專利名稱：重組人b淋巴細(xì)胞刺激因子表達(dá)載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
人B淋巴細(xì)胞刺激因子(hBLyS)是一九九九年新發(fā)現(xiàn)的一種屬于TNF超家族并與人體免疫密切相關(guān)的細(xì)胞因子；為Ⅱ型三結(jié)式跨膜蛋白，在人體內(nèi)主要由外周血單核細(xì)胞、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓等組織細(xì)胞表達(dá)，它能刺激B淋巴細(xì)胞分化、增殖，誘導(dǎo)其分泌免疫球蛋白，從而提高免疫缺乏或低下病人的自身免疫能力。體外重組hBLyS(rhBLyS)胞膜外部分的功能片段(rhsBLyS)在中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)及昆蟲細(xì)胞sf9等真核細(xì)胞中的表達(dá)已見報(bào)道；而且獲得的rhsBLyS在與anti-IgM或LPS等協(xié)同作用時(shí)，具有刺激人B淋巴細(xì)胞分化、增殖的功能。但至今國內(nèi)外尚未見到有關(guān)原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在原核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性的研究報(bào)道。因此，若能在原核系統(tǒng)表達(dá)出同樣有生物學(xué)活性的rhsBLyS，則其理論意義和實(shí)際意義都將是非常重大的。
相關(guān)技術(shù)資料1、Paul A.Moore,Omella Belvedere,Amy Orr,David W LaFleur,Ping F,Yuling L,David M.Hilbert et al.BLyS:Member of the Tumor Necrosis Family and BLymphocyte Stimulator.Science,1999,285:260～2632、Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2ed,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:35～563、Jane A.Gross,Janet Johnston,Sherri Mudri,et al.TACl and BCMA arereceptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease.Letters tonature,2000:(404)995-999本發(fā)明的目的是為了進(jìn)一步研究rhsBLyS的高級結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，為了今后運(yùn)用基因工程大量制備rhsBLyS以用于臨床及生物制藥。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到本發(fā)明包括原核表達(dá)載體pET30a(+)/hsBLyS及其構(gòu)建方法。原核表達(dá)載體pET系統(tǒng)是重組蛋白基因在E.coli中克隆和表達(dá)最有效的系統(tǒng)，在T7的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯信號控制下，靶基因克隆在pET質(zhì)粒中，T7RNA聚合酶有一定的選擇性和活性，能使幾乎所有原核細(xì)胞轉(zhuǎn)向表達(dá)靶基因，誘導(dǎo)幾個(gè)小時(shí)后，靶蛋白占細(xì)胞總蛋白的50％以上。這個(gè)系統(tǒng)在未誘導(dǎo)時(shí)，能使靶基因處于表達(dá)靜止?fàn)顟B(tài)。本發(fā)明選擇此表達(dá)載體系統(tǒng)與帶有His-Tag(親合純化組氨酸接頭)的融合表達(dá)基因(約850bp)一起，運(yùn)用基因工程分子克隆技術(shù)(具體見“載體構(gòu)建步驟”)，構(gòu)建成一個(gè)全新的原核融合表達(dá)載體pET30a(+)/hsBLyS(見


圖1)。
本發(fā)明還包括表達(dá)的融合蛋白的腸激酶酶切位點(diǎn)與His-Tag(6個(gè)組氨酸接頭)的連接位序。
本發(fā)明還包括兩對引物的設(shè)計(jì)(PCR引物及Nest-PCR引物)；引物的序列詳見“載體構(gòu)建步驟1”。
本發(fā)明運(yùn)用PCR及Nest-PCR方法，將hsBLyS的DNA片段從人胎盤cDNA文庫中擴(kuò)增出來，經(jīng)純化、測序鑒定后，運(yùn)用酶切、連接等重組手段，將所得到的融合基因(rhsBLyS)定向插入帶有His-Tag序列的原核表達(dá)載體pET-30a(+)，構(gòu)建成pET-30a(+)/hsBLyS融合表達(dá)載體；然后在大腸桿菌λDE3中高效表達(dá)；基因產(chǎn)物融合靶蛋白用本實(shí)驗(yàn)室研究制備的高效特異性Ni2+親和膠(正在申請專利，申請?zhí)枮?0112143.X)分離純化；得到帶有His-Tag的融合蛋白經(jīng)電泳鑒定后進(jìn)行生物學(xué)功能測定；結(jié)果表明，采用原核系統(tǒng)表達(dá)獲得的rhsBLyS具有刺激人B淋巴細(xì)胞增殖之功能。(載體構(gòu)建步驟如附圖3)1、引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已知hBLyS的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性的PCR引物為上游引物5′CAAACACAGATAACAGGAAATGAT3′；下游引物5′CATGGTGTAAGTAGGTCACAGCA3′；Nest-PCR引物為上游引物5′GATATCGACGACGACGACAAGGCCGTTCAGGGTCCAG 3′；下游引物5′AAGCTTGGTGTAAGTAGGTCACAGCAGTTT3′。在Nest-PCR引物中，上游引物里含有EcoRⅤ的酶切位點(diǎn)，下游引物里含有HindⅢ的酶切位點(diǎn)。
