專利名稱：建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法及受體體系的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法及受體體系的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域或植物基因工程領(lǐng)域。
玉米是重要的糧食兼飼料作物，通過遺傳工程技術(shù)改良玉米具有重大的意義。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有特異性狀的優(yōu)良玉米的工作已取得很大進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米也在北美和拉丁美洲大面積種植，但玉米基因工程育種的效率仍然很低，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及受體體系仍待改進(jìn)。
國內(nèi)外學(xué)者已用多種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了玉米轉(zhuǎn)基因植株，但主要工作集中在以原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍轟擊法和以農(nóng)桿菌為中介的遺傳轉(zhuǎn)化方面，部分技術(shù)已達(dá)到成熟。
80年代中后期，隨著玉米原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的成功，以原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化工作蓬勃發(fā)展。到80年代底和90年代初，用電激法和PEG(聚乙二醇)誘導(dǎo)法分別獲得了玉米轉(zhuǎn)基因植株，用陽離子誘導(dǎo)法將外源基因轉(zhuǎn)入玉米原生質(zhì)體的工作也取得成功。選用原生質(zhì)體為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，雖具有操作簡單、轉(zhuǎn)化率較高，轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生于單細(xì)胞克隆和協(xié)同轉(zhuǎn)化率較高等特點(diǎn)，但由于原生質(zhì)體再生植株受基因型限制很大，很難用生產(chǎn)上所用的骨干自交系為材料，以致無法普遍采用。
薩福特(Sanford)等于1987年用基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞獲得成功后，這一技術(shù)很快用于玉米遺傳轉(zhuǎn)化。1990年，戈登-凱姆(Gordon-Kamm)等用基因槍轟擊法將報告基因和選擇基因轉(zhuǎn)入玉米懸浮培養(yǎng)細(xì)胞并再生出植株。在這之后，先后有近20個實(shí)驗(yàn)室采用該技術(shù)獲得了玉米轉(zhuǎn)基因植株。目前，這種方法在玉米轉(zhuǎn)基因中用得較多。該方法受體廣泛，可以是外植體(幼穗、幼胚或成熟胚等)、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等，操作也相對簡單，效果較好。在國內(nèi)，王國英等(1995)用該方法將帶有Bt毒蛋白基因的質(zhì)粒導(dǎo)入玉米(獲白×萊1029)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、愈傷組織和幼胚，并由轉(zhuǎn)化愈傷組織再生出植株，部分再生植株對玉米螟有強(qiáng)的抗性，現(xiàn)已用于向骨干自交系導(dǎo)入抗蟲基因。但該方法成本高，轉(zhuǎn)化頻率欠佳，轉(zhuǎn)基因植株后代的分離世代多，且發(fā)生基因沉默的頻率高。
從八十年代末期起，許多學(xué)者致力于采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米莖尖、幼胚和培養(yǎng)細(xì)胞，取得了很大進(jìn)展。1987年，格瑞姆斯利(Grimsley)等將玉米條紋病毒基因插入去毒Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，用帶有這種Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感染玉米成功，得到了出現(xiàn)病毒感染癥狀的植株。1991年，顧德(Gould)等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米莖尖，獲得轉(zhuǎn)化植株。1992年，米歇爾(Micheal)等用同樣方法感染玉米幼胚，也得到類似的結(jié)果。1996年，日本學(xué)者石田(Ishida)等報道了用農(nóng)桿菌高頻率轉(zhuǎn)化玉米幼胚的工作，自交系A(chǔ)188轉(zhuǎn)化頻率達(dá)5～30％，而A188與其它5個自交系的雜種，轉(zhuǎn)化頻率只有0.4～4.5％。
盡管玉米轉(zhuǎn)基因研究已有大量的報道，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米已大面積推廣，但以自交系為材料再生大量轉(zhuǎn)基因植株的工作仍是玉米基因工程育種的制約環(huán)節(jié)。從大批獲得轉(zhuǎn)基因植株的角度出發(fā)，尚需建立起經(jīng)濟(jì)有效的技術(shù)體系。以我國生產(chǎn)上骨干自交系為材料，多數(shù)自交系的組織和細(xì)胞培養(yǎng)難度大，不易再生出大量植株，且再生植株自交結(jié)實(shí)更難。因此，克服基因型障礙，發(fā)展高效的玉米培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)基因技術(shù)尤為重要，是玉米基因工程育種能否高效的關(guān)鍵步驟。
