一種利用重組Bacillus subtilis分泌γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化生成L-茶氨酸的方法
【專利摘要】一種利用重組Bacillus subtilis分泌γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶來(lái)催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸的方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明擴(kuò)增枯草芽孢桿菌中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)的基因，并克隆到枯草芽孢桿菌168中的過(guò)量表達(dá)。首次構(gòu)建了一株能夠分泌γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌株，對(duì)菌株的酶活力及酶的發(fā)酵性能進(jìn)行研究：重組菌發(fā)酵上清酶活達(dá)到49.8U/mg，是出發(fā)菌株的20倍；以80mM L-谷氨酰胺為供體，640mM乙胺作為受體，L-茶氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到86％以上。本發(fā)明使用的是安全菌株，且具有轉(zhuǎn)化率高，生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，有利于在工業(yè)規(guī)模酶法生產(chǎn)L-茶氨酸的生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】-種利用重組Bac i I I us subt i I i s分泌γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 催化生成L-茶氨酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] -種利用重組Bacillus subtilis分泌的Y -谷氨酰轉(zhuǎn)化酶催化L-谷氨酰胺和 乙胺生成L-茶氨酸的方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] L-茶氨酸（N-乙基-L谷氨酸），是大量存在于茶葉中的一種天然氨基酸，最初是 由Sakato于二十世紀(jì)四十年代末期從茶葉中提取獲得。體外研究結(jié)果顯示：攝入茶氨酸有 助于減緩壓力提高認(rèn)知能力、降低癌癥和血管類疾病的發(fā)生率、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等。L-茶氨 酸已經(jīng)被美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FAD)認(rèn)證為一種安全的食品添加劑。鑒于茶氨酸上 訴諸多功效，其需求量日益增加。
[0003] L-茶氨酸的生產(chǎn)方法有：直接從自然資源中提取、化學(xué)合成和生物合成法。直接 提取法消耗大且產(chǎn)量低，并不可取。化學(xué)合成法不斷改進(jìn)，近期有學(xué)者利用乙酸酐使N-鄰 苯二甲酰-1-谷氨酸脫水生成環(huán)酐，然后再與乙胺進(jìn)行開(kāi)環(huán)反應(yīng)，最終茶氨酸產(chǎn)量可以高 達(dá)700g/kg，但是這類化學(xué)反應(yīng)合成物在消費(fèi)者看來(lái)并不安全，并且反應(yīng)過(guò)程中需要保護(hù)和 終止反應(yīng)進(jìn)程，進(jìn)一步增加成本。因此利用細(xì)菌酶系統(tǒng)合成L-茶氨酸日益受到青睞，此類 酶包括谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶和Y-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶。有學(xué)者利用硝基還原假單胞 菌IFO 12694中的谷氨酰胺酶來(lái)生產(chǎn)L-茶氨酸，然而該酶的過(guò)量表達(dá)和簡(jiǎn)捷純化體系尚 未建立，Abelian等嘗試?yán)霉潭ɑ?xì)胞來(lái)克服上訴缺點(diǎn)。來(lái)源腐臭假單胞菌Y-30的谷氨 酰胺合成酶可以轉(zhuǎn)化谷氨酸和乙胺生成L-茶氨酸，在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)量可以達(dá)到28 %，但是過(guò) 程需要發(fā)面酵母提供ATP，并且無(wú)法利用更高濃度的底物。由此Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶顯示出其 獨(dú)特的優(yōu)越性。
