對(duì)硝基苯胺所需的酶量。C.1.l.苯丙氨酸氨肽酶(Phe-AP)將苯丙氨酸對(duì)硝基苯胺以0.9mM濃度溶解于7.5mMHCl中。將1ml上述溶液與1.5ml0.1M磷酸緩沖液(pH7.2)混勻。再在上述混合液中加入0.5ml酶，置于20℃條件下反應(yīng)，并將加酶時(shí)刻定為零時(shí)刻。反應(yīng)15分鐘后加入1ml1NHCl?？瞻讓?duì)照則在零時(shí)刻加入1NHCl。測(cè)定空白對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組在400納米的光密度值，分別用OD空白、OD實(shí)驗(yàn)組表示。按下述公式計(jì)算酶活性C.1.2.亮氨酸氨肽酶(Leu-AP)將亮氨酸對(duì)硝基苯胺溶解于水中至終濃度9mM。取1ml上述溶液，加入1.5ml0.1M磷酸緩沖液(pH7.2)，混勻，再在零時(shí)刻加入0.5ml酶，置于20℃條件下反應(yīng)。15分鐘后加入1ml1NHCl?？瞻讓?duì)照則在零時(shí)刻加入1NHCl。測(cè)定空白對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組在400納米的光密度值，分別用OD空白、OD實(shí)驗(yàn)組表示。按下述公式計(jì)算酶活性C.1.3.內(nèi)切蛋白酶(PU)PU的活性是利用酪蛋白在pH6.0、40℃環(huán)境下處理1小時(shí)后的水解程度來(lái)測(cè)定的。1單位PU是指殘余蛋白經(jīng)三氯乙酸沉淀后、按1微摩爾/分鐘速率產(chǎn)生酪氨酸所需酶量。C.2黑曲霉菌株的篩選從不同來(lái)源分離到的或從培養(yǎng)物保藏中心獲得的200個(gè)黑曲霉菌株置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成為土豆粉15克/升，細(xì)菌蛋白胨20克/升，酵母提取物7克/升，KH2PO44克/升，MgSO40.5克/升，CaCl20.5克/升，ZnCl20.5克/升，pH4.8。將霉菌于30℃以240轉(zhuǎn)/分速率振蕩預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，再于30℃以275轉(zhuǎn)/分速率振蕩培養(yǎng)96小時(shí)，然后收集上清，并按前面描述的方法測(cè)定亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸氨肽酶活性。如表1所示，一些黑曲霉菌株具有高水平生產(chǎn)至少其中一種酶活性的能力(表中每個(gè)數(shù)值都是4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值)。表1上述菌株中，1108號(hào)和1502號(hào)是從一個(gè)培養(yǎng)物保藏中心獲得的，其保藏號(hào)分別為NRRL3112和CBS115.39。NRRL3112株已用于淀粉葡糖苷酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的生產(chǎn)中。CBS115.39株已用于淀粉酶的生產(chǎn)工藝。C.3實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)外肽酶實(shí)施例1中描述的一些篩選菌株已用于實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐(10升)的發(fā)酵中。本例給出1502菌株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。黑曲霉菌株No.1502于30℃保溫7-10天后，收集其孢子于PDA盤(pán)中。24小時(shí)內(nèi)將其接種于裝有含20克/升葡萄糖和20克/升玉米糊培養(yǎng)基的搖瓶中。主要發(fā)酵過(guò)程按批量進(jìn)行。使用了下列營(yíng)養(yǎng)物100克/升麥芽糊精，40克/升大豆粉，40克/升水解酪蛋白，5克/升玉米糊(cornsteep)，2克/升明膠，2克/升磷酸二氫鉀，1.3克/升硝酸鈉，1克/升氯化銨，0.01克/升硫酸鐵和0.5克/升消泡劑。