本發(fā)明的目的是提供一套建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法及受體體系的應(yīng)用，它可有效地克服玉米基因型制約，而從絕大多數(shù)基因型的培養(yǎng)細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植株，且頻率高，再生植株性狀變異小，取材不受季節(jié)限制。
本發(fā)明建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法包括如下步驟①種子滅菌和萌發(fā)程序及技術(shù)，②莖尖培養(yǎng)及技術(shù)，③叢生芽組織塊的誘導(dǎo)、繼代、分化培養(yǎng)及技術(shù)，④小苗生根及技術(shù)，⑤試管苗移栽程序及技術(shù)；在以上相關(guān)培養(yǎng)中所采用的培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基即改良MS培養(yǎng)基、A培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基、D培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。
基本培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基KNO31900mg/l，NH4NO31650mg/l，CaCl2·2H2O440mg/l，MgSO4·7H2O 70mg/l，KH2PO4·H2O 170mg/l，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg/l，ZnSO4·7H2O 10mg/l，MnSO4·4H2O 22.3mg/l，H3BO310mg/l，KI 0.83mg/l，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/l，CuSO4·5H2O 0.025mg/l，CoCl2·6H2O 0.025mg/l，鹽酸硫胺素10.0mg/l，鹽酸吡哆醇1.0mg/l，煙酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30g/l，瓊脂粉7g/l，pH5.8～6.0；A培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加6-芐基嘌呤(6-BA)4.5～18.0μmol/l，用于誘導(dǎo)離體培養(yǎng)芽尖直接產(chǎn)生叢生芽；B培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加6-芐基嘌呤(6-BA)4.5～9.0μmol/l和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1.0～3.0μmol/l，用于誘導(dǎo)離體培養(yǎng)芽尖產(chǎn)生叢生芽組織塊和叢生芽組織塊繼代培養(yǎng)；C培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加6-芐基嘌呤(6-BA)4.5μmol/l和吲哚丁酸(IBA)1.8μmol/l，用于叢生芽組織塊分化小苗；D培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加6-芐基嘌呤(6-BA)2.25μmol/l和吲哚丁酸(IBA)3.6μmol/l，用于叢生芽發(fā)育成小苗；生根培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加吲哚丁酸(IBA)2.8～3.6μmol/l，用于無根小苗生根。
種子滅菌和萌發(fā)程序及技術(shù)是指套袋獲得的玉米骨干自交系和雜交種的種子，用70％乙醇浸泡10分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡10～15分鐘，然后用無菌水洗滌3～5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量(30～40毫升/250毫升三角瓶)無菌水，封口后放在黑暗條件23～30℃下1～2天。待種子萌動(露白)后，將其放在基本培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚芽伸長至3～5厘米時，剝離胚芽鞘及2～3片幼葉，切取長約5毫米左右的上胚軸及莖尖，接種到A或B培養(yǎng)基上于黑暗下(24～27℃)培養(yǎng)。
莖尖培養(yǎng)及技術(shù)是指接種在A培養(yǎng)基上的上胚軸及莖尖，培養(yǎng)3天后，胚軸有所伸長，未剝離的葉原基發(fā)育為幼葉，應(yīng)及時切去伸長的胚軸并剝?nèi)ビ兹~。剝離幼葉時應(yīng)盡量減輕對葉原基附近分生組織的損傷。6～10天后，莖尖頂端生長錐周圍和/或葉基基部分化產(chǎn)生不定芽，每部位可產(chǎn)生2～5個小芽不等，一般聚集成叢。這種結(jié)構(gòu)可在多個分生組織部位發(fā)生，每芽尖培養(yǎng)物能產(chǎn)生數(shù)十個小芽。叢生芽數(shù)量隨著培養(yǎng)時間延長而增多。一般在培養(yǎng)10～18天取叢生芽培養(yǎng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。不同基因型玉米，通過這條途徑產(chǎn)生叢生芽的能力差異很大，只有部分基因型的玉米莖尖可產(chǎn)生較多的叢生芽。