[0004] Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化Y -谷氨酰類化合物的Y -谷氨酰胺鍵的水解，同時(shí)將水 解生成的Y -谷氨酰分子轉(zhuǎn)移給受體分子，當(dāng)受體分子為氨基酸或者多肽時(shí)及發(fā)生轉(zhuǎn)肽反 應(yīng)，當(dāng)受體分子為水分子時(shí)，則為水解反應(yīng)。當(dāng)以L-谷氨酰胺為供體，乙胺為受體，γ -谷氨 酰轉(zhuǎn)肽酶催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)時(shí)，即可生成茶氨酸，該反應(yīng)過(guò)程耗時(shí)短，不需要額外添加 ATP，具有 諸多優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)多種微生物均可以合成GGT，例如枯草芽孢桿菌，幽門螺桿菌，短小芽孢 桿菌，米曲霉等，由以大腸桿菌中的研究為多。已有多種報(bào)道利用不同表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)Y-谷 氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因在大腸中的表達(dá)，以及將酶用于L-茶氨酸生產(chǎn)。但是大腸桿菌做為一種條 件性致病菌，用于生產(chǎn)食品添加劑存在一些隱患。但是枯草芽孢桿菌作為工業(yè)生產(chǎn)菌株卻 具有諸多優(yōu)勢(shì)：枯草芽孢桿菌是一種非致病菌；具有強(qiáng)大的蛋白表達(dá)分泌系統(tǒng)，可以將蛋 白和代謝物分泌到培養(yǎng)基中而省去細(xì)胞破碎的麻煩；枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，發(fā)酵周 期短；最后枯草芽孢桿菌本身具有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，該基因的再表達(dá)具有完整健全 的通路。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)質(zhì)粒pMA5,實(shí)現(xiàn)了 γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在Bacillus subtilis 168中的 可溶性分泌表達(dá)，酶活達(dá)到49.8U/mg。在含有80mM L-谷氨酰胺供體，640mM乙胺受體（pH 10)的混合體系中添加 GGT至0. 6U/ml，37°C反應(yīng)5小時(shí)即可生成68. 9mM的L-茶氨酸，轉(zhuǎn) 化率為86%?？莶菅挎邨U菌GGT在枯草系統(tǒng)中再次表達(dá)即用于茶氨酸合成均為首次報(bào)道， 且重組子表達(dá)的酶活及酶催化茶氨酸轉(zhuǎn)化率均較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供：通過(guò)基因工程手段來(lái)獲得具有分泌Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶能 力的微生物的方法，并利用該微生物分泌純化得到的酶實(shí)現(xiàn)催化底物L(fēng)-谷氨酰胺和乙胺 生成L-茶氨酸。對(duì)構(gòu)建的重組菌株進(jìn)行酶活力及酶轉(zhuǎn)化性能研究發(fā)現(xiàn)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 活力為出發(fā)菌的20倍左右，并且得到了較高的底物轉(zhuǎn)化率。為酶法發(fā)酵生產(chǎn)L-茶氨酸的 工業(yè)化應(yīng)用提供了有益的指導(dǎo)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案：是以基因工程為手段構(gòu)建一株具有分泌Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶能 力的B. subtilis，發(fā)酵液中純化得到的酶可以催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸。以 比色法和HPLC為方法檢測(cè)陽(yáng)性重組子發(fā)酵液的酶活以及轉(zhuǎn)化體系中產(chǎn)物的生成，通過(guò)酶 活力和發(fā)酵性能的檢測(cè)來(lái)確定其目標(biāo)酶的活力及底物轉(zhuǎn)化情況。本發(fā)明成功構(gòu)建了一株可 以實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌株，并成功將酶催化底物L(fēng)-谷氨 酰胺和乙胺高產(chǎn)L-茶氨酸，其Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活力較出發(fā)菌株有較大提高，且底物轉(zhuǎn)化 率較高。
[0008] 主要試劑：L-谷氨酰胺和乙胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，L-茶氨酸購(gòu)自生 工生物工程有限公司
[0009] 重組菌株構(gòu)建方法：
[0010] ⑴Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT)基因全序列的克隆
