專利名稱：固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸生產(chǎn)左旋氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生化制品的生產(chǎn)方法，即固定化氨基?；饷覆鸱滞庀被嵘a(chǎn)左旋氨基酸的方法，D,L-N-乙酰基氨基酸的制取、固定化載體及固化方法、D-N-乙?；被嵬庀姆椒?。
氨基酸是指分子中既含有氨基又含有羧基的一類化合物的總稱。它是構(gòu)成生物體蛋白的基本物質(zhì)。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，氨基酸已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生化農(nóng)藥、食品調(diào)味劑及強(qiáng)化營養(yǎng)劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、皮革、日用化妝品、保健等領(lǐng)域，應(yīng)用范圍日益擴(kuò)展。
自然界賦存的氨基酸一般為左旋體，存在于動植物體中，是具有生物活性的一類。從以肽鏈形式結(jié)合的多種氨基酸構(gòu)成的生物蛋白中提取左旋氨基酸，一方面組分復(fù)雜，分離純化成單一結(jié)晶的氨基酸，工藝繁長，收率極低；另一方面，環(huán)境污染十分嚴(yán)重，因而為現(xiàn)代社會逐步淘汰。
人工合成氨基酸，產(chǎn)量大，收率高，但除甘氨酸外，均為左旋體與右旋體的混合物。右旋體氨基酸往往對生物機(jī)能產(chǎn)生毒副作用或不具備生物活性，所以，對人工合成的氨基酸往往要進(jìn)行左、右旋體的拆分，以達(dá)到一定的光學(xué)純度。
左、右旋體氨基酸由于空間結(jié)構(gòu)的不同，使平面偏振光發(fā)生相同角度、不同方向的偏轉(zhuǎn)，表現(xiàn)出各異的生物性能，但由于分子結(jié)構(gòu)一樣，故而其物理性質(zhì)沒有明顯的差異，而化學(xué)性質(zhì)完全一樣，分離左、右旋體十分困難。
本發(fā)明的目的是提供一種固定化氨基酰化水解酶高效拆分外消旋氨基酸生產(chǎn)左旋氨基酸的方法。
本發(fā)明的原理是1、D,L-N-乙酰基氨基酸的制取 2、D,L-N-乙酰基氨基酸酶拆分 CO2-CO2-OH3N-C-H++H-C-N-C-CH3RR HL-氨基酸D-N-乙?；被?、D-N-乙?；被嵬庀?本發(fā)明推出的固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸的方法步驟如下(1)弱酸性陰離子交換樹脂經(jīng)平衡后，裝柱。將氨基?；饷?市售品)制成1000～1500μ/ml水溶酶，在42～45℃以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過載體柱，進(jìn)行酶的固定化。當(dāng)固定化酶活力達(dá)到500～700μ/g載體時(shí)，固酶完畢。然后用0.15M醋酸鈉溶液洗滌。
(2)將D,L-N-乙?；被崤涑?～10％(w/w)水溶液，用Na2CO3或NH3·H2O調(diào)整溶液PH為6.5～10.0。
(3)將D,L-N-乙?；被岬孜锶芤涸?2～45℃保溫狀態(tài)下，以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過酶柱，進(jìn)行拆分。
(4)拆分液在60～70℃真空減壓濃縮至原體積的1/2～1/4，冷卻至0～5℃，攪拌結(jié)晶，分離后經(jīng)乙醇或甲醇洗滌，干燥得左旋氨基酸。
(5)調(diào)整結(jié)晶母液PH1.0～5.0，攪拌升溫后用硫酸或鹽酸調(diào)整PH1.5～5.0，靜置冷卻結(jié)晶，分離干燥得D-N-乙?；被?。
(6)將D-N-乙?；被嵊?.5～3重量份水溶解，加入其理論用量1～3倍乙酸酐，升溫至60～70℃，攪拌3-5小時(shí)，然后冷卻至0～5℃，結(jié)晶≥5小時(shí)，離心脫水后，在40～100℃干燥，得D,L-N-乙?；被?。
本方法中涉及的D,L-N-乙酰基氨基酸是按如下步驟制取的。
取一重量份的D,L-氨基酸，投入搪瓷反應(yīng)釜中，加入1-5重量份水，在攪拌狀態(tài)下，滴加其理論用量1.5～2.0倍的醋酐，控制合成溫度為25～50℃，滴加完畢后，在25～50℃保溫?cái)嚢?～10小時(shí)，置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，攪拌結(jié)晶≥5小時(shí)，離心分離，得D,L-N-乙?；被?。