2、PCR和Nest-PCR以人胎盤cDNA文庫為模板，用上述第一對引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到hBLyS的cDNA；經(jīng)Geneclean Kit純化并克隆測序鑒定后，直接以PCR擴(kuò)增得到的hBLyS產(chǎn)物為模板，用上述第二對引物進(jìn)行Nest-PCR，擴(kuò)增得到hBLyS胞膜外部分(hsBLyS)的DNA片段，用Geneclean Kit純化并克隆測序鑒定；再克隆到PCR-Blunt載體系統(tǒng)中擴(kuò)增，然后用QINprep Plasmid Miniprep Kit純化質(zhì)粒并用HindⅢ及EcoRⅤ雙酶切；用Geneclean Kit純化后，電泳檢測所得到的純hsBLyS的DNA片段。
3、pET-30a(+)/hsBLyS質(zhì)粒的構(gòu)建將上述用PCR及Nest-PCR等方法所得到的hsBLyS的DNA片段經(jīng)純化鑒定后，克隆到pET-3a(+)載體中，構(gòu)建成能表達(dá)出帶有His-tag純化標(biāo)記的融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒。(見附
圖1)在本發(fā)明中，運(yùn)用基因工程及分子克隆等方法，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30a(+)/hsBLyS，并在大腸桿菌λDE3中表達(dá)成功。從基因工程上講，由于原核表達(dá)系統(tǒng)比真核表達(dá)系統(tǒng)簡單、方便，而且容易操作并可大量獲得所需活性蛋白；因此，本研究的成功為進(jìn)一步從基礎(chǔ)免疫學(xué)角度研究hsBLyS的受體分布、活化B細(xì)胞的信號傳播途徑、hsBLyS分子的高級結(jié)構(gòu)和各種生物學(xué)功能及作用機(jī)制形成了一個(gè)良好的開端，亦為hsBLyS的大量制備和早日應(yīng)用于臨床及免疫治療奠定了初步基礎(chǔ)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、在本發(fā)明中，運(yùn)用基因工程及分子克隆方法，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30a(+)/hsBLyS，并在大腸桿菌λDE3中表達(dá)成功。從基因工程上講，由于原核表達(dá)系統(tǒng)比真核表達(dá)系統(tǒng)簡單、方便，而且容易操作并可大量獲得所需活性蛋白；因此，本研究的成功為進(jìn)一步從基礎(chǔ)免疫學(xué)角度研究hsBLyS的受體分布、活化B細(xì)胞的信號傳播途徑、hsBLyS分子的高級結(jié)構(gòu)和各種生物學(xué)功能及作用機(jī)制形成了一個(gè)良好的開端。
2、構(gòu)建成的原核表達(dá)載體pET-30a(+)/hsBLyS可以高水平地大量制備rhsBLyS蛋白質(zhì)，提供給臨床試驗(yàn)；亦為hsBLyS的大量制備和早日用于免疫治療奠定基礎(chǔ)。這是目前真核表達(dá)系統(tǒng)所無法實(shí)現(xiàn)的。
圖1是構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-30a(+)/hsBLyS結(jié)構(gòu)2是rhsBLyS的活性測定及其與anti-IgM的協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)檢測圖從圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖示分析可得(1)與空白對照相比，單獨(dú)加入anti-IgM或者單獨(dú)加入rhsBLyS時(shí)，B淋巴細(xì)胞的增殖情況并沒有明顯的變化；而且隨著加入anti-IgM或rhsBLyS量的增加也沒有明顯的變化(數(shù)據(jù)未顯示)。
(2)在加入anti-IgM的量一定(2ul、10ul或20ul)時(shí)，隨著所加入的rhsBLyS的量增加，B細(xì)胞的增殖幅度增大；反之，在加入rhsBLyS的量一定時(shí)，隨著anti-IgM加入的量增加，B淋巴細(xì)胞的增殖幅度也增大。