[0011] 根據(jù) GENBANK 網(wǎng)站公布的 Bacillus subtilis strain 168 的 ggt 基因序列 (NC_000964. 3)，以及pMA5質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)ggt基因引物。以制備的枯草芽孢桿菌 染色體DNA為模板，分別以ggt F和ggt R為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出ggt全序列。
[0012] PCR 反應(yīng)體系：10XExTaq Buffer 5yL，dNTP 4yL，模板 DM 0.5yL，上下游 引物各0.5 μ L，ExTaq酶0.5 μ L，ddH20補(bǔ)齊至總體積50 μ L。PCR反應(yīng)條件：94°C 5min， 94°C 30s，58°C 100s，72°C 2min，循環(huán) 35 次，72°C 10min，12°C lOmin。
[0013] (2)重組表達(dá)載體pMA5_ggt的構(gòu)建
[0014] 參照上海捷瑞公司膠回收試劑盒說(shuō)明書回收PCR產(chǎn)物，膠回收產(chǎn)物按一定比例與 PMD18-T vector過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，使用氨芐青霉素抗性平板篩選 重組菌，重組質(zhì)粒BamH I/Mlul酶切釋放出大小約為I. 8kb的基因條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建 成功，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-ggt。
[0015] 提取保存于Ε· coli JM109 中的質(zhì)粒pMA5和pMD18_T_ggt，質(zhì)粒pMA5、pMD18_T-ggt 經(jīng)BamH I/MluI雙酶切，膠回收純化，T4DNA連接酶過(guò)夜連接兩片段，過(guò)夜后將連接物熱擊轉(zhuǎn) 化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，使用卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒， 重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Mlul雙酶切后釋放出大小約為7. 2kb和I. 8kb的基因片段，證明重組 質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒命名為pMA5-ggt。
[0016] (3)重組質(zhì)粒pMA5-ggt化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化模式菌株Β· subtilis 168
[0017] 將經(jīng)驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pMA5_ggt用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至模式菌株 B. subtilis 168中表達(dá)。轉(zhuǎn)化方法為采用改進(jìn)的Spizizen法。
[0018] (4)重組菌株B. subtilis 168陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選；
[0019] 挑取在具有卡那霉素抗生素壓力平板上長(zhǎng)出的菌落，搖瓶發(fā)酵，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶 切驗(yàn)證。重組B. subtilis 168培養(yǎng)條件、酶活測(cè)定及HPLC分析
[0020] (1)培養(yǎng)條件：種子培養(yǎng)基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L(固體培養(yǎng)基 加入2%瓊脂粉）。優(yōu)化培養(yǎng)基：258蔗糖，58胰蛋白胨，158玉米漿，0.58 1%504*7!120和 Ig K2HPO4 · 3H20,添加卡那霉素至終濃度為50 μ g/ml，調(diào)節(jié)pH為7. 2。
[0021] (2)酶活測(cè)定方法：采用比色法測(cè)定，具體方法如下：取培養(yǎng)60h的菌液50mL， 于4°C條件下10,000r/min離心30min收集上清，上清液中即為目的蛋白。酶活測(cè)定方法 如下：1ml的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中包含50mM硼酸鹽-氫氧化鈉 （pH 10)，2. 5mM γ-L-谷氨酰 基-4-硝基苯胺，60mM雙甘二肽，750mM NaCl和10μ1適當(dāng)稀釋的酶液。37°C反應(yīng)IOmin 后添加2ml3. 5N的醋酸終止反應(yīng)，不添加雙甘二肽作為對(duì)照，410nm處測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn) 組和對(duì)照組的吸光度差值即為轉(zhuǎn)肽酶活。轉(zhuǎn)肽酶活定義為：在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，一分鐘內(nèi)由 Y -L-谷氨酰基-4-硝基苯胺經(jīng)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)生成生成1 μ mol對(duì)硝基苯胺所需要的酶量定義為 一個(gè)單位標(biāo)準(zhǔn)酶活。