叢生芽組織塊的誘導(dǎo)、繼代、分化培養(yǎng)及技術(shù)是指接種在B培養(yǎng)基上的上胚軸及莖尖，培養(yǎng)3天后，胚軸有所伸長，及時切去伸長的胚軸。5～6天時，莖尖開始膨大，有些長出幼葉。幼葉的存在減慢了莖尖膨大速度，導(dǎo)致幼莖形成，故需及時剝離。6～10天后，莖尖開始不規(guī)則膨大生長，在膨大的分生組織上出現(xiàn)數(shù)個瘤狀或指狀突起。莖尖膨大生長后，結(jié)構(gòu)致密，質(zhì)地柔韌，呈淺黃色，局部有密集的纖毛生長。20天后，在瘤狀或指狀突起的表面開始形成不定芽及胚狀體。不定芽數(shù)目因玉米基因型而差異大。從形態(tài)上看，不定芽可分成二種類型一種具有生長點(diǎn)和葉原基分化，基部有短莖與原組織相連；另一種具有苞葉，生長點(diǎn)及葉原基被苞葉圍攏，往往成叢分布。在這種培養(yǎng)基上，多數(shù)叢生芽不能繼續(xù)發(fā)育，其分生組織繼續(xù)膨大后產(chǎn)生次生不定芽。
小苗生根及技術(shù)是指將叢生芽塊切開，每塊有小芽2～3個，放在D培養(yǎng)基上生長。小芽生長于照光下，光強(qiáng)2000～3000 lx，光照14～15小時/天。小苗長到3～4片葉時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。培養(yǎng)15天左右，約40％的苗產(chǎn)生新根。對于未生根苗，切傷其基部，轉(zhuǎn)移到新的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天后大多數(shù)植株產(chǎn)生根系。
試管苗移栽程序及技術(shù)是指生根苗洗去培養(yǎng)基后，移栽到以蛭石為栽培介質(zhì)的花盆中生長。植株在自然光照下生長，日溫22～28℃，夜溫15～21℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分。生長2周左右，移植苗產(chǎn)生發(fā)達(dá)根系，然后定植于田間。
以上所限定的玉米轉(zhuǎn)基因受體體系均可選用基因槍轟擊法、超聲波處理法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并通過加壓篩選獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及叢生芽塊，進(jìn)而再生出轉(zhuǎn)基因植株。
在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因時，受體以選用繼代后培養(yǎng)10～18天的玉米叢生芽或叢生芽塊為最佳。
在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因時，受體以選用繼代后培養(yǎng)13～20天的玉米叢生芽組織塊為最佳。
本發(fā)明利用建立的玉米轉(zhuǎn)基因受體體系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用(一)以農(nóng)桿菌為中介進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化將帶有雙元載體(Mini--Ti質(zhì)粒帶有潮霉素抗性基因)的根瘤農(nóng)桿菌(如AGLO和LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH7.0，熱壓滅菌)中28℃下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min(轉(zhuǎn)/分)，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用改良1/2MS液體培養(yǎng)基(即改良MS培養(yǎng)基基本成分減半)洗滌，再離心收集。再將菌體用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol/l的1/2改良MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5～20倍用于轉(zhuǎn)化。
1、以叢生芽為受體1)取在A培養(yǎng)基上培養(yǎng)12天左右的叢生芽塊，切割后放入含乙酰丁香酮100μmol/l的1/2改良MS液體培養(yǎng)基懸浮的菌液中浸染3～5分鐘。
2)浸染后的叢生芽塊用無菌濾紙吸干，放在A培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)10天。培養(yǎng)溫度為22～26℃。
3)將叢生芽塊轉(zhuǎn)入加有頭孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧芐青霉素(Carb)500mg/l的A培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)10～15天，抑制細(xì)菌生長。
4)將抑菌后的叢生芽塊轉(zhuǎn)入加有選擇劑潮霉素的A培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每12天繼代培養(yǎng)一次，選擇存活材料塊轉(zhuǎn)移。篩選3代(36天左右)后，只有少數(shù)叢生芽塊存活，且長勢不佳。將它們轉(zhuǎn)移到無選擇劑的A培養(yǎng)基后，才能長出健壯小苗。
5)小苗長到3～4片葉時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。根系發(fā)達(dá)的植株移栽到花盆成活后，取葉片進(jìn)行分子生物學(xué)檢測確定轉(zhuǎn)基因植株。約40％左右的植株為轉(zhuǎn)基因個體。