圖3是原核表達(dá)載體pET-30a(+)/hsBLyS的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)步驟示意圖實(shí)施例效果檢測---表達(dá)產(chǎn)物rhsBLyS的活性檢測將上述構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌λDE3，培養(yǎng)表達(dá)后用本研究室研制的Ni2+親和層析膠純化得到純的rhsBLyS；再用純r(jià)hsBLyS配制成濃度為2mg/ml的溶液并與anti-IgM(10萬單位溶液)一起進(jìn)行B淋巴細(xì)胞活性測定(在細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行)分9個(gè)實(shí)驗(yàn)組(圖2中橫坐標(biāo))，每組三個(gè)孔，第一組為對照組(不加anti-IgM和rhsBLyS)；第二組為單加rhsBLyS組(每孔加2ul)；第三組為單加anti-IgM組(每孔加10ul)；第四組到第九組為加anti-IgM和rhsBLyS組，其中第四組每孔加2ul anti-IgM和5ul rhsBLyS，第五組每孔加10ul anti-IgM和5ul rhsBLyS，第六組每孔加20ul anti-IgM和5ul rhsBLyS，第七組每孔加2ulanti-IgM和10ul rhsBLyS，第八組每孔加10ul anti-IgM和10ul rhsBLyS，第九組每孔加20ul anti-IgM和10ul rhsBLyS。再運(yùn)用MTT法測定各組的細(xì)胞密度(圖2中縱坐標(biāo)，單位細(xì)胞數(shù)×103/毫升)。測定結(jié)果表明(見圖2)原核系統(tǒng)表達(dá)的rhsBLyS具有刺激人B淋巴細(xì)胞增殖的功能，與真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的rhsBLyS相比具有同樣的活性；并且，從圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖示分析可得(1)與空白對照相比，單獨(dú)加入anti-IgM或者單獨(dú)加入rhsBLyS時(shí)，B淋巴細(xì)胞的增殖情況并沒有明顯的變化；而且隨著加入anti-IgM或rhsBLyS量的增加也沒有明顯的變化。
(2)在加入anti-IgM的量一定(2ul、10ul或20ul)時(shí)，隨著所加入的rhsBLyS的量增加，B細(xì)胞的增殖幅度增大；反之，在加入rhsBLyS的量一定時(shí)，隨著anti-IgM加入的量增加，B淋巴細(xì)胞的增殖幅度也增大。
權(quán)利要求
1.一種重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子(hBLyS)原核表達(dá)載體pET30a(+)/rhsBLyS，其特征在于本發(fā)明采用兩對引物；包括PCR引物序列以及Nest-PCR引物的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于PCR引物序列為5′CAAACACAGATAACAGGAAATGAT3′；5′CATGGTGTAAGTAGGTCACAGCA3′。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于Nest-PCR引物序列為5′GATATCGACGACGACGACAAGGCCGTTCAGGGTCCAG3′；5′AAGCTTGGTGTAAGTAGGTCACAGCAGTTT3′
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于PCR引物以及Nest-PCR引物擴(kuò)增而獲得的融合基因(rhsBLyS)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于原核表達(dá)載體pET30a(+)/rhsBLyS在大腸桿菌DE3中表達(dá)所獲得的融合靶蛋白rhsBLyS。
6.一種重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子(hBLyS)原核表達(dá)載體pET30a(+)/rhsBLyS構(gòu)建方法，其特征在于運(yùn)用PCR及Nest-PCR方法，將hsBLyS的DNA片段從人胎盤cDNA文庫中擴(kuò)增出來，經(jīng)純化、測序鑒定后，運(yùn)用酶切、連接等重組手段，將其定向插入帶有His-Tag序列的原核表達(dá)載體pET-30a(+)，構(gòu)建成pET-30a(+)/hsBLyS融合表達(dá)載體的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于融合基因中His-Tag與腸激酶切割位點(diǎn)的設(shè)計(jì)方法以及此兩個(gè)位點(diǎn)之間的位序。
全文摘要
重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子(rhBLyS)表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明設(shè)計(jì)兩對引物,運(yùn)用PCR及Nest－PCR方法,將hsBLyS的DNA片段從人胎盤cDNA文庫中擴(kuò)增出來,經(jīng)純化、測序鑒定后,采用酶切、連接等重組手段,將所得到的融合基因(hsBLyS)定向插入帶有His－Tag序列的原核表達(dá)載體pET－30a(+),構(gòu)建成pET－30a(+)/hsBLyS融合表達(dá)載體;然后在大腸桿菌λDE3中高效表達(dá);得到基因產(chǎn)物重組融合靶蛋白(rhsBLyS)。
文檔編號C12N15/62GK1308127SQ0011909
公開日2001年8月15日 申請日期2000年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月2日
發(fā)明者張雙全, 劉平 申請人:南京師范大學(xué)