專利名稱：代謝產(chǎn)物的發(fā)酵制備方法及編碼sod基因的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了編碼sod基因的核苷酸序列，及用棒狀菌發(fā)酵制備核苷酸，維生素和L-氨基酸，尤其L-賴氨酸的方法，其中棒狀菌中sod基因是擴(kuò)增的。
核苷酸，維生素和L-氨基酸尤其L-賴氨酸，被用于糧食工業(yè)，動物飼料，人的內(nèi)服藥及制藥工業(yè)。
已知這些物質(zhì)可通過棒狀菌菌株，尤其谷氨酸棒狀菌發(fā)酵制備。由于這些物質(zhì)的極其重要性，對制備方法的改良進(jìn)行了持續(xù)努力。方法的改良可涉及發(fā)酵工程因素如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分，如發(fā)酵期間糖濃度，或目的在于獲得產(chǎn)物本身的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物自身的固有機(jī)能。
為改良微生物的機(jī)能，可使用誘變，選擇及突變選擇等方法。以此方法可獲得對抗代謝物有抗性或顯著調(diào)節(jié)中間體的營養(yǎng)缺陷菌株，并產(chǎn)生核苷酸，維生素及氨基酸。
一段時(shí)間以來，重組DNA工程的方法也用于谷氨酸棒狀菌生產(chǎn)L-氨基酸的菌株的改良，其通過擴(kuò)增各個氨基酸生物合成基因，并研究對L-氨基酸生產(chǎn)的影響。
US-A5,179,010闡述了如抗甲基紫精或苯甲酰過氧化物的棒狀菌菌株，其具有提高的超氧化物歧化酶活性，并具有改良的賴氨酸產(chǎn)量。這些菌株用誘變劑N-甲基-N-硝基-亞硝基胍通過非定向誘變產(chǎn)生。所述菌株中超氧化物歧化酶的濃度增加至多56％。
US-A4,529,697闡述了生產(chǎn)谷氨酸的棒狀菌突變體。此所述菌株中超氧化物歧化酶的濃度增加至多105％。
本發(fā)明的目的在于提供處理棒狀菌中超氧化物歧化酶的改良新步驟。這些步驟可用在核苷酸，維生素和L-氨基酸，尤其L-賴氨酸的發(fā)酵制備期間。
核苷酸，維生素和L-氨基酸，尤其L-賴氨酸，被用于糧食工業(yè)，動物飼料，人的內(nèi)服藥及制藥工業(yè)?，F(xiàn)有技術(shù)已知生產(chǎn)賴氨酸的棒狀菌菌株，其中超氧化物歧化酶的濃度由27％提高至56％，且釋出擴(kuò)增的賴氨酸，這些菌株通過非定向誘變獲得。
當(dāng)后文中提及L-賴氨酸或賴氨酸時(shí)，不僅指堿，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了棒狀菌來源的優(yōu)選為重組的DNA，其在棒狀微生物中可以復(fù)制，并至少含有以SEQ ID NO1表示的編碼sod基因的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了根據(jù)權(quán)利要求1的可復(fù)制的DNA，其包括(ⅰ)SEQ ID NO1所示核苷酸序列，或(ⅱ)相當(dāng)于在遺傳密碼簡并區(qū)范圍內(nèi)的(ⅰ)序列的至少一個序列；(ⅲ)與互補(bǔ)于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個序列，及任選地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
本發(fā)明還提供了通過導(dǎo)入上述可復(fù)制的DNA轉(zhuǎn)化的棒狀微生物，尤其棒狀菌菌株。
本發(fā)明另外還提供了經(jīng)發(fā)酵制備核苷酸，維生素和L-氨基酸，尤其L-賴氨酸的方法，其使用尤其已生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)物的棒狀菌，且其中編碼sod基因的核苷酸序列是擴(kuò)增的，尤其是過表達(dá)的。
文中“擴(kuò)增”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，用強(qiáng)啟動子或編碼高活性相應(yīng)酶的基因，及任選地組合這些步驟。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉，纖維素，或從甘油和乙醇中生產(chǎn)核苷酸，維生素和L-氨基酸。它們可以是棒狀菌家族，尤其棒桿菌屬成員。在棒狀菌屬尤其谷氨酸棒狀菌的情況中，應(yīng)提及的是對其生產(chǎn)L-氨基酸的能力，本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知。
適當(dāng)?shù)陌魲U菌屬，尤其谷氨酸棒狀菌菌株，例如是已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6871嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020Corynebacterium melassecola ATCC17965產(chǎn)氨短桿菌IF012072和從中制備的能生產(chǎn)核苷酸，維生素和L-氨基酸的突變體或菌株如生產(chǎn)5’-肌苷酸的菌株產(chǎn)氨棒桿菌ATCC15190產(chǎn)氨棒桿菌ATCC15454谷氨酸棒桿菌ATCC14998或如生產(chǎn)5’-鳥苷酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21171或產(chǎn)氨棒桿菌ATCC19216或如L-賴氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708
乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463和谷氨酸棒桿菌FERM-P6464谷氨酸棒桿菌DSM5714本發(fā)明人能從Corynebacterium melassecola ATCC17965中分離新的sod基因。
在此，超氧化物歧化酶蛋白用層析法首先純化為均一性，純化和制備蛋白質(zhì)的方法及指導(dǎo)，如見于Schleifer和Wensink所著教材分子生物學(xué)實(shí)用方法(Springer Verlag Berlin，德國，1981)，Harris和Angal所著手冊蛋白質(zhì)純化法實(shí)用方案(IRL Prss,Oxford,UK,1989)，Scopes所著教材蛋白質(zhì)純化原理與實(shí)踐，第3版(Springer Verlag，紐約，美國，1993)，及一般熟知的教材及手冊中的充分闡述。然后，純化的酶蛋白通過用適當(dāng)?shù)拿溉缫鹊鞍酌富蛎拥鞍酌柑幚恚鼙唤到鉃殡?。這些肽中的氨基酸序列可通過Edman所述的N-末端測序方法確定(Archives of Biochemistry 22,475,(1949))。蛋白質(zhì)測序方法及指導(dǎo)如見于Smith蛋白質(zhì)測序法分子生物學(xué)方法，第64卷和第112卷(Humana Press,Totowa,NJ，美國，1996)，和Kamp等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析制備，鑒定及微量測序(SpringVerlag，紐約，NY，美國，1997)中所述。根據(jù)復(fù)雜度，以此方式可部分或全部確定超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)中氨基酸序列。