2、以叢生芽組織塊為受體1)取在B培養(yǎng)基上繼代后培養(yǎng)15天左右的叢生芽組織塊，切割后浸入用添加100μmol/l乙酰丁香酮的1/2改良MS液體培養(yǎng)基懸浮的菌液中3～5分鐘。
2)浸染后的叢生芽組織塊用無菌濾紙吸干，放在B培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)10天。培養(yǎng)溫度為22～26℃。
3)將叢生芽組織塊轉(zhuǎn)入加有頭孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧芐青霉素(Carb)500mg/l的B培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)10～15天，抑制細(xì)菌生長。
4)將抑菌后的叢生芽組織塊轉(zhuǎn)入加有選擇劑潮霉素B 20mg/l的B培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，12天時繼代培養(yǎng)一次。再將存活的組織塊轉(zhuǎn)移到加有潮霉素B 20mg/l的C培養(yǎng)基上再篩選一代。在篩選培養(yǎng)中絕大多數(shù)組織塊逐漸變褐死亡。將存活的組織塊轉(zhuǎn)移到無選擇劑的C培養(yǎng)基上產(chǎn)生叢生芽。
5)當(dāng)篩選后的組織塊分化出大量的叢生芽時，分割后轉(zhuǎn)移到D培養(yǎng)基上。待小苗長到3～4厘米高時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。根系發(fā)達(dá)的植株移栽到花盆，成活后取葉片進(jìn)行分子生物學(xué)檢測確定轉(zhuǎn)基因植株。約半數(shù)組織塊再生的植株為轉(zhuǎn)基因個體。
(二)采用基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化叢生芽組織塊1、DNA包裹微彈和基因槍轟擊1)從宿主菌中提取帶有目標(biāo)基因的質(zhì)粒并進(jìn)行純化，提取和純化采用標(biāo)準(zhǔn)程序及方法(參見《分子克隆》第二版[美]J.薩姆布魯克等 科學(xué)出版社 1996年)。質(zhì)粒質(zhì)量為OD260/OD280在1.7～1.8之間。質(zhì)粒DNA濃度稀釋為1μg/μl，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)稱取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一個離心管中，加入1ml 70％乙醇劇烈渦旋3～5分鐘，然后靜置15分鐘，室溫下15000rpm離心5秒后去除上清液。
3)加1ml無菌水，劇烈渦旋1分鐘，靜置1分鐘，室溫下15000rpm離心5秒后去除上清液。此步驟重復(fù)3次。
4)第三次洗滌后的金粉，加50μl 50％滅菌甘油(終濃度為60mg/ml微彈。該制備液室溫可貯存2周)。
5)使用時渦旋5分鐘打破金粉凝集。
6)分散后金粉依次加入5μl質(zhì)粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl2、20μl0.1M亞精胺，邊旋渦邊加樣。
7)繼續(xù)旋渦2～3分鐘，靜置1分鐘。
8)15000rpm離心2秒后棄上清液，加140μl 70％乙醇。
9)靜置沉淀，15000rpm離心2秒后棄上清液。
10)加48μl無水乙醇，輕彈管壁數(shù)次，低速下渦旋2～3秒，然后取樣加在微彈載體上。微彈用量為每彈0.5mg。
11)在直徑9cm的培養(yǎng)皿中倒入0.4cm厚的B培養(yǎng)基，然后將叢生芽組織塊(0.5～0.7cm大小，繼代培養(yǎng)后16天左右)高密度放入培養(yǎng)皿中。
12)用基因槍轟擊叢生芽組織塊，每皿轟擊一次。轟擊參數(shù)取可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8cm，微彈飛行距離6～9cm。其它參數(shù)按使用說明書取值。
2、轉(zhuǎn)化后材料的篩選和培養(yǎng)1)轟擊后材料在暗中恢復(fù)培養(yǎng)2～3天，然后將材料轉(zhuǎn)入成分不變的新培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。此期叢生芽組織塊生長良好，轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因得到充分表達(dá)。
2)將材料轉(zhuǎn)入加有選擇劑(抗生素或除草劑)的B培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。連續(xù)篩選三代，每代15天。在第一次篩選過程中叢生芽組織塊有少數(shù)不再膨大，變褐死亡；大多數(shù)繼續(xù)龐大但結(jié)構(gòu)疏松，顏色變暗，原來生長良好、結(jié)構(gòu)致密呈淺黃色的叢生芽組織塊在接觸培養(yǎng)基的部分開始變成褐色，其它部分則繼續(xù)膨大，有瘤狀或指狀突起形成，15天時進(jìn)行第二次篩選。在以后的篩選培養(yǎng)過程中，死亡的組織塊逐漸增多，組織塊膨大速度明顯減慢。繼續(xù)篩選三代后，叢生芽組織塊成活率為11～15％。
3、轉(zhuǎn)基因植株的再生從選擇培養(yǎng)基上挑選出三代篩選后存活的組織塊轉(zhuǎn)移到C培養(yǎng)基上分化小苗。一些組織塊在轉(zhuǎn)入C培養(yǎng)基后20～30天時死亡，另一些組織塊一月后逐漸變成綠色，但沒有分化出苗，隨后逐漸死亡。這些材料可能在篩選過程中喪失胚性。僅有少數(shù)組織塊轉(zhuǎn)入分化C培養(yǎng)基7～10天后分化出小芽，后者在D培養(yǎng)基上生長半月后發(fā)育成小苗。