[0022] (3) L-茶氨酸轉(zhuǎn)化方法：以80mM L-谷氨酰胺為供體，640mM乙胺作為受體，調(diào)節(jié) pHIO, GGT添加至濃度為0. 6U/ml，溫度37°C條件下反應(yīng)5小時(shí)，10%三氯乙酸終止反應(yīng)。 HPLC法檢測(cè)茶氨酸的生成量。
[0023] (4) HPLC分析：L-茶氨酸及在338nm紫外波長(zhǎng)下均有特征吸收峰，所以采用HPLC 法測(cè)定產(chǎn)物濃度。色譜柱條件為：X Bridge? C18 (5 μ m 4. 6x 250mm)，流動(dòng)相：緩沖液 A(5.2g/L CH3COONa. 3H20,0.1mg/L 三乙胺和 3.8mg/L 四氫呋喃，pH 7.0)，緩沖液 B(18g/L CH3COONa. 3H20,乙腈和甲醇（I: 2: 2v/v)，pH 7. 0)，檢測(cè)器：UV檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：338nm，柱 溫：40°C，進(jìn)樣量：10μ L，流速：1. Oml/min。梯度洗脫程序?yàn)椋壕彌_液A/B梯度洗脫組成為8 5:15,50:50, 0:100, 0:100, 85:15and 85:15,洗脫時(shí)間分別為 0,10, 20,23, 25and 35 分鐘。 樣品經(jīng)過(guò)OPA法柱前衍生處理。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：通過(guò)基因工程手段擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)已有的具有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽 酶活力的枯草芽孢桿菌的該酶基因，借助本實(shí)驗(yàn)室已有的成熟的枯草表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)了 Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因在模式菌株B. subtilis 168中的過(guò)量表達(dá)。將該菌株以1 %接種量 接種于50mL的優(yōu)化培養(yǎng)基中，60h后離心收集上清，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活，結(jié)果顯示酶活為 原始菌株的20倍。將上清酶液純化后用于茶氨酸轉(zhuǎn)化，以80mM L-谷氨酰胺為供體，640mM 乙胺作為受體，GGT添加量為0. 6u/ml，在pH 10溫度37°C條件下反應(yīng)5小時(shí)，L-茶氨酸生 成量為68. 9mM，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為86 %。
[0025] L-茶氨酸具有重要的生理及醫(yī)學(xué)作用，同時(shí)是一種安全的食品添加劑；用微生物 法生產(chǎn)L-茶氨酸，其較之化學(xué)生產(chǎn)法具有反應(yīng)條件溫和、原料利用率高、產(chǎn)品純度高及工 藝簡(jiǎn)單、易于控制等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)有利于環(huán)境保護(hù)，易于推廣應(yīng)用。
[0026] 具體實(shí)施方法
[0027] 實(shí)施例1 :重組B. subtilis 168菌株的構(gòu)建
[0028] 以實(shí)驗(yàn)室具有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活力的枯草芽孢桿菌作為出發(fā)菌株，以其染色體 為模板，利用PCR手段獲得該酶的基因，連接克隆載體，實(shí)現(xiàn)基因的大量擴(kuò)增。將大量擴(kuò)增 的GGT基因片段，純化后連接到pMA5載體上，驗(yàn)證成功后，轉(zhuǎn)化模式菌株枯草芽孢桿菌168。 在抗性平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種搖瓶發(fā)酵，用比色法測(cè)定發(fā)酵液中酶活，并且酶純化用 于L-茶氨酸轉(zhuǎn)化，HPLC檢測(cè)到有茶氨酸生成，說(shuō)明構(gòu)建成功了具有分泌γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 能力的重組菌株，最終成功將酶應(yīng)用與轉(zhuǎn)化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸。
[0029] 實(shí)施例2 :重組菌株的酶活力測(cè)定