通過利用棒狀菌密碼子的已知用途〔Malumbres等，Gene134,15-24(1993)〕，合成的寡核苷酸可被合成，并用作通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)染色體DNA區(qū)段的引物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可發(fā)現(xiàn)此方面的指導(dǎo)，參見如Gait所著寡核苷酸合成實(shí)用方法(IRL Press,Oxforc,UK,1984),和Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg，德國，1994)所述。然后將以此方式獲得的sod基因的DNA片段用已知方法克隆，如Sambrook等在分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第2版，(Cold Spring Harbor Laborctory Press,USA,1989)中所述方法，并可用作測試基因庫中包括5’和3’側(cè)翼的完整基因的探針。
基因庫的構(gòu)建見于通常熟知的教材及手冊中所述。例如以下所述的Winnacker所著教材Gene und Klone,Eine Einfuhrung in dieGentechnologie(Verlag Chemie,Weinheim，德國，1990)，或由Sambrook等所著手冊分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。非常熟知的基因庫是由Kohara等(Cell50,495-508(1987))在λ載體中構(gòu)建的E.coli K-12菌株W3110的基因庫。Bathe等(Molecular and General Genetics,252255-265,1996)闡述了谷氨酸棒狀菌ATCC13032的基因庫，其是借助于粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987，Proceedings 0f the National Academy ofSciences USA,842160-2164)在E.coli K-12菌株NM 554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中構(gòu)建的。Bormann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326)也闡述了一用粘粒pHC79(Hohn and Collins,Gene 11,291-198(1980))構(gòu)建的谷氨酸棒狀菌ATCC13032基因庫。為在E.coli中產(chǎn)生谷氨酸棒狀菌的基因庫，也可使用如pBR322(Bolivar,Life Sciences,25,807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，Gene 19259-268)等質(zhì)粒。適當(dāng)?shù)乃拗饔绕涫悄切┫拗坪椭亟M缺陷的E.coli菌株。例如由Grant等(Proceedings of the National Academyof Sciences,USA，87，(1990)4645-4649)所述的菌株DH5αmcr。然后可將借助于粘?？寺〉拈LDNA片段在目前用于測序的載體中亞克隆，然后如Sanger等(Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA,745463-5467,1977)中所述進(jìn)行測序。
然后將所得DNA序列用已知算法或序列分析程序測試，如Staden程序(核酸研究14，217-232(1986))，Bulter的GCG程序(生化分析方法39，74-97(1998))，Pearson和Lipman的FASTA算法(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85,2444-2448(1988))，或Altschul等的BLAST算法(Nature Genetics 6,119-129(1994))，并與公共可入數(shù)據(jù)庫中的登記序列相對比。公共可入核苷酸序列庫如歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國)，或國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda,MD,USA)的數(shù)據(jù)庫。
以此方式獲得的編碼sod基因的谷氨酸棒狀菌的新DNA序列是本發(fā)明的一部分，示作SEQ ID NO1。另外，相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列衍生自此DNA序列。sod基因產(chǎn)物的氨基酸序列示作SEQ IDNO2。
通過遺傳密碼的簡并產(chǎn)自SEQ ID NO1的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外保守氨基酸置換如蛋白質(zhì)中甘氨酸與丙氨酸或天冬氨酸與谷氨酸的置換，稱為“有義突變”已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，且不引起蛋白質(zhì)活性的任何基本變化，即它們是有功能的中性改變。另外，已知蛋白質(zhì)N和/或C末端的改變基本不影響甚至能穩(wěn)定其功能。關(guān)于此方面的數(shù)據(jù)參見Ben-Bassat等(Journal of Bacteriology 169751-757(1987))，O’Regan等(Gene 77237-251(1989))，Sahin-Toth等(Protein Sciences 3240-247(1994))，Hochuli等(Bio/Technology 61321-1325(1988))及關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的熟知教材。以相應(yīng)方式產(chǎn)生自SEQ ID NO2的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。
棒狀菌中sod基因的擴(kuò)增導(dǎo)致該微生物中超氧化物歧化酶濃度非同一般的增高。
為產(chǎn)生過表達(dá)，可以提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或使啟動子和位于結(jié)構(gòu)基因上游的調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以同樣方式操作。在用可誘導(dǎo)啟動子經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸期間增加表達(dá)也是可能的。通過延長mRNA的壽命也可以改良表達(dá)。另外，通過抑制酶蛋白的降解，也可擴(kuò)增酶活性。基因或基因構(gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或在染色體中整合與擴(kuò)增?；蛘撸ㄟ^修改培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)方法也可達(dá)到相關(guān)基因的過表達(dá)。
這些方法的指導(dǎo)參見于Martin等(Bio/Technology 5,137-146(1987))，Guerrero等(Gene 138,35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))，Eikmanns等(Gene 102,93-98(1991))，歐洲專利EP-B-0472 869，美國專利4,601,893,Schwarzer和Puhler(Bio/Technology 9,84-87(1991)),Reinscheid等(Applied andEnvironmenetal Microbiology 60,126-132(1994))，Labarre等(Journalof Bacteriology 175,1001-1007(1993))，專利申請WO 96/15246,Malumbres等(Gene 134,15-24(1993))，日本專利文獻(xiàn)JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering，58，191-195(1998))，Makrides(Microbiological Reviews，60512-538(1996))和遺傳及分子生物學(xué)的熟知教材中所述。