小苗長到2～3厘米高時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。轉(zhuǎn)基因小苗對誘導(dǎo)生根的反應(yīng)同未轉(zhuǎn)基因植株的。轉(zhuǎn)基因植株的移栽和田間管理同普通試管苗。
本發(fā)明中，莖尖是指十到幾十微米的莖尖分生組織(shoot meristem)和大到幾十毫米的芽端(shoot tip)；而莖尖分生組織是指頂端生長錐及其鄰近的葉原基。
本發(fā)明中，基因槍轟擊法(particle bombardment)是籍高速度的金屬微粒將核酸分子引入活細(xì)胞中的一種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。最初是美國康乃爾大學(xué)薩福特(Sanford)等研制成功的火藥基因槍及轉(zhuǎn)化技術(shù)，此后有不同學(xué)者研制出的多種基因槍及不斷改進(jìn)的轉(zhuǎn)化技術(shù)。本發(fā)明研究中所用的基因槍為美國Bio-RAD公司產(chǎn)品，型號為Biolistic PDS--1000/He Particle Delivery System。按使用說明書操作。轟擊參數(shù)為可裂圓片與載體的距離為2.5厘米，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8厘米，氦氣壓力為1100psi，真空度28inchHg，微彈飛行距離在3～9厘米間取值。
本發(fā)明中，超聲波(2×104Hz的聲波)遺傳轉(zhuǎn)化法是指由許寧等于1990年建立的，張宏等進(jìn)一步發(fā)展的適合于玉米幼胚和愈傷組織的高效轉(zhuǎn)化方法。
本發(fā)明中，農(nóng)桿菌(A..tumefaciens)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化程序基本上同石田(Ishida)等報道的。在轉(zhuǎn)染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)等酚類化合物和中性單糖(葡萄糖、木糖)，玉米叢生芽和叢生芽組織塊放在懸浮農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)染液中浸染3～8分鐘，然后在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)7～12天。轉(zhuǎn)化體在含有適宜的抗生素培養(yǎng)基上抑菌，在加有選擇劑的培養(yǎng)基上篩選，然后在分化培養(yǎng)基上分化。
本發(fā)明中，叢生芽組織塊(multiple shoot clumps)是指大量叢生芽和胚狀體組成的組織塊，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上可再生出大量植株。
本發(fā)明能大幅度減少基因型障礙，可從絕大多數(shù)骨干自交系中高效獲得轉(zhuǎn)基因植株，且再生植株體細(xì)胞無性系變異小，多數(shù)植株生長發(fā)育正常，能自交結(jié)實(shí)。同胚性愈傷組織和幼胚為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的技術(shù)路線相比較，本發(fā)明的特點(diǎn)在于1)能從絕大多數(shù)基因型玉米的培養(yǎng)細(xì)胞再生出植株，2)培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化頻率較高，3)取材不受季節(jié)限制，4)轉(zhuǎn)基因植株絕大多數(shù)能保持原基因型的特征特性，無需進(jìn)行多代回交才能培育出優(yōu)良自交系。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明實(shí)施例1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米骨干自交系的遺傳轉(zhuǎn)化和抗刺吸式昆蟲的植株再生1、材料1)玉米骨干自交系515的自交種子。
2)農(nóng)桿菌A815(RSs-1-GNA in AGLO)。該菌株含有雙元載體系統(tǒng)，其Mini--Ti質(zhì)粒的T--DNA區(qū)含有嵌合的雪花蓮凝集素(GNA)基因和潮霉素(Hygro-mycin)抗性基因。前者在單子葉植物中能高效表達(dá)，殺死刺蚜蟲、灰飛虱等刺吸式昆蟲。后者賦予植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。
2、受體體系的建立1)自交系515的自交的精選種子用70％乙醇浸泡10分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡12分鐘，然后用無菌水洗滌5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在250毫升無菌三角瓶內(nèi)，加入35毫升無菌水，封口后放在黑暗條件(28℃)下2天。取露白后種子放在基本培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。取3～5厘米長的胚芽，剝離芽鞘及2～3片幼葉，切取長約5毫米左右的莖尖切段，接種到B培養(yǎng)基上于黑暗下(24～28℃)培養(yǎng)。