本發(fā)明所涉及的固定化載體及固化方法如下(1)固定化酶載體采用弱酸性陰離子交換樹脂。
(2)將一重量份的樹脂浸泡于3重量份0.2N NaoH溶液中，靜置30小時(shí)，然后用去離子水漂洗至PH7～8，再浸泡于3重量份0.2N鹽酸溶液中，靜置30小時(shí)，然后用去離子水漂洗至PH5～6。
(3)將經(jīng)上述處理的樹脂裝柱，恒溫至43±1℃；將氨基?；饷负銣刂?3土1℃，以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速從載體柱底部向上通過；用43土1℃的去離子水通過酶柱，此時(shí)固定酶活力達(dá)到500～700μ/g載體，在43±1℃恒溫備用。
本發(fā)明所涉及的D-N-乙酰基氨基酸外消旋是按如下步驟進(jìn)行的(1)將D-N-乙?；被嵩?0～80℃條件下常壓干燥其水份≤3％。
(2)將一重量份經(jīng)干燥后的D-N-乙?；被嵬度胩虏ＡХ磻?yīng)釜中，加入1.5～3倍重量份的水溶解。
(3)加入其理論用量1～3倍乙酸酐，升溫至60～70℃，攪拌3～5小時(shí)。
(4)在攪拌狀態(tài)下，冷卻至0～5℃，結(jié)晶≥5小時(shí)。
(5)離心脫水，然后在40～100℃干燥，得D,L-N-乙酰基氨基酸。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是載體便宜，容量大，固定化酶活力高達(dá)500～700μ/g載體·h，半衰期長達(dá)240天，固定化酶再生容易；運(yùn)用本發(fā)明可拆分一切α-氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸，纈氨酸等α-氨基酸。同時(shí)，運(yùn)用本發(fā)明生產(chǎn)左旋氨基酸可以簡化反應(yīng)產(chǎn)物的提純步驟，而且收率也比可溶性自由酶高；生產(chǎn)過程中酶的成本大大下降；應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)過程可以實(shí)現(xiàn)自動化控制節(jié)省勞力；利用固定化氨基酰化水解酶連續(xù)生產(chǎn)的總成本約是利用水溶性酶的分批拆分方法的80％。
實(shí)施例1D,L-乙?；z氨酸的合成將100kgD,L-乙?；z氨酸投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入100kg水，攪拌、保溫至60℃，滴加130kg醋酐，保持合成液溫度為60±5℃，滴加完畢，在60℃保溫?cái)嚢?小時(shí)，再置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，靜置結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，干燥，得D,L-乙酰基絲氨酸133kg，收率90％。
實(shí)施例2D,L-乙?；鞍彼岬暮铣蓪?00kgD,L-蛋氨酸投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入250kg水，攪拌，在60℃滴加95kg醋酐，滴加完畢，在65℃保溫?cái)嚢?小時(shí)。再置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，靜置結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，干燥，得D,L-乙?；鞍彼?22kg，收率95％。
實(shí)施例3D,L-乙酰基精氨酸的合成將100kgD,L-精氨酸投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入100kg水，攪拌至全溶，在60℃滴加85kg醋酐，滴加完畢，在65℃保溫?cái)嚢?0小時(shí)，再置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，靜置6～8小時(shí)，離心分離，干燥，得D,L-乙?；彼?15kg，收率93％。
實(shí)施例4固定化氨基?；饷傅闹苽淙?0kg弱酸性陰離子交換樹脂，置于50L容器中，加入0.2N NaoH溶液30L，浸泡30小時(shí)，然后用去離子水漂洗至PH7～8，加入30L0.2N鹽酸溶液，浸泡30小時(shí)，用去離子水漂洗至PH6.0。
將經(jīng)上述處理的樹脂裝入直徑140m/m，高800m/m的夾層玻璃柱中，恒溫至43±1℃。