可過表達(dá)sod基因的質(zhì)粒例如是pMM23(


圖1)，其包含于菌株MH20-22B／pMM23中。質(zhì)粒pMM23是基于質(zhì)粒pBLI(Feransez-Gonzalez等，Journal of Bacteriology 176(11)，3154-3161(1994))，pACYC184(Chang和Cohen,Journal of Bacteriology 134(3),1141-1156(1978))和trc啟動子(Brosius等，Journal of BiologicalChemistry 260,3539-3541(1985))的攜帶sod基因的E．coli-谷氨酸棒狀菌穿梭載體。其它可在谷氨酸棒狀菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體如pEKEx1(Eikmanns等，Gene 10293-98(1991))或pZ8-1(歐洲專利0375889)，可以同樣方式用作克隆和表達(dá)sod基因的起始載體。
除sod基因之外，過表達(dá)特殊生物合成途徑中的一或多種酶，對核苷酸，維生素，尤其L一氨基酸的生產(chǎn)也是有益的。
因此，例如，為制備核苷酸·編碼谷氨酰胺PRPP-酰胺轉(zhuǎn)移酶的purF基因可同時(shí)過表達(dá)；·編碼氨甲酰磷酸合酶的carAB基因可同時(shí)過表達(dá)。
因此，例如，為制備D-泛酸·編碼天冬氨酸脫羧酶的panD基因(Dusch等，Applied andEnvironmental Microbiology 65,1530-1539(1999))可同時(shí)過表達(dá)。
最后，例如，為制備L-賴氨酸·編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dap基因可同時(shí)過表達(dá)(EP-B-0197335)，或·促進(jìn)S-(2-氨乙基)-半胱氨酸抗性的DNA片段可同時(shí)擴(kuò)增(EP-A 0 088 166)。
另外，除了sod基因的過表達(dá)之外，關(guān)閉非所需的副反應(yīng)對核苷酸，維生素，尤其L-氨基酸，特別是L-賴氨酸的生產(chǎn)是有益的。(Nakayama，“產(chǎn)氨基酸微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(eds.)，學(xué)術(shù)出版社，英國倫敦，1982)。
根據(jù)本發(fā)明制備的微生物可連續(xù)培養(yǎng)，或以分批法或補(bǔ)料分批法或重復(fù)補(bǔ)料分批法等分批方式培養(yǎng)，以生產(chǎn)代謝產(chǎn)物。已知培養(yǎng)法參見于Chemiel所著教材(Bioprozesstechnikl,Einfuhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))，或Storhas所著教材(Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen(ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中所述。
所利用的培養(yǎng)基必須適合特定微生物的需要。各種微生物的培養(yǎng)基的描述在美國細(xì)菌學(xué)學(xué)會(華盛頓D.CUSA,1981)的“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊”中找到?？梢岳锰荚词翘呛吞妓衔?，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪，例如大豆油，向日葵油，落花生油和椰子脂肪，脂肪酸，例如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇，例如甘油和乙醇，以及有機(jī)酸，例如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)或混合使用?？梢岳玫词怯袡C(jī)含氮化合物，如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽抽提物，玉米漿，大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物，如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨(dú)或混合使用?？梢岳玫牧自词橇姿岫溻浕蛄姿釟涠浕?qū)?yīng)的鈉鹽。培養(yǎng)基也必須含有金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵，這對生長必需的。最后，除以上提及的物質(zhì)之外，可以使用必需的促生長物質(zhì)如氨基酸和維生素。另外，合適的前體也可加入到培養(yǎng)基中。所述原料可一批加入培養(yǎng)物中，也可在培養(yǎng)過程中以合適的方式補(bǔ)加。
培養(yǎng)物的pH通過適當(dāng)使用堿性化合物，如氫氧化鈉，氫氧化鉀或氨，或酸性化合物，如磷酸或硫酸控制?？梢岳孟輨?，如脂肪酸聚乙二醇酯控制。質(zhì)粒的穩(wěn)定性可以通過向培養(yǎng)基中添加合適的選擇性作用物保持，例如抗生素。需氧條件可以通過向培養(yǎng)基中引入氧或含氧的氣體混合物保持，例如空氣。培養(yǎng)溫度通常是20℃-45℃，優(yōu)選的是25℃-40℃。繼續(xù)培養(yǎng)，直到L-氨基酸的形成達(dá)到最大值。這一目標(biāo)通常在10小時(shí)160小時(shí)之內(nèi)達(dá)到。
以下微生物根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)·E.coli菌株XL1 blue/pMM23，保藏號DSM12860·Corynebacterium melassecola菌株1019，保藏號DSM12859。
本發(fā)明的方法用于用棒狀菌經(jīng)發(fā)酵制備核苷酸，維生素，尤其L-氨基酸，特別是制備L-賴氨酸。
以下附
圖1質(zhì)粒pMM23圖附圖2質(zhì)粒pCGL482圖。
所得與堿基對數(shù)目相關(guān)的數(shù)值在可重復(fù)范圍內(nèi)。
所用縮寫解釋如下Ptrctrc啟動子；Sod超氧化物歧化酶基因；Cat氯霉素抗性基因；
Ori pBL1質(zhì)粒pBL1的復(fù)制區(qū)；Ori pACYC質(zhì)粒pACYC184的復(fù)制區(qū)；Ori M13噬菌體M13的復(fù)制區(qū)；bp堿基對；NotⅠ限制酶NotⅠ的切割點(diǎn)；XbaⅠ限制酶XbaⅠ的切割點(diǎn)；BamHⅠ限制酶BamHⅠ的切割點(diǎn)；NcoⅠ限制酶NcoⅠ的切割點(diǎn)；SalⅠ限制酶SalⅠ的切割點(diǎn)；BglⅡ限制酶BglⅡ的切割點(diǎn)；NdeⅠ限制酶NdeⅠ的切割點(diǎn)；SmaⅠ限制酶SmaⅠ的切割點(diǎn)；PstⅠ限制酶PstⅠ的切割點(diǎn)；StuⅠ限制酶StuⅠ的切割點(diǎn)；XhoⅠ限制酶XhoⅠ的切割點(diǎn)。
通過如Schmidt等(European Journal of Biochemistry 156,149-155(1986))所述在非變性凝膠電泳后經(jīng)活性染色，或如Ukeda等(Analytical Biochemistry 251(2)，206-209(1997))所述特異酶促分析，和如Laemmli(Nature 277,680-685(1970))所述SDS-PAGE分析，純化上步中的超氧化物歧化酶。通過Lowry的方法(Lowry等，Journal of Biological Chemistry 193，265-275(1951))，用牛免疫球蛋白G作標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)蛋白質(zhì)含量。