2)在B培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天的莖尖切段，胚軸有所伸長，及時切去伸長的胚軸。5～6天時，莖尖開始膨大，及時剝離長出的幼葉，使莖尖持續(xù)膨大。8天后莖尖膨大的分生組織上出現(xiàn)數(shù)個瘤狀或指狀突起，且增生迅速，呈淺黃色。20天后，在瘤狀或指狀突起的表面開始形成不定芽。取此期叢生芽組織塊仍在B培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，分生組織塊持續(xù)生長，亦不規(guī)則膨大，產(chǎn)生大量的胚狀體和不定芽，再次繼代培養(yǎng)后，繼續(xù)產(chǎn)生瘤狀和指狀突起。一般每4周繼代培養(yǎng)一次。在繼代培養(yǎng)中，少數(shù)轉(zhuǎn)變成愈傷組織組織塊和產(chǎn)生不定根的組織塊在繼代時去掉。取繼代后培養(yǎng)15～18天的組織塊作為轉(zhuǎn)基因受體。
3、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化叢生芽組織塊1)將農(nóng)根瘤農(nóng)桿菌A815在附加抗生素35mg/ml利福平霉素、50mg/ml鏈霉素和壯觀霉素100mg/ml的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，溫度28℃，培養(yǎng)14小時后取對數(shù)生長期細(xì)菌在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集，共洗滌三次。再將菌體用添加乙酰丁香酮100μmol/l的1/2改良MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋10倍后用于轉(zhuǎn)化。
2)將叢生芽組織塊切割成0.2～0.3cm大小，放入用添加100μmol/l的乙酰丁香酮的1/2改良MS液體培養(yǎng)基懸浮的菌液中浸泡3分鐘。浸染后的組織塊用無菌濾紙吸干，放在B培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)10天。培養(yǎng)溫度為22～26℃。
3)將叢生芽組織塊轉(zhuǎn)入加有頭孢霉素250mg/l的B培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)10～15天，抑制細(xì)菌生長。
4)將抑菌后的叢生芽組織塊轉(zhuǎn)入加有選擇劑潮霉素20mg/l的B培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，12天時繼代培養(yǎng)一次。再將存活的組織塊轉(zhuǎn)移到加有潮霉素濃度不變的C培養(yǎng)基上篩選一代，然后將存活的叢生芽組織塊轉(zhuǎn)移到無潮霉素的C培養(yǎng)基上產(chǎn)生叢生芽。
4、轉(zhuǎn)基因植株的再生和移栽1)當(dāng)篩選后的叢生芽組織塊分化出較多的小芽時，分割后轉(zhuǎn)移到D培養(yǎng)基上，每塊有小芽2～3個。小芽在照光下生長，光強(qiáng)2000～3000 lx，光照14～15小時/天。小苗長至3～4片葉時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。培養(yǎng)15天時，40％左右的苗產(chǎn)生新根。將未生根苗的基部切傷，轉(zhuǎn)移到新的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天后絕大多數(shù)產(chǎn)生新根。
2)生根苗洗去培養(yǎng)基后，移栽到以蛭石為栽培介質(zhì)的花盆中。植株在自然光照下生長，日溫22～28℃，夜溫15～21℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。生長2周左右，移植苗根系變發(fā)達(dá)，然后定植于田間。轉(zhuǎn)基因植株采用PCR檢測法篩選，Southernblotting驗(yàn)證。轉(zhuǎn)基因植株自交結(jié)實(shí)，從其后代中選擇抗刺吸式昆蟲的植株。
實(shí)施例2采用基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化玉米骨干自交系1、材料1)玉米骨干自交系8112和魯原92的自交種子。
2)質(zhì)粒p35SCaMV。該質(zhì)粒長度7.7kb，含有一個Ampr基因和一個來自擬南芥的抗除草劑綠黃隆(Chlorsulfron)的突變基因als，als基因位于35SCaMV啟動子和TCaMV之間。質(zhì)粒提取和純化采用標(biāo)準(zhǔn)程序及方法(參見《分子克隆》第二版[美]J.薩姆布魯克等 科學(xué)出版社 1996年)。質(zhì)粒質(zhì)量為OD260/OD280在1.7～1.8之間。質(zhì)粒DNA濃度稀釋為1μg/μl。
2、受體體系的建立除自交系不同外，實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1。
3、微彈制備和基因槍轟擊1)稱取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一個離心管中，加入1ml 70％乙醇后劇烈渦旋3～5分鐘，然后靜置15分鐘。室溫下15000rpm離心5秒，去除上清液。
2)加1ml無菌水，劇烈渦旋1分鐘，靜置1分鐘，室溫下15000rpm離心5秒，去除上清液。此步驟重復(fù)3次。
3)無菌水洗滌后的金粉，加50μl 50％滅菌甘油(終濃度為60mg/ml微彈)。該制備液可室溫貯存2周，使用時渦旋5分鐘打破金粉凝集。
4)分散后金粉依次加入5μl質(zhì)粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl2、20μl0.1M亞精胺，邊加樣邊旋渦。然后，繼續(xù)旋渦2～3分鐘，靜置1分鐘。
5)15000rpm離心2秒，棄上清液。加140μl 70％乙醇，靜置，15000rpm離心2秒后棄上清液。