除麥芽糊精外其余營(yíng)養(yǎng)組分先混勻，并調(diào)節(jié)pH至4.8±0.1，然后將發(fā)酵罐于125℃滅菌40分鐘，麥芽糊精溶液?jiǎn)为?dú)滅菌再加入至無(wú)菌并已冷卻的發(fā)酵培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐內(nèi)加入6升上述培養(yǎng)基并接種至接種瓶中，進(jìn)行發(fā)酵。調(diào)節(jié)攪拌和通氣狀況以盡量提高培養(yǎng)基中溶解氧氣的濃度。將溫度維持在30℃，當(dāng)所有營(yíng)養(yǎng)物已消耗完(即大約130小時(shí))后，停止發(fā)酵。發(fā)酵液過(guò)濾以除去所有的微生物，測(cè)定濾液中氨肽酶和內(nèi)肽酶活性為0.15Leu-AP/毫升1.0Phe-AP/毫升＜0.05Val-AP/毫升＜0.1PU/毫升隨后進(jìn)行超濾濃縮以制成液體氨肽酶，并加入甘油(50％)作酶穩(wěn)定劑。由此獲得的溶液稱(chēng)為PeptidaseL2，它具有以下活性0.5Leu-AP/毫升3.2Phe-AP/毫升＜0.05Val-AP/毫升＜0.1PU/毫升這些結(jié)果表明，我們挑選的黑曲霉菌株在我們選擇的條件下產(chǎn)生的氨肽酶，其內(nèi)肽酶活性很低。C.4酶活性的pH曲線(xiàn)Leu-AP和Phe-AP活性均利用PeptidaseL2(見(jiàn)實(shí)施例2)來(lái)測(cè)定，但使用Ph值由2.5至9.0的不同緩沖液進(jìn)行測(cè)定。圖1是來(lái)源于黑曲霉的亮氨酸氨肽酶的pH曲線(xiàn)。圖2是來(lái)源于黑曲霉的苯丙氨酸氨肽酶的pH曲線(xiàn)。圖示表明亮氨酸氨肽酶的pH適宜范圍為pH5-8.5，而苯丙氨酸氨肽酶則在pH5.5-9的范圍內(nèi)具有活性，與來(lái)源于其它曲霉菌種的氨肽酶類(lèi)似。C.5酶活性的溫度曲線(xiàn)Leu-AP和Phe-AP活性均利用PeptidaseL2來(lái)測(cè)定，但使用由5-70℃范圍內(nèi)的不同保溫溫度條件。溫度曲線(xiàn)如圖3所示。結(jié)果表明兩種酶有不同的最適溫度，其中Leu-AP的最適溫度為50℃，而Phe-AP則為60℃。本文公開(kāi)了一種從黑曲霉培養(yǎng)物中生產(chǎn)氨肽酶的方法。這些氨肽酶的適宜pH范圍為pH6-8，適宜溫度范圍為50-60℃。此外，利用這種方法制備的氨肽酶，其中內(nèi)肽酶含量很低甚至檢測(cè)不到。這種方法生產(chǎn)的氨肽酶的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，其氨肽酶活性要比外切蛋白酶活性高，優(yōu)選達(dá)10倍以上，最優(yōu)選是30倍以上。D.麥芽糖淀粉酶(糖化作用)本發(fā)明方法中糖化步驟使用的淀粉酶是能切割糊精或淀粉內(nèi)α-1，4葡葡糖苷鍵產(chǎn)生以麥芽糖和/或葡萄糖為主要產(chǎn)物的一種酶。使用Gist-Brocades公司來(lái)源于米曲霉的商標(biāo)為Brewers’Fermex的商品α-淀粉酶或Novo公司來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的商標(biāo)為Novamyl的商品重組β-淀粉酶均能取得很好的效果。實(shí)施例1按生產(chǎn)啤酒的傳統(tǒng)要求粉碎高粱(FAFAFARA品種)和玉米芯，按每份谷物(含60％高粱和40％玉米芯)加入3份水的比例進(jìn)行水化處理。加入氯化鈣至液化培養(yǎng)基中Ca2+濃度為200ppm，再用Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH至6.5。按每噸谷物1.5公斤的酶量加入B.A.T.S，按表2劑量加入其它蛋白水解酶表2混合物于50℃保溫1小時(shí)，接著升溫至95℃(升溫速率為1℃/分鐘)，并在95℃下保溫45分鐘。然后在5分鐘內(nèi)將溫度降至60℃，再按600克/噸劑量加入BrewersFermex，并將谷漿于60℃糖化45分鐘。將溫度升至76℃，并在此溫度下保溫10分鐘。將谷漿倒入裝有Schleicher和Schuell濾紙的漏斗內(nèi)，測(cè)定濾過(guò)谷汁體積和比重以計(jì)算抽提率和產(chǎn)率。以甘氨酸作標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)茚三酮試劑測(cè)定其中氨基酸含量。