通過加入結(jié)晶硫酸銨至終飽和度為90％，將粗提物在冰上沉淀30分鐘。用BECKMAN(Palo Alto，美國)的Avanti J-25離心機(jī)和JA-25.50轉(zhuǎn)子，在10000g在4℃離心15分鐘以收集沉淀物，并棄去。將上清液調(diào)節(jié)至100％硫酸銨飽和度，并如上經(jīng)離心收集沉淀物。將粒狀沉淀溶于10ml 50mM Tris-HCl緩沖液pH8.0中。將此溶液用2L相同緩沖液透析24小時(shí)。將此蛋白質(zhì)溶液上樣于BIO-RAD(Hercules，美國)的2ml Bioscale Q2離子交換柱，用2柱體積的50mM Tris-HCl緩沖液pH8.0沖洗此柱，然后用0～0.5M NaCl線性梯度洗脫。集合活性組分，用50mM Tris-HCl緩沖液pH8.0透析。在PHARMACIA Biotech(St Quentin en Yvelines，法國)的100mlSephacryl S300柱上經(jīng)凝膠過濾分離蛋白質(zhì)。用BIO-RAD的FPLCBioLogic HR系統(tǒng)(Hercules，美國)進(jìn)行所有層析步驟。集合活性組分，并用AMICON(Epernon，F(xiàn)rance)的Centricon-30濃縮柱濃縮。最終超氧化物歧化酶溶液體積為540μl，經(jīng)Lowry方法(Lowry等，Journal of Biological Chemistry 193,265-275(1951))估算，蛋白質(zhì)濃度0.2mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE分析(Laemmli,Nature 227,680-685(1970))評價(jià)，超氧化物歧化酶是純化的，且其亞單位分子量估算為24.5kDa。
將純化的超氧化物歧化酶(10μg)從SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠切片內(nèi)分離。將蛋白質(zhì)在凝膠切片中用在200μl 0.01％TWEEN20,0.1M Tris-HCl緩沖液pH8.6中的0.2μg胰蛋白酶消化。用APPLIEDBIOSYSTEMS(Foster City，美國)的104A HPLC層析系統(tǒng)，在DEAE-C18柱上，經(jīng)線性乙腈／0.1％三氟乙酸梯度分離胰化肽。用APPLIEDBIOSYTEMS 473A測序儀(Foster City，美國)對二個分離的肽測序，這些肽具有以下序列肽15NLAFNLGGHTNHSVF肽18FQDHFNSAALGLQGS用BLAST程序(Altschul等，Journal of Molecular Biology 215,403410(1990)，將測序的肽與國立生物技術(shù)信息中心(http//www,ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)序列對比，揭示出15肽與粘性放線菌的超氧化物歧化酶(100％相同，登錄號X81381)，白喉棒桿菌(86％相同，登錄號X81382)的高度相同性，18肽與白喉棒桿菌(78％相同，登錄號X81382)和假白喉棒桿菌(73％相同，登錄號X81383)的高度相同性。2．克隆sod基因用于克隆實(shí)驗(yàn)的分子生物學(xué)技術(shù)見于Ausubel等(Ausubel等，分子生物學(xué)常用方法，John Wiley and sons，紐約，美國(1987))所述，除了當(dāng)特別提出時(shí)。通過普羅梅加公司(Madison，美國)或?qū)氺`格曼海姆法國公司(Meylan，法國)購買分子生物學(xué)產(chǎn)物，除了特別需要之外。
為克隆編碼超氧化物歧化酶的sod基因，構(gòu)建基因組DNA庫。將Corynebacterium melassecola ATCC17965在Bacto腦心浸液培養(yǎng)基上(DIFCO Laboratories，Detroit，美國)在34℃有氧生長至晚期指數(shù)期。用BECKMANN(Palo Alto，美國)的Avanti J-25離心機(jī)和JLA-10.500轉(zhuǎn)子，在4℃離心15分鐘，收集25ml培養(yǎng)物的細(xì)胞，再懸浮于3ml 10mM乙二胺四乙酸，1％葡萄糖，20mg/ml溶菌酶，25mM Tris-Cl緩沖液pH8.5中，并在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。加入6.5ml 1mM乙二胺四乙酸，0.5％十二烷基硫酸鈉，1mg/ml蛋白酶K，10mM Tris-Cl緩沖液pH7.5，并在37℃培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞裂解。向此懸浮液中加入1.8ml的5M NaCl和1.5ml的10％十六烷基溴化銨(CTAB)，0.7M NaCl溶液。在60℃培養(yǎng)20分鐘后，通過與等體積的24∶1v/v氯仿/異戊醇溶液輕度混合提取染色體DNA。將水相中的染色體DNA用0.6體積的異丙醇沉淀。用BECKMAN(PaloAlto，美國)的Avanti J-25離心機(jī)和JA-25.50轉(zhuǎn)子，在10000g在4℃離心15分鐘回收DNA沉淀物，并重懸浮于1mM EDTA,10mMTris-Cl緩沖液pH7.5中。向用適當(dāng)緩沖液稀釋的1mg染色體DNA中，加入15單位的限制酶MboⅠ，并將此混合物在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。用BECKMAN(Palo Atlo，美國)的L8-70M超離心機(jī)和SW40Ti轉(zhuǎn)子，在20℃以80000g，在10～40％w/v蔗糖梯度超離心17小時(shí)，根據(jù)大小分級分離限制消化的DNA。經(jīng)水平瓊脂糖凝膠電泳估算的大小在6～10Kb的染色體DNA片段被回收并集合。將選擇陽性克隆載體pUN121(Nilsson等，核酸研究11，8019-8030(1983))通過限制酶BclⅠ線性化。在含0.1單位T4 DNA連接酶的連接混合物中加入1μg線性的pUN121，2μg來自Corynebacterium melassecolaATCC17965的MboⅠ產(chǎn)生的染色體DNA片段，在16℃培養(yǎng)24小時(shí)。然后將此連接混合物如Bonamy等(Bonamy等，F(xiàn)EMS MicrbiologyLetters 66，263-270(1990))所述經(jīng)電穿孔用于轉(zhuǎn)化E.coli菌株DH 5α(Hananhan，Journal of Molecular Biology 166，557-580(1983))。在37℃，在含10μg/ml四環(huán)素的Bacto Luria Bertani瓊脂(DIFCOLaboratories，Detroit USA)的平板上培養(yǎng)24小時(shí)后，回收轉(zhuǎn)化體?？傻玫?0000個以上獨(dú)立轉(zhuǎn)化體克隆，由Clarke和Carbon(Clarke和Carbon,Cell 9,91-99(1976))表明任何Corynebacterium melassecola產(chǎn)生的染色體DNA片段在此DNA庫中至少出現(xiàn)一次的可能性為99.9％。將轉(zhuǎn)化體單獨(dú)挑取，并在含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的96孔微滴定平板中，在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。將所有轉(zhuǎn)化體影印鋪板于AMERSHAM(Little Chalfont，英國)的AMERSHAMHybondo-N尼龍膜上，使其在37℃生長24小時(shí)。將菌落在膜上裂解。將主微滴定平板在每個孔用25μl 80％甘油充至50μl后，貯存在-80℃，直至使用。