[0030] 以1 %的接種量接種于50mL/250mL優(yōu)化培養(yǎng)基中，取培養(yǎng)60h的菌液，4°C條件下 10, OOOr/min離心30min收集上清，上清液中即為目的蛋白。酶活測(cè)定方法如下：1ml的標(biāo) 準(zhǔn)反應(yīng)體系中包含50mM硼酸鹽-氫氧化鈉 （pH 10)，2. 5mM γ -L-谷氨?；?4-硝基苯胺， 60mM雙甘二肽，750mM NaCl和10μ1適當(dāng)稀釋的酶液。37°C反應(yīng)IOmin后添加2ml 3. 5N 的醋酸終止反應(yīng)，以反應(yīng)體系中不添加雙甘二肽作為對(duì)照，410nm處測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)組 和對(duì)照組的吸光度差值即為轉(zhuǎn)肽酶活。轉(zhuǎn)肽酶活定義為：在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，一分鐘內(nèi)由 Y -L-谷氨?；?4-硝基苯胺經(jīng)由轉(zhuǎn)肽反應(yīng)生成生成1 μ mol對(duì)硝基苯胺所需要的酶量即為 一單位標(biāo)準(zhǔn)酶活。檢測(cè)結(jié)果顯示，重組菌株分泌酶活約為出發(fā)菌株的20倍。
[0031] 實(shí)施例3 :重組菌株分泌酶液的純化及用于茶氨酸催化生產(chǎn)
[0032] 純化方法：上清液經(jīng)0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾，使用Ni - NTA親和層析實(shí)現(xiàn)一步純化， 蛋白的清洗和洗脫程序依照說(shuō)明書規(guī)定進(jìn)行。
[0033] L-茶氨酸轉(zhuǎn)化方法：以80mM L-谷氨酰胺為供體，640mM乙胺作為受體，調(diào)節(jié)pH 10, GGT添加至濃度為0. 6U/ml，溫度37°C條件下反應(yīng)5小時(shí)，10%三氯乙酸終止反應(yīng)。HPLC 法檢測(cè)茶氨酸的生成量。檢測(cè)到68. 9mM的L-茶氨酸生成，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到86%。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組表達(dá)載體pMA5-ggt，其特征是：通過(guò)PCR技術(shù)獲得來(lái)源于枯草芽孢桿菌 168的ggt基因，與表達(dá)載體pMA5連接構(gòu)建獲得。
2. -株具有分泌谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶能力的重組枯草芽孢桿菌，其特征是：將權(quán)利要求 1中所述的重組載體pMA5-ggt，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化菌株Bacillus subtilis 168,獲得重組 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis/pMA5-ggt，重組枯草芽孢桿菌可以分泌谷氨酰轉(zhuǎn)肽 酶到發(fā)酵液上清中，同時(shí)酶活較基因來(lái)源菌有較大的提高。
3. 將權(quán)利要求2中所述的重組枯草芽孢桿菌收集測(cè)定谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的方法，其特 征是：以1 %的接種量接種于50mL/250mL優(yōu)化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60h的菌液收集菌液，4°C條 件下10, OOOr/min離心30min收集上清，上清液中即為目的蛋白，最終測(cè)得酶活為49. 8U/ mg，約為原始菌20倍。
4. 將權(quán)利要求3中收集到的粗酶液進(jìn)行純化并用于茶氨酸的轉(zhuǎn)化的方法，其特征是： 發(fā)酵液上清的Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶N末端帶有6 Xhis標(biāo)簽，可以通過(guò)和Ni - NTA親和層析實(shí) 現(xiàn)一步純化，純化的具體操作步驟按照說(shuō)明書規(guī)定進(jìn)行，得到純酶后添加于轉(zhuǎn)化體系中：包 含80mM供體L-谷氨酰胺，640mM受體乙胺的混合物中（pH 10)，至濃度0. 6U/mL，37°C反應(yīng) 5h后終止反應(yīng)，檢測(cè)到68. 9mM的L-茶氨酸生成，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到86%。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK104404075SQ201410747714
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】饒志明, 楊套偉, 張顯, 徐美娟, 貝納, 和斐 申請(qǐng)人:江南大學(xué)