測(cè)得的氨基酸含量值進(jìn)行校正以能與同一糖度的谷汁(12°Plato)相比較。結(jié)果如表3所示表3這些結(jié)果表明根據(jù)本發(fā)明，在方法中混合加入內(nèi)切蛋白酶和外肽酶能提高谷汁的氨基酸含量、產(chǎn)量和濾過(guò)率。實(shí)施例2在實(shí)驗(yàn)中使用與實(shí)施例1相同的釀造品進(jìn)行，但按表4采用來(lái)自解淀粉芽孢桿菌的中性蛋白酶(每噸谷物使用1.8公斤BrewersProtease2000)及來(lái)自不同曲霉菌株的外肽酶組合表4結(jié)果如表5所示表5不論所用的外肽酶為何種生物來(lái)源，所有組合的內(nèi)切蛋白酶與外肽酶均比單獨(dú)使用內(nèi)切蛋白酶效果要更好，即氨基酸含量、產(chǎn)量和濾過(guò)性都有所提高。實(shí)施例3按實(shí)施例1的方法對(duì)高粱和玉米芯進(jìn)行釀造，以控制由此制得的用于啤酒生產(chǎn)的谷汁的性質(zhì)。同時(shí)進(jìn)行另外一種釀造，這種方法中不加入酶，但以麥芽完全代替高粱。如表6所示表6結(jié)果如表7所示表7每個(gè)釀造組均通過(guò)HPLC法詳細(xì)測(cè)定其氨基酸的組成。按酵母種的吸收速率對(duì)氨基酸進(jìn)行分類(lèi)A組快速吸收B組中速吸收C組緩慢吸收結(jié)果如表8所示(由于表7采用甘氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)，而HPLC法的標(biāo)準(zhǔn)完全不同，因此本表中以毫克/升給出的NB值與表7中提供的總氨基酸含量是不相符合的)。表8每組谷汁均已煮沸45分鐘，并按無(wú)菌方法加入經(jīng)煮沸并蒸餾過(guò)的水以調(diào)節(jié)糖度為12°Plato。于不同的無(wú)菌錐形瓶中分別加入350ml經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的谷汁，再加入釀造用酵母(5克/升)。于11℃發(fā)酵8天。發(fā)酵8天后通過(guò)密度測(cè)定每組發(fā)酵谷汁的表觀(guān)衰減度(Apparentattenuation)。結(jié)果如表9所示表9與通過(guò)麥芽產(chǎn)生的谷汁相比，根據(jù)本發(fā)明的方法，將內(nèi)切蛋白酶與外肽酶組合加入至高粱能生產(chǎn)具有良好啤酒發(fā)酵能力的谷汁。令人驚奇的是，使用來(lái)自解淀粉芽孢桿菌的內(nèi)切蛋白酶與來(lái)自豆曲霉的外肽酶組合能明顯提高A組和B組氨基酸含量。實(shí)施例4本例表明，根據(jù)本發(fā)明在方法中的液化步驟加入外肽酶要比在糖化步驟中加入更具優(yōu)越性。按實(shí)施例1的方法對(duì)高粱和玉米芯進(jìn)行釀造，所有釀制組均在液化步驟加入BrewersProtease2000(1.8公斤/噸)。得自豆曲霉的外肽酶則在液化步驟(測(cè)試號(hào)1、2)或糖化步驟(測(cè)試號(hào)3、4)加入(40000Leu-AP/噸)。結(jié)果如表10所示表10通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)測(cè)定了每組試驗(yàn)中濾過(guò)體積產(chǎn)率和氨基酸含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，估計(jì)值分別為10毫升、0.5％和0.9毫克/升?？偟恼f(shuō)來(lái)，上述結(jié)果表明，在液化步驟中加入外肽酶主要能顯著提高氨基酸產(chǎn)量和濾過(guò)率。實(shí)施例5此例描述了提高米曲霉來(lái)源的外肽酶用量對(duì)釀造的影響。按實(shí)施例1的方法對(duì)高粱與玉米芯混合物進(jìn)行釀造。在液化步驟中加入BrewersProtease2000和外肽酶(表11)。表11結(jié)果如表12所示表12所用的外肽酶越多，產(chǎn)率和游離氨基酸的含量也越高。相反地，濾過(guò)率則在很低的外肽酶用量就已達(dá)到理想值。實(shí)施例6此例表示在釀造中提高黑曲霉來(lái)源的外肽酶用量產(chǎn)生的影響。按實(shí)施例1的方法對(duì)高粱和玉米芯進(jìn)行釀造。在液化步驟中加入BrewersProtease2000和外肽酶。