如Ausubel等所述(Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and sons(eds)，紐約，美國(1987))，通過與sod特異放射性探針經(jīng)DNA/DNA雜交，可篩選Corynebacteriummelassecola ATCCl7965 DNA庫中sod基因存在與否。如下制備sod特異性DNA探針?？紤]到在棒狀菌物種中高表達(dá)基因密碼偏倚指數(shù)(Malumbres等，Gene134,15-24(1993))，分別在肽15和肽18序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)簡并的寡核苷酸S1和S2。從肽DMWEHAFYL中設(shè)計(jì)另外寡核苷酸，命名為S3。這些寡核苷酸具有以下序列S15’GGCCACACCAACCACTCCGTSTT 3’S25’GAGTTGAAGTGRTCCTGGAACTT 3’S35’AGGTAGAAWGCGTGCTCCCACAT 3’(單字母密碼S=C或G，R=A或G，W=A或T)用POLYGEN有限公司的Polygen DNA合成儀(Langen，德國)合成寡核苷酸。這些寡核苷酸用于在PCR中以如前制備的Corynebacterium melassecola ATCCl7965染色體DNA作模板，擴(kuò)增DNA片段。此PCR試驗(yàn)在CrocodileⅡ微處理機(jī)控制的APPLIGENEONCOR的培養(yǎng)系統(tǒng)(Illkirch，法國)中，用Ampli Taq Gold聚合酶進(jìn)行，且其來自PERKIN ELMER(Foster City，美國)的緩沖液如下染色體DNA 30ng寡核苷酸S1 0.5μM寡核苷酸S2或S3 0.5μMAmpli Taq Gold 2.5單位10×緩沖液 5μl水 至終體積為50μl。
PCR包括在94℃保溫10分鐘，隨后進(jìn)行35次擴(kuò)增循環(huán)(在94℃變性1分鐘，在54℃退火1分鐘，在72℃聚合1分鐘/每循環(huán))。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳估算，擴(kuò)增的DNA片段大小接近從已知sod基因的核苷酸序列數(shù)據(jù)預(yù)期的大小。用寡核苷酸S1和S2擴(kuò)增提供一大約130個核苷酸的片段。用寡核苷酸S1和S3擴(kuò)增提供一大約290個核苷酸的片段。將這兩個擴(kuò)增的片段的克隆入特異的普羅梅加公司(Madison，美國)的pGEM-T載體中，以提供質(zhì)粒pMM6和pMM7。質(zhì)粒pMM6含有用S1和S2擴(kuò)增的片段，pMM7含有用S1和S3擴(kuò)增的片段。通過Sanger等所述(Sanger等，Proceedings ofthe National Academy of Science USA 74,5463-5467(1977))的雙脫氧核苷酸鏈終止法，用寡核苷酸S1作引物，對插入的片段測序。用APPLIED BIOSYSTEM(Foster City，美國)的Model 373 DNA測序系統(tǒng)進(jìn)行DNA測序。DNA序列分析證實(shí)這二個片段均相當(dāng)于超氧化物歧化酶編碼基因的片段。
用S1和S3作引物獲得的擴(kuò)增片段的起點(diǎn)通過如下Southern試驗(yàn)(Southern,Journal of Molecular Biology 98,503-517(1975))控制。將Corynebacterium melassecola ATCCl7965和E．coli DH5α(Hanahan,Jourmal of Molecular Biology 166,557-580(1983))的染色體DNA用酶HindⅢ,PstⅠ或PvuⅡ限制消化。通過水平瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，印跡于AMERSHAM(Little Chalfont，英國)的AMERSHAM Hybondo-N尼龍膜上。寡核苷酸S1和S3用于通過如前述PCR用pMM7作模板擴(kuò)增sod特異DNA片段。此片段用PHARMACIA Biotech的T7 QuickPrimeo試劑盒(St Quentin enYvelines，法國)用α32P dCTP放射標(biāo)記。如供應(yīng)商所示進(jìn)行標(biāo)記。此放射性探針與Corynebacterium melassecola ATCC17965染色體DNA特異雜交。
此標(biāo)記的DNA探針也用于篩選預(yù)先鋪板于尼龍膜上的Corynebacterium melassecola ATCC17965基因組文庫。通過此篩選，首先選擇6個菌落。從代表性菌落中分離質(zhì)粒，并進(jìn)行限制分析和PCR分析。選擇質(zhì)粒pMM8以進(jìn)一步研究。因?yàn)槠浜信c衍生自pMM7的放射性探針雜交的10kbp重組DNA片段，從中用寡核苷酸S1和S3作引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增290個核苷酸的片段。3.sod基因的測序通過Sanger等所述雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger等，Proceedings of the National Academy of Science USA 74,5463-5467(1977))，在APPLIED BIOSYSTEM(Foster City，美國)的Model373DNA測序系統(tǒng)上，對質(zhì)粒pMM8中sod基因座測序。測序起自一個方向的作為引物的寡核苷酸S1和另一方向的S3。通過“DNA行走”策略，對兩個鏈上序列完全進(jìn)行測定，從預(yù)先確定的核苷酸序列中設(shè)計(jì)新的寡核苷酸，并如前述合成。用BIOSOFT(Cambridge,UK)提供的序列處理器，Gene Jockey Ⅱ程序，對核苷酸序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。此序列示作SEQ ID NO1。由此，-603個核苷酸的主要開放讀框被鑒定。此開放讀框相當(dāng)于200個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)，此推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量計(jì)算為22,103 da,接近經(jīng)SDS-Page電泳確定的超氧化物歧化酶蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)值。(如上)。實(shí)驗(yàn)確定的肽15和肽18序列在推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列中發(fā)現(xiàn)。另外，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)與其它完全測序的超氧化物歧化酶呈廣泛相同，如與國立生物技術(shù)信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中序列對比所見。Corynebacterium melassecola ATCC17965超氧化物歧化酶示出與Nocardia asteroides(65％相同，登錄號U02341)，Mycobacterium fortuitum(63％相同，登錄號X70914)，Mycobacteriumavium(61％相同，登錄號X16453)和Mycobaterium tuberculosus(60％相同，登錄號X52861)的sod相同。實(shí)施例2 sod基因的表達(dá)1．將sod基因克隆入表達(dá)載體為表達(dá)sod基因，從pCGL482構(gòu)建表達(dá)載體pMM23。