將氨基?；饷钢瞥?000～1500μ/mL酶液，恒溫至43±1℃，以500mL/min的流速勻速從載體柱底部向上通過，然后用43±1℃50升0.2N醋酸鈉溶液和50升去離子水通過酶柱，此時(shí)，固定化酶活力達(dá)到580μ/g，載體在43±1℃恒溫備用。
實(shí)施例5固定化氨基酰化水解酶拆分D,L-N-乙?；z氨酸生產(chǎn)L-絲氨酸將130kgD,L-乙酰基絲氨酸溶解于1800L水中，用Na2CO3調(diào)整PH8.0，恒溫至43±1℃，將恒溫液以125L/h流速從固定化酶柱勻速通過，流出液置于真空濃縮蒸發(fā)器中，在-0.07MPa、65℃下濃縮至原體積的30％，將濃縮料投入搪玻璃結(jié)晶釜中，于0～5℃冷卻結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，結(jié)晶體用50升乙醇浸洗，離心，在100±5℃下干燥4小時(shí)，得L-絲氨酸產(chǎn)品44kg，收率95％。
結(jié)晶母液用20％濃度鹽酸調(diào)PH1.5，在搪玻璃結(jié)晶釜中，0～5℃冷卻結(jié)晶15小時(shí)，離心分離，干燥得D-乙?；z氨酸61kg，收率94％。
將經(jīng)干燥的D-N-乙?；z氨酸60kg，投入搪玻璃反應(yīng)釜中，加入120kg水和100kg乙酸酐，升溫至60℃，攪拌5小時(shí)后，冷卻至0～5℃，結(jié)晶8小時(shí)，離心脫水，在70℃干燥4小時(shí)，得D,L-N-乙?；z氨酸55kg，收率91.7％，轉(zhuǎn)入固定化酶拆分。
實(shí)施例6固定化氨基酰化水解酶拆分D,L-N-乙?；鞍彼嵘a(chǎn)L-蛋氨酸將120kgD,L-乙?；鞍彼崛芙庥?200L水中，用NH4OH調(diào)整PH9.2，恒溫至43±1℃，將恒溫液以100L/h流速從固定化酶柱勻速通過，流出液置于真空濃縮蒸發(fā)器中，在-0.065MPa、60℃下濃縮至原體積的35％，將濃縮料投入搪玻璃結(jié)晶釜中，于0～5℃冷卻結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，結(jié)晶體用70升甲醇浸洗，離心，在100±5℃干燥6小時(shí)，得L-蛋氨酸產(chǎn)品45kg，收率96％。
結(jié)晶母液用20％濃度鹽酸調(diào)PH1.8，在搪玻璃結(jié)晶釜中，0～5℃冷卻結(jié)晶15小時(shí)，離心分離，50℃±5℃干燥8小時(shí)得D-乙酰基蛋氨酸58kg，收率97％。
將經(jīng)干燥的D-乙?；鞍彼?8kg，投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入130kg水及100kg乙酸酐，升溫至65℃，攪拌8小時(shí)，然后冷卻0～5℃，結(jié)晶12小時(shí)，離心脫水，在60℃干燥4小時(shí)，得D,L-N-乙酰基蛋氨酸54kg，收率92％，轉(zhuǎn)入固定化酶拆分。
實(shí)施例7固定化氨基?；饷覆鸱諨,L-N-乙酰基精氨酸生產(chǎn)L-精氨酸將110kgD,L-乙?；彼崛芙庥?000升水中，用NH4OH調(diào)整PH9.5，恒溫至43±1℃，將恒溫液以100L/h流速從固定化酶柱中勻速通過，流出液置于真空濃縮蒸發(fā)器中，在-0.07MPa、60℃下濃縮至原體積的25％，將濃縮料投入搪玻璃結(jié)晶釜中，于0～5℃冷卻結(jié)晶8小時(shí)，離心分離，結(jié)晶體用80升甲醇浸洗，離心，在95±5℃干燥5小時(shí)，得L-精氨酸產(chǎn)品42.5kg，收率96％。
結(jié)晶母液用20％濃度鹽酸調(diào)PH2.0，在搪玻璃結(jié)晶釜中，0～5℃冷卻結(jié)晶12小時(shí)，離心分離，60℃±5℃干燥10小時(shí)，得D-乙?；彼?2kg，收率94％。
將經(jīng)干燥的D-乙?；彼?2kg投入到搪玻璃反應(yīng)釜中，加入100kg水及100kg乙酸酐，升溫至60℃，攪拌6小時(shí)，然后冷卻至0～5℃，結(jié)晶10小時(shí)，離心脫水，在60℃干燥6小時(shí)，得D,L-N-乙?；彼?8kg，收率92％，轉(zhuǎn)入固定化酶拆分。
權(quán)利要求