表13結(jié)果示于表14表14結(jié)果也表明，使用的外肽酶越多，其產(chǎn)率和游離氨基酸水平也越高。結(jié)果還表明，使用米曲霉來(lái)源的外肽酶比黑曲霉來(lái)源的外肽酶效果要稍好一些。實(shí)施例7大麥(PLAISANT品種)在釀酒房中按合適的過(guò)濾壓粉碎成細(xì)面粉。用300毫升含下述物質(zhì)的水懸浮57克面粉，并于50℃保溫1小時(shí)9毫克B.A.T.S2毫克FiltraseL3000(+)(Gist-brocades公司的來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的β-糖原酶商品)4毫克BrewersProtease2000以及相應(yīng)劑量的豆曲霉來(lái)源的外肽酶。隨后溫度升至63℃(升溫速率為1℃/分鐘)，并于63℃保溫30分鐘。接著再將溫度升至90℃(升溫速率為1℃/分鐘)，并于90℃保溫20分鐘。再將釀造物冷卻至25℃并以7000g的速度離心15分鐘。最后對(duì)上清中的可溶性蛋白和游離氨基酸的含量進(jìn)行分析。結(jié)果如表15所示表15結(jié)果表明，在大麥釀造的液化步驟中加入豆曲霉來(lái)源的外肽酶，能使其中游離氨基酸含量達(dá)到麥芽釀造中的水平。實(shí)施例8按實(shí)施例7中的方法釀造大麥，但此處以黑曲霉來(lái)源外肽酶代替實(shí)施例7中豆曲霉來(lái)源的外肽酶。結(jié)果如表16所示表16盡管黑曲霉來(lái)源的外肽酶似乎比豆曲霉來(lái)源的效果要差一些，但它也能使12°Plato時(shí)的大麥汁中的氨基酸含量達(dá)到100毫克/升，這在啤酒發(fā)酵中已很令人滿(mǎn)意了。微生物保藏生產(chǎn)外肽酶所用的菌株已保存于荷蘭真菌菌種保藏中心(CentraalBureauVoorSchimmelcutures，Oosterstraat1，Baarn)，保存號(hào)分別為CBS115.39(公開(kāi)保藏中心)，CBS209.96(豆曲霉(DS8351)；保藏日期1996年2月12日)和CBS210.96(米曲霉(DS23617)；保藏日期1996年2月12日)。權(quán)利要求1．外肽酶在可發(fā)酵谷汁生產(chǎn)中的應(yīng)用。2．按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所說(shuō)的外肽酶是一種真菌類(lèi)外肽酶。3．按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所說(shuō)的外肽酶來(lái)源于一種真菌，這種真菌選自由黑曲霉、米曲霉或豆曲霉組成的真菌組中。4．按照前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述谷汁是從至少含部分未發(fā)芽谷物的材料中制得的。5．按照前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述谷汁是從未發(fā)芽高粱或未發(fā)芽大麥中制得的。6．外肽酶在提高啤酒的感官特性中的應(yīng)用。7．外肽酶在提高谷汁的濾過(guò)性中的應(yīng)用。8．一種通過(guò)酶學(xué)方法、從富含谷蛋白和/或醇溶谷蛋白的谷物中釋放可自由利用氮的方法，包括在谷物或利用所說(shuō)谷物制得的液化谷漿中加入內(nèi)切蛋白酶和外肽酶組合物的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及外肽酶在可發(fā)酵谷汁生產(chǎn)方法中的用途。所述外肽酶優(yōu)選為熱穩(wěn)定的外肽酶,如真菌類(lèi)氨肽酶,而熱穩(wěn)定的羧肽酶也是有用的。根據(jù)本發(fā)明,尤其優(yōu)選的是曲霉菌特別是黑曲霉、米曲霉和豆曲霉的內(nèi)源氨肽酶。本發(fā)明還涉及外肽酶在提交啤酒感官特性與谷汁濾過(guò)性方面的用途。本發(fā)明還涉及利用酶學(xué)方法從谷物釋放可自由利用氮的方法。文檔編號(hào)C12C7/00GK1285396SQ00121959公開(kāi)日2001年2月28日申請(qǐng)日期2000年7月27日優(yōu)先權(quán)日1996年2月12日發(fā)明者M(jìn)－P·拉羅伊,J·索比申請(qǐng)人:吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司