質(zhì)粒pCGL482(圖2)是-E．coli-谷氨酸棒狀菌穿梭載體，由pACYC 184(Chang和Cohen，Journal of Bacteriology 134(3)，1141-1156(1978))的區(qū)段，pBL1(Ferandez-Gonzalez等，Journal ofBacteriology 176(11)，3154～3161(1994))，噬菌體M13的復(fù)制起點(diǎn)(Rashed和Oberer，Microbiological Review 50,401-427,(1986))，多重克隆位點(diǎn)和作為選擇標(biāo)記的pACYC184的氯霉素抗性基因組成。
將pCGL482的DNA用限制酶BamHⅠ和StuⅠ消化。用NcoⅠ和SmaⅠ消化質(zhì)粒pMM8，且通過瓊脂糖凝膠電泳分離含sod基因的0.8kbpDNA片段。將質(zhì)粒pKK388-1(Brosius,in VectorA Surrey ofmolecular cloning vectors and their uses,Rodrigez Editor,pp205-225,Butterworth Boston，美國(1988))用BamHⅠ和NcoⅠ消化，且含trc啟動子(Bosius等，Journal of Biological Chemistry 260,3539-3541(1985))的0.36kbp DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。將此三種組分混合，并用T4-DNA連接酶處理。此連接混合物用于通過如Bonamy等所述(Bonamy等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 66,263-270(1990))經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化E.coli菌株XL1-Blue(Bullock等，生物技術(shù)5,376-378(1987))。通過在補(bǔ)加氯霉素(30μg/ml)的BactoLB瓊脂上(DIFCO Laboratories,Detroit，美國)在37℃培養(yǎng)2天，以選擇轉(zhuǎn)化體。從一個單菌落中分離質(zhì)粒DNA，并命名為pMM23(
圖1)。
Corynebacterium melassecola菌株1019(保藏號DSM12859)，是衍生自菌株ATCC17965的限制缺陷突變體，將其用質(zhì)粒pCGL482和pMM23轉(zhuǎn)化，如Bonamy等所述(Bonamy等，F(xiàn)EMS MicrobiologyLetters 66,263-270(1990))。在補(bǔ)加氯霉素(6μg/ml)的Bacto腦心浸液瓊脂(DIFCO Laboratories,Detroit，美國)上，在34℃培養(yǎng)2天，選擇轉(zhuǎn)化體。2．酶測定將菌株1019,1019/pCGL482和1019/pMM23在補(bǔ)加氯霉素的Bacto腦心浸液培養(yǎng)基(DIFCO Laboratories,Detroit，美國)上有氧培養(yǎng)，在34℃將后二個菌株培養(yǎng)直至中期指數(shù)期。用HERAUSInstruments GmbH的Megafuge 1.0R離心機(jī)(Hanau，德國)，在5000g離心15分鐘收集菌株，并重懸浮于50mM磷酸鈉緩沖液pH8.0中，至經(jīng)BECKMAN的DU7400光度計(jì)(Palo Alto，美國)在波長570nm測定最終光密度為50。
用玻珠將細(xì)胞機(jī)械破壞。將1ml細(xì)胞懸浮液與1g直徑0.5mm的玻珠在2ml Eppendorf管中混合。將此懸浮液旋動2分鐘，然后在冰上培養(yǎng)2分鐘。將此步驟重復(fù)3次。將所得懸浮液用SIGMA(St.Louis，美國)的Sigma 113離心機(jī)在13000rpm至少離心15分鐘。將此上清液用于酶分析。
如Ukeda等所述(Analytical Biochemistry 251(2),206-209(1997))，用得自SIGMA-ALDRICH(St Quentin,Fallavier，法國)E.coli Mn依賴超氧化物歧化酶作標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行超氧化物歧化酶分析。通過Lowry的方法(Lowry等，Journal of Biological Chemistry193,265-275(1951))，用牛免疫球蛋白G作標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度估算。所得結(jié)果示于表1。1個酶單位指在偶聯(lián)的系統(tǒng)中用黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶在pH7.8和25℃抑制50％細(xì)胞色素C還原率的酶的量。
表1
實(shí)施例3構(gòu)建具有增強(qiáng)的超氧化物歧化酶的賴氨酸生產(chǎn)菌本領(lǐng)域已知谷氨酸棒狀菌菌株MH20-22B是賴氨酸生產(chǎn)菌，如EP-B-0435132中所述。菌株MH20-22B根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心(DSM，Braunshneig，德國)，保藏號DSM5715。
如實(shí)施例2所述，用質(zhì)粒pMM2和pCGL482轉(zhuǎn)化菌株MH20-22B，由此獲得具有增強(qiáng)的超氧化物歧化酶活性的菌株MH20-22B/pMM23和菌株MH20-22B/pCGL482。實(shí)施例4在氧化應(yīng)力下生產(chǎn)賴氨酸將菌株MH20-22B和MH20-22B/pMM23在50ml CGⅢ(Menkel等，1989，Applied and Environmental Microbiology 55684-688)中預(yù)培養(yǎng)。使用加檔板的500ml搖瓶，并在初始pH7.0，33℃在旋轉(zhuǎn)直徑50mm搖床中以250rpm培養(yǎng)19小時(shí)。將細(xì)胞用于接種在660nm光密度為0.3的主培養(yǎng)物(Biochrom Novaspec 4049,LKBInstrument GmbH,Grafelfing，德國，樣品池寬10mm)，將主培養(yǎng)物在50ml CGC(Schrumpt等，1991，Journal of Bacteriology 1734510-4516)中培養(yǎng)，此CGC通過加入5g/L玉米浸液，30g/L葡萄糖，42g/L嗎啉丙磺酸和150mg/L亮氨酸和補(bǔ)加200mg/l甲基紫精而修改。使用有檔板的500ml搖瓶，并在初始pH7.0，33℃在旋轉(zhuǎn)直徑50mm的搖床上以250rpm培養(yǎng)20小時(shí)。在發(fā)酵末期，確定賴氨酸濃度(氨基酸分析儀，Eppendorf-BioTronik,Hamburg，德國)。
在菌株MH20-22B的培養(yǎng)物中賴氨酸濃度為4.8g/L，在菌株MH20-22B/pMM23培養(yǎng)物中是6.6g/L。濃度以鹽酸賴氨酸提供。實(shí)施例5 由過氧化氫或甲基紫精所致抗氧化還原應(yīng)力抗性在滅菌和填加4ml表2所述無菌GCG-TEST培養(yǎng)基的10ml試管中，分別進(jìn)行抗性分析或存活分析。將過氧化物或甲基紫精分別加入CGC-TEST培養(yǎng)基中，以表3和表4所示濃度加入。
如實(shí)施例4所述，將菌株MH20-22B/pMM23和MH20-22B/pCGL482預(yù)培養(yǎng)。通過在15000g離心10分鐘，從培養(yǎng)肉湯中除去主要培養(yǎng)物的生物量，并用于隨后存活分析中的分析。將粒狀沉淀再懸浮于CGC-TEST培養(yǎng)基中，至D660為1.0。將0.1mL等份轉(zhuǎn)移至4ml CGC-TEST中。在初始pH7.0，37℃，以250rpm在旋轉(zhuǎn)徑25mm的搖床上，將10ml試管中培養(yǎng)物培養(yǎng)20小時(shí)。通過將適當(dāng)稀釋度的100μl等份涂布鋪板于牛心浸液瓊脂上，確定20小時(shí)樣本的菌落形成單位。