1.一種固定化氨基?；饷覆鸱滞庀被岬姆椒?，其特征是(1)弱酸性陰離子交換樹脂經(jīng)平衡后，裝柱，將氨基酰化水解酶(市售品)制成1000～1500μ/ml水溶酶在42～45℃以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過載體柱，進(jìn)行酶的固定化，當(dāng)固定化酶活力達(dá)到500～700μ/g載體時(shí)，固酶完畢。(2)將D,L-N-乙?；被崤涑?～10％(w/w)水溶液，用Na2CO3或NH3·H2O調(diào)整溶液PH為6.5～10.0。(3)將D,L-N-乙?；被崴芤涸?2～45℃保溫狀態(tài)下，以0.01～0.05ml/min·g載體的流速勻速通過酶柱，進(jìn)行拆分。(4)拆分液在60～70℃真空減壓濃縮至原體積的1/2～1/4冷卻至0～5℃，攪拌結(jié)晶，分離后經(jīng)乙醇或甲醇洗滌，干燥得左旋氨基酸。(5)調(diào)整結(jié)晶母液PH1.0～5.0，攪拌，結(jié)晶，分離，干燥，得D-N-乙?；被帷?6)將D-N-乙?；被嶂频肈,L-N-乙?；被?。
2.如權(quán)利要求1所速，制備固定化氨基?；饷傅姆椒?，其特征是采用弱酸性陰離子交換樹脂作為固酶載體。
3.如權(quán)利要求1所述，制備固定化氨基?；饷傅姆椒?，其特征是使用氨基酰化水解酶，并配成活力為1000～1500μ/mL酶液，用Na2CO3或NH3·H2O調(diào)整PH6.5～10.0，在42～45℃，以0.01～0.05mL/min.g載體勻速流過酶柱。
4.如權(quán)利要求1所述，制備固定化氨基酰化水解酶的方法，其特征是當(dāng)酶被載體固定化后，用0.1～0.2M醋酸鈉溶液進(jìn)行洗滌。
5.如權(quán)利要求1所述，其特征是底物濃度為5～15％(w/w)，并用Na2CO3或NH4OH調(diào)整PH6.5～10.0。
6.如權(quán)利要求1所述，其特征是拆分溫度控制在42～45℃，底物按0.01～0.05mL/min·g載體勻速通過固定化氨基?；饷钢?br> 7.如權(quán)利要求1所速，其特征是拆分液在真空狀態(tài)下，60～70℃進(jìn)行減壓濃縮，濃縮比控制在2～4∶1。
8.如權(quán)利要求1所述的D,L-N-乙酰基氨基酸的制取步驟，特征在于取一重量分D,L-氨基酸，置于搪玻璃反應(yīng)釜中，加入1～5份水，在攪拌狀態(tài)下，滴加其理論用量1.5～2.0倍的醋酐，控制合成溫度為25～50℃，滴加完畢后，在25～50℃保溫?cái)嚢?～10小時(shí)，置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結(jié)晶促進(jìn)劑，攪拌結(jié)晶≥5小時(shí)，離心分離，得D,L-N-乙?；被?。
9.權(quán)利要求1所述的D-N-乙?；被岬幕厥辗椒ǎ卣髟谟?1)將離心分離出L-氨基酸的結(jié)晶母液投入搪玻璃反應(yīng)釜中，用10～20％濃度硫酸或25～30％濃度鹽酸調(diào)整PH1.5～5，升濕至45±5℃。(2)將上速溶液置于搪玻璃結(jié)晶釜中，冷卻靜置結(jié)晶，結(jié)晶溫度0～5℃，結(jié)晶時(shí)間≥5小時(shí)。(3)用離心機(jī)離心分離，40～100℃干燥，得D-N-乙酰基氨基酸。
10.權(quán)利要求1所述的D-N-乙?；被嵬庀?，其特征是接如下步驟進(jìn)行的(1)將D-N-乙?；被嵩?0～100℃條件下常壓干燥其水份≤3％。(2)將一重量份D-N-乙?；被嵊?.5～3重量份水溶解，加入其理論用量1～3倍乙酸酐，升溫至60～70℃，攪拌3～5小時(shí)，然后冷卻至0～5℃，結(jié)晶≥5小時(shí)，離心脫水后，在40～100℃，干燥，得D,L-N-乙?；被帷?br> 全文摘要
一種固定化氨基?；饷覆鸱滞庀被嵘a(chǎn)左旋氨基酸的方法。該方法先將自由狀態(tài)的氨基?；饷附?jīng)弱酸性陰離子交換樹脂固定后,制成固定化酶柱,另將外消旋氨基酸用醋酐N－乙?；笾瞥蒁,L－N－乙?；被?并配制成5～15%(w/w)水溶液,在42～45℃,以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過固定化酶柱,進(jìn)行酶法拆分。拆分液經(jīng)真空濃縮,冷卻結(jié)晶,分離得左旋氨基酸和D－N－乙?；被帷－N－乙?；被峤?jīng)冰乙酸外消旋后,制成D,L－N－乙?；被?按拆分參數(shù)通過固定化酶柱,進(jìn)行拆分。如此循環(huán),制得左旋氨基酸。
文檔編號C12P13/00GK1306092SQ0011323
公開日2001年8月1日 申請日期2000年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月18日
發(fā)明者覃業(yè)亞 申請人:覃業(yè)亞