6)加48μl無水乙醇，輕彈管壁數(shù)次，低速下渦旋2～3秒，然后取樣加在微彈載體上。微彈用量為每彈0.5mg。
7)在直徑9cm的培養(yǎng)皿中倒入0.4cm厚的B培養(yǎng)基，然后將叢生芽組織塊(0.5～0.7cm大小，繼代培養(yǎng)后18天)高密度放入培養(yǎng)皿中。
8)用基因槍轟擊叢生芽組織塊，每皿轟擊一次。轟擊參數(shù)取可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8cm，微彈飛行距離6～9cm。其它參數(shù)按使用說明書取值。
3、轉(zhuǎn)化后材料的篩選和培養(yǎng)1)轟擊后材料在暗中恢復(fù)培養(yǎng)3天，然后將材料轉(zhuǎn)入成分不變的新培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，使轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因充分表達(dá)。
2)將材料轉(zhuǎn)入加有選擇劑100ppb綠黃隆(Chlorsulfron)的B培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。連續(xù)篩選三代，每代15天。繼代時淘汰變褐死亡的組織塊。連續(xù)篩選三代后，叢生芽組織塊成活率為11～13％。
4、轉(zhuǎn)基因植株的再生1)將連續(xù)篩選三代后存活的組織塊轉(zhuǎn)移到C培養(yǎng)基上分化小苗。一些組織塊變褐死亡，另一些組織塊變成綠色后逐漸死亡，少數(shù)組織塊在轉(zhuǎn)入C培養(yǎng)基7～10天后分化出小芽。后者在D培養(yǎng)基上生長半月后發(fā)育成小苗。
2)將2～3厘米高的小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。其余步驟相同于實(shí)施例1的對應(yīng)部分。
權(quán)利要求
1.一種建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于，包括如下步驟①種子滅菌和萌發(fā)，②莖尖培養(yǎng)，③叢生芽組織塊的誘導(dǎo)、繼代、分化培養(yǎng)，④小苗生根，⑤試管苗移栽；在以上相關(guān)培養(yǎng)中所采用的培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基即改良MS培養(yǎng)基、A培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基、D培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于，所說的基本培養(yǎng)基是指KNO31900mg/l，NH4NO31650mg/l，CaCl2·2H2O 440mg/l，MgSO4·7H2O70mg/l，KH2PO4·H2O 170mg/l，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg/l，ZnSO4·7H2O 10mg/l，MnSO4·4H2O 22.3mg/l，H3BO310mg/l，KI 0.83mg/l，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/l，CuSO4·5H2O 0.025mg/l，CoCl2·6H2O 0.025mg/l，鹽酸硫胺素10.0mg/l，鹽酸吡哆醇1.0mg/l，煙酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30g/l，瓊脂粉7g/l，pH5.8～6.0；所說的A培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加6-芐基嘌呤4.5～18.0μmol/l，用于誘導(dǎo)離體培養(yǎng)芽尖直接產(chǎn)生叢生芽；B培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加6-芐基嘌呤4.5～9.0μmol/l和2，4-二氯苯氧乙酸1.0～3.0μmol/l，用于誘導(dǎo)離體培養(yǎng)芽尖產(chǎn)生叢生芽組織塊和叢生芽組織塊繼代培養(yǎng)；C培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加6-芐基嘌呤4.5μmol/l和吲哚丁酸1.8μmol/l，用于叢生芽組織塊分化小苗；D培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加6-芐基嘌呤2.25μmol/l和吲哚丁酸3.6μmol/l，用于叢生芽發(fā)育成小苗；生根培養(yǎng)基是指基本培養(yǎng)基附加吲哚丁酸2.8-3.6μmol/l，用于無根小苗生根。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于，所說的種子滅菌和萌發(fā)是指套袋獲得的玉米骨干自交系和雜交種的種子，用70％乙醇浸泡10分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡10～15分鐘，然后用無菌水洗滌3～5遍，滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底，滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入無菌水30～40毫升/250毫升三角瓶，封口后放在黑暗條件23～30℃下，1～2天，待種子萌動露白后，將其放在基本培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