用氧化還原應(yīng)力劑過氧化氫所得結(jié)果示于表3，過氧化氫可用作在發(fā)酵中使細(xì)菌生長最佳化的氧源。
用氧化還原應(yīng)力劑甲基紫精所得結(jié)果示于表4。甲基紫精啟動超氧化物自由基的形成。
表2成分濃度右旋糖(單獨(dú)滅菌) 5g/L(NH4)2SO45g/LUrea 5g/LNH4MO7O24·H2O2g/L生物素(過濾除菌) 200μg/LKH2PO4500mg/LK2HPO4500mg/LMgSO4·7 H2O250mg/LCaCl2·2 H2O10mg/LFeSO4·7 H2O10rg/LMnSO4·H2O 10mg/LCuSO4200μg/LZnSO4·7H2O 1mg/LNiCl2·6H2O 20μg/L培養(yǎng)基用自來水制備表3MH20-22B/pCGL482MH20-22B/pMM23過氧化氫 CFU Rel.CFURel.
(g/L)(cell/mL)(cell/mL)011.0 1061.0 4.1 1061.00.03 3.1 1060.3 8.9 1062.23.00 5.0 1060.5 10.0 1062.4CFU菌落形成單位 (mL-1)Rel相對單位表4MH20-22B/pCGL482MH20-22B/pMM23甲基紫精 (mg/L) CFURel.CFU Rel.
(cell/mL) (cell/mL)08.4 1061.0 4.9 1061.02004.6 1060.5 14.0 1062.9CFU菌落形成單位 (mL-1)Rel相對單位序列表&#60110&#62德古薩-于爾斯股份公司國立科學(xué)研究中心(CNRS)&#60120&#62代謝產(chǎn)物的發(fā)酵制備方法及編碼sod基因的核苷酸序列&#60130&#62 990078 BT&#60140&#62&#60141&#62&#60160&#62 2&#60170&#62 PatentIn Ver.2.1&#60210&#62 1&#60211&#62 1143&#60212&#62 DNA&#60213&#62 Corynebacterium melassecola ATCC 17965&#60220&#62&#60221&#62 CDS&#60222&#62 (338)..(937)&#60400&#62 1ggatccggcc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa gctgtggtat ggctgtgcag 60gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg gataatgttt 120tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt gacaattaat 180catccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc 240gccgctgaga aaaagcgaag cggcactgct ctttaacaat ttatcagaca atctgtgtgg 300gcactcgacc ggaattatcg ataaggaggt ttaaacc atg gct gta tac gaa ctc 355Met Ala Val Tyr Glu Leu1 5cca gaa ctc gac tac gca tac gac gct ctc gag cca cac atc gcc gct 403Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu Pro His Ile Ala Ala10 15 20gaa atc atg gag ctt cac cac tcc aag cac cac gca acc tac gtt gca 451Glu Ile Met Glu Leu His His Ser Lys His His Ala Thr Tyr Val Ala25 30 35ggc gca aac gca gca ctc gag gca cta gag aag gca cgc gaa gag ggc 499Gly Ala Asn Ala Ala Leu Glu Ala Leu Glu Lys Ala Arg Glu Glu Gly40 45 50acc aac cct gac cag arc cgt gca ctg tcc aag aac ctt gca ttc aac 547Thr Asn Pro Asp Gln Ile Arg Ala Leu Ser Lys Asn Leu Ala Phe Ash55 60 6570crc ggt gga cac acc aac cac tcc gtt ttc tgg aag aac ctc tcc cct 595Leu Gly Gly His Thr Asn His Ser Val Phe Trp Lys Asn Leu Ser Pro75 80 85aac ggt ggc ggc gag cct acc ggc gaa ctg gct gag gct arc aac cgc 643Asn Gly Gly Gly Glu Pro Thr Gly Glu Leu Ala Glu Ala Ile Asn Arg90 95100gac ttc ggt tct ttc gct aag ttc cag gat cac ttc aac tct gca gca 691Asp Phe Gly Ser Phe Ala Lys Phe Gln Asp His Phe Asn Ser Ala Ala105 110 115crc ggc ctg cag ggc tcc ggc tgg gcg gtt crc ggc tac gac cac atc 739Leu Gly Leu Gln Gly Ser Gly Trp Ala Val Leu Gly Tyr Asp His Ile120 125 130tcc ggt cgc ctg gtt arc gag cag crc acc gac cag cag ggc aac atc 787Ser Gly Arg Leu Val Ile Glu Gln Leu Thr Asp Gln Gln Gly Asn Ile135 140 145 150tcc gtc gac arc acc cca gtt ctg atg ctc gat atg tgg gag cac gct 835Ser Val Asp Ile Thr Pro Val Leu Met Leu Asp Met Trp Glu His Ala155 160 165ttc tac ctg cag tac aag aac gtt aag gca gat tac gtc aag gct gtt 883Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Ala Asp Tyr Val Lys Ala Val170 175 180tgg aac gtc ttc aac tgg gac gac gca gca gca cgc ttc gca gca gct 931Trp Asn Val Phe Asn Trp Asp Asp Ala Ala Ala Arg Phe Ala Ala Ala185 190 195tcc aag taagcatttt tagtacgtgc aataaccact ctggtttttc cagggtggtt987Ser Lys200ttttgatgcc ctttttggag tcttcaactg ggtagcgtta ggattcacca tttccggcgg 1047gcatccggcg aaaaatggtg aatccacaca ctgttgccgg gcagtaagta cttttcgccg 1107accccgatcg ctaggccagc tgtggcaagc cccggg 1143&#60210&#62 2&#60211&#62 200&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Corynebacterium melassecola ATCC 17965&#60400&#62 2Met Ala Val Tyr Glu Leu Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu1 5 10 15Glu Pro His Ile Ala Ala Glu Ile Met Glu Leu His His Ser Lys His20 25 30His Ala Thr Tyr Val Ala Gly Ala Asn Ala Ala Leu Glu Ala Leu Glu35 40 45Lys Ala Arg Glu Glu Gly Thr Asn Pro Asp Gln Ile Arg Ala Leu Ser50 55 60Lys Asn Leu Ala Phe Asn Leu Gly Gly His Thr Asn His Ser Val Phe65 70 75 80Trp Lys Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro Thr Gly Glu Leu85 90 95Ala Glu Ala Ile Asn Arg Asp Phe Gly Ser Phe Ala Lys Phe Gln Asp100 105 110His Phe Asn Ser Ala Ala Leu Gly Leu Gln Gly Ser Gly Trp Ala Val115 120 125Leu Gly Tyr Asp His Ile Ser GIy Arg Leu Val Ile Glu Gln Leu Thr130 135 140Asp Gln Gln Gly Asn Ile Ser Val Asp Ile Thr Pro Val Leu Met Leu145 150 155 160Asp Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Ala165 170 175Asp Tyr Val Lys Ala Val Trp Asn Val Phe Asn Trp Asp Asp Ala Ala180 185 190Ala Arg Phe Ala Ala Ala Ser Lys195 200
權(quán)利要求
1．來自棒狀菌的優(yōu)選地是重組的DNA，其能在棒狀微生物中復(fù)制，并至少含有編碼sod基因的以SEQ ID NO1代表的核苷酸序列。
2．權(quán)利要求1的能復(fù)制的DNA，其包括(ⅰ)SEQ ID NO1所示核苷酸序列，或(ⅱ)至少一個在遺傳密碼簡并區(qū)內(nèi)相應(yīng)于(ⅰ)序列的序列；(ⅲ)至少一個與互補(bǔ)于序列(ⅰ)或(ⅱ)的序列雜交的序列，和任選地(ⅳ)(ⅰ)中的有功能中性有義突變。
3．衍生自權(quán)利要求1或2中的核苷酸序列的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，以SEQ ID NO2代表。
4．通過導(dǎo)入一或多個如權(quán)利要求1或2的可復(fù)制的DNA而轉(zhuǎn)化的棒狀微生物，尤其棒桿菌屬。
5．穿梭載體pMM23，特征在于
圖1所提供的限制圖譜，并保藏于E．coli中，保藏號DSM 12860。
6．一種提高棒狀菌中超氧化物歧化酶活性的方法，其中sod基因，或編碼其的核苷酸序列是擴(kuò)增的，尤其是過表達(dá)的。
7．一種通過棒狀菌發(fā)酵制備代謝產(chǎn)物，尤其L-賴氨酸的方法，其中所用細(xì)菌中sod基因或編碼其的核苷酸序列是擴(kuò)增的，尤其是過表達(dá)的。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所用細(xì)菌中，所需代謝產(chǎn)物的生物合成途徑中其它基因是擴(kuò)增的。
9．權(quán)利要求7的方法，其中所用細(xì)菌中，降低所需代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的代謝途徑至少部分被關(guān)閉。
10．權(quán)利要求7～9的方法，其中使用已用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且此質(zhì)粒載體攜帶編碼sod基因的核苷酸序列。
11．權(quán)利要求9的方法，其中使用的是用保藏于E.coli中保藏號DSM 12860的質(zhì)粒載體pMM 23轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。
12．前述一或多項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中使用產(chǎn)生核苷酸，維生素和氨基酸的棒狀菌。
13．前述一或多項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中使用的棒狀菌產(chǎn)生L-賴氨酸。
14．如權(quán)利要求8產(chǎn)生核苷酸的方法，其中編碼谷氨酰胺-PRPP-酰胺轉(zhuǎn)移酶的purF基因是同時(shí)過表達(dá)的。
15．如權(quán)利要求8制備核苷酸的方法，其中編碼氨甲酰合成酶的carAB基因是同時(shí)過表達(dá)的。
16．如權(quán)利要求8制備D-泛酸的方法，其中編碼天冬氨酸脫羧酶的panD基因是同時(shí)過表達(dá)的。
17．如權(quán)利要求8制備L-賴氨酸的方法，其中編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因是同時(shí)過表達(dá)的。
18．如權(quán)利要求8制備L-賴氨酸的方法，其中促進(jìn)S-(2-氨乙基)半胱氨酸抗性的DNA片段是同時(shí)擴(kuò)增的。
19．前述一或多項(xiàng)權(quán)利要求的經(jīng)發(fā)酵制備所需代謝產(chǎn)物的方法，其中進(jìn)行以下步驟(a)發(fā)酵產(chǎn)生所需代謝產(chǎn)物的棒狀菌，其中至少sod基因是擴(kuò)增的，(b)富集培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的所需代謝產(chǎn)物，并(c)分離所需產(chǎn)物。
20．權(quán)利要求19的經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟(a)發(fā)酵產(chǎn)生所需代謝產(chǎn)物的棒狀菌，其中至少sod基因是擴(kuò)增的，(b)富集培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的所需代謝產(chǎn)物，并(c)分離所需產(chǎn)物。
21．權(quán)利要求19的經(jīng)發(fā)酵制備D-泛酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟(a)發(fā)酵產(chǎn)生D-泛酸的棒狀菌，其中至少sod基因是擴(kuò)增的，(b)富集培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的D-泛酸，并(c)分離D-泛酸。
22．權(quán)利要求19，20或21的方法，任選地存在含氧化合物。
23．權(quán)利要求22的方法，其中含氧化合物是過氧化氫。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼sod基因的核苷酸序列,和用棒狀菌經(jīng)發(fā)酵制備核苷酸,維生素和L－氨基酸,尤其L－賴氨酸的方法,其中sod基因是擴(kuò)增的。
文檔編號C12N15/53GK1284560SQ00121279
公開日2001年2月21日 申請日期2000年8月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月13日
發(fā)明者繆瑞爾·默爾卡姆, 阿梅爾·居永瓦爾徹, 阿希姆·馬克思 申請人:德古薩－于爾斯股份公司, 國立科學(xué)研究中心