)，待胚芽伸長至3～5厘米時，剝離胚芽鞘及2～3片幼葉，切取長約5毫米左右的上胚軸及莖尖，接種到A或B培養(yǎng)基上于黑暗下溫度24～27℃培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于，所說的莖尖培養(yǎng)是指接種在A或B培養(yǎng)基上的上胚軸及莖尖，培養(yǎng)3天后，胚軸有所伸長，未剝離的葉原基發(fā)育為幼葉，及時切去伸長的胚軸并剝?nèi)ビ兹~，6～10天后，莖尖頂端生長錐周圍和/或葉基基部分化產(chǎn)生不定芽，每部位可產(chǎn)生2～5個小芽不等，每芽尖培養(yǎng)物能產(chǎn)生數(shù)十個小芽，叢生芽數(shù)量隨著培養(yǎng)時間延長而增多，培養(yǎng)10～18天取叢生芽培養(yǎng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于，所說的叢生芽組織塊的誘導(dǎo)、繼代、分化培養(yǎng)是指接種在B培養(yǎng)基上的上胚軸及莖尖，培養(yǎng)3天后，胚軸有所伸長，及時切去伸長的胚軸，5～6天時，莖尖開始膨大，有些長出幼葉，幼葉的存在減慢了莖尖膨大速度，導(dǎo)致幼莖形成，故需及時剝離，6～10天后，莖尖開始不規(guī)則膨大生長，在膨大的分生組織上出現(xiàn)數(shù)個瘤狀或指狀突起，莖尖膨大生長后，結(jié)構(gòu)致密，質(zhì)地柔韌，呈淺黃色，局部有密集的纖毛生長，20天后，在瘤狀或指狀突起的表面開始形成不定芽及胚狀體，不定芽數(shù)目因玉米基因型而差異大，從形態(tài)上看，不定芽可分成二種類型一種具有生長點(diǎn)和葉原基分化，基部有短莖與原組織相連；另一種具有苞葉，生長點(diǎn)及葉原基被苞葉圍攏，往往成叢分布，在這種培養(yǎng)基上，多數(shù)叢生芽不能繼續(xù)發(fā)育，其分生組織繼續(xù)膨大后產(chǎn)生次生不定芽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于，所說的小苗生根是指將叢生芽塊切開，每塊有小芽2～3個，放在D培養(yǎng)基上生長，小芽生長于照光下，光強(qiáng)2000～3000lx，光照14～15小時/天，小苗長到3～4片葉時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，培養(yǎng)15天左右，約40％的苗產(chǎn)生新根，對于未生根苗，切傷其基部，轉(zhuǎn)移到新的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天后大多數(shù)植株產(chǎn)生根系。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于，所說的試管苗移栽是指生根苗洗去培養(yǎng)基后，移栽到以蛭石為栽培介質(zhì)的花盆中生長，植株在自然光照下生長，日溫22～28℃，夜溫15～21℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分，生長2周左右，移植苗產(chǎn)生發(fā)達(dá)根系，然后定植于田間。
8.權(quán)利要求1～7中任何一項(xiàng)限定的玉米轉(zhuǎn)基因受體體系均可選用基因槍轟擊法、超聲波處理法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并通過加壓篩選獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及叢生芽塊，進(jìn)而再生出轉(zhuǎn)基因植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的應(yīng)用，其特征在于在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因時，受體以選用繼代后培養(yǎng)10～18天的玉米叢生芽或叢生芽塊為最佳。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的應(yīng)用，其特征在于在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因時，受體以選用繼代后培養(yǎng)13～20天的玉米叢生芽組織塊為最佳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的方法及應(yīng)用。將玉米莖尖接種在附加不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)莖尖培養(yǎng)物直接產(chǎn)生叢生芽或叢生芽組織塊。取繼代培養(yǎng)后處于旺盛生長期的叢生芽和叢生芽組織塊為受體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法等將外源基因轉(zhuǎn)入培養(yǎng)細(xì)胞,經(jīng)過恢復(fù)、篩選等步驟獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明能從絕大多數(shù)基因型的培養(yǎng)細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植株,且頻率高,再生植株性狀變異小。
文檔編號C12N15/87GK1263949SQ0011084
公開日2000年8月23日 申請日期2000年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月26日
發(fā)明者張舉仁, 李學(xué)紅, 權(quán)瑞黨, 張卿偉, 尚梅, 楊愛芳, 李國圣 申請人:山東大學(xué)