一種梨樹離體葉片體細胞胚誘導快繁培養(yǎng)方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種梨樹離體葉片體細胞胚誘導快繁培養(yǎng)方法，屬于植物學領域。
【背景技術(shù)】
[0002]梨樹是薔薇科梨屬，多年生落葉果樹，喬木，在全球均有廣泛分布，全世界約有35個原生種，野生分布于歐、亞及非洲，分類上分為東方梨及西洋梨兩大類。中國梨栽培面積和產(chǎn)量僅次于蘋果。
[0003]梨樹為一種具有較高開發(fā)價值的樹種，目前，通常采用的繁殖方式為扦插繁殖，而此種繁殖方式易感染葉斑病等真菌性病害，春夏季其又易受蚜蟲危害，其病毒嚴重，葉片花斑易脫落，良種化程度降低;而劣質(zhì)種苗的使用又導致梨樹固有的優(yōu)良特性日益喪失，這在一定程度上約束了該樹種的發(fā)展和推廣應用，因此，選擇、繁育優(yōu)良梨樹品系成為一個十分突出的生產(chǎn)問題，組培快繁是梨樹良種產(chǎn)業(yè)化的一種有效途徑，相關方面的報道也較多，但有關梨樹葉片直接誘導體細胞胚及再生快繁系統(tǒng)的技術(shù)研究未見有成功的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效為生產(chǎn)上提供量大質(zhì)優(yōu)、提純復壯的梨樹離體葉片體細胞胚誘導快繁培養(yǎng)方法。
[0005]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
一種梨樹離體葉片體細胞胚誘導快繁培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)選材:于春季選取生長健壯、性狀表現(xiàn)優(yōu)良的單株，剪取嫩枝，經(jīng)清洗、滅菌處理后，剪取l-2cm莖段，將莖段插入芽啟動培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室溫度白天22 ± 2°C，夜晚18± 2°C，光照強度1500—2000 lx，光照時間12 h/d的條件下，進行30_40d的培養(yǎng)，形成無菌試管苗；
(2)無菌試管苗增殖培養(yǎng):將步驟(I)誘導出的無菌試管苗去掉基部葉片，切成含1-2個腋芽的莖段接種在試管苗增殖培養(yǎng)基上，22-25d后繼代I次，形成梨樹無菌試管苗再生體系;
(3)誘導體胚形成培養(yǎng):以試管苗第2-4片展開葉為外植體，接種在誘導體胚形成培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)15-20d，誘導不定芽的形成；
(4)體細胞胚的生長與分化培養(yǎng):將誘導體胚形成培養(yǎng)基培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)接到體細胞胚的生長與分化培養(yǎng)基上，然后暗室培養(yǎng)40-45d，中間繼代一次，外植體上形成許多叢生芽；
(5)壯苗生根培養(yǎng):將步驟(4)生長發(fā)育且長度為5-6cm的叢生芽切成單株轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30-35d，根長至2cm以上時，進行煉苗移栽，然后在新根新芽萌出后，移栽到種植地進行常規(guī)管理。
[0006]進一步，所述的芽啟動培養(yǎng)基為:1/2改良SH+ 0.5?0.8 mgL—M-BA + 3?5mgL—^,4-0 + 0.1?O JmgIZ1NAA + 6.0?7.0gL—1 瓊脂 + 30gL—1蔗糖+0.I ?0.3% phytagel,且pH值為5.8?6.0。
[0007]所述的試管苗增殖培養(yǎng)基為:1/2改良SH+ 0.5?1.0 mgL—VBA + I?2mgL—工2，
4-D + 0.3?0.SmgIZ1NAA + 6.0?7.0gL—1 瓊脂 + 30gL—1鹿糖+0.I?0.3% phytagel,且pH值為5.8?6.0。
[0008]所述的誘導體胚形成培養(yǎng)基為:1/2改良MS+ 0.5?1.0 mgL—M-BA + 0.3?0.5mgL_12,4-D + 0.5?I.0mgIZ1NAA + 6.0?7.0gL—1 瓊脂 + 30gL—1 蔗糖+0.I ?0.3%phytagel,且pH值為5.8?6.0。
[0009]所述的體細胞胚的生長與分化培養(yǎng)基，其特征在于，包括1/2改良MS+1.0?1.5mgL—Vba + 0+ 2.0?3.0mgrtT + 6.0?7.0gL—1 瓊脂 + 20gL—1 蔗糖+2.0?2.5% phytagel；
所述的體細胞胚的壯苗生根培養(yǎng)基，包括1/2改良SH+ 0.2?0.5 mgL—S-BA + 0.05?
0.1mgL—4,4-0 + 0.1?0.1SmgIZ1NAA + 6.0?7.0gL—1 瓊脂 + 30gL—1 蔗糖，且pH值為5.8?
6.0ο
[0010]更進一步，所述的改良MS包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑，且所述的常量營養(yǎng)元素的組分和其對應的濃度如下:
硝酸鉀2100 mg/L；
硫酸銨583 mg/L；
七水硫酸鎂210mg/L;
二水氯化鈣220 mg/L；
無水磷酸二氫鉀380 mg/L；
乙二胺四乙酸二鈉3.5 mg/L；
七水硫酸亞鐵5.9 mg/L,
所述的微量營養(yǎng)元素的組分和其對應的濃度如下:
四水硫酸錳15.2 mg/L；
硫酸鋅1.5 mg/L；
硼酸6.2 mg/L；
碘化鉀1.0 mg/L；
鉬酸鈉0.2 mg/L；
硫酸銅0.1 mg/L；
氯化鈷0.05 mg/L,
所述的有機試劑的組分和其對應的濃度如下:
鹽酸硫胺素 10.0 mg/L；
煙酸1.0 mg/L；
鹽酸卩比B多醇 1.0mg/L；
肌醇100.0 mg/L。
[0011]而所述的改良SH包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑，且所述的常量營養(yǎng)元素的組分和其對應的濃度如下:
硝酸鉀1900 mg/L；
硫酸銨1500 mg/L；
七水硫酸鎂350mg/L; 二水氯化鈣420 mg/L；
無水磷酸二氫鉀185 mg/L；
乙二胺四乙酸二鈉26.8 mg/L；
七水硫酸亞鐵15.9 mg/L,
所述的微量營養(yǎng)元素的組分和其對應的濃度如下:
四水硫酸錳22.5 mg/L；
硫酸鋅6.8 mg/L；
硼酸5.4 mg/L；
碘化鉀1.0 mg/L；
鉬酸鈉0.2 mg/L；
硫酸銅0.02 mg/L；
氯化鈷0.05 mg/L,
所述的有機試劑的組分和其對應的濃度如下:
鹽酸硫胺素 10.0 mg/L；
煙酸1.0 mg/L；
鹽酸卩比B多醇 1.0mg/L；
肌醇100.0 mg/L。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明所述的梨樹離體葉片體細胞胚誘導快繁培養(yǎng)方法通過選擇適宜外植體、改良基本培養(yǎng)基及成分、調(diào)整培養(yǎng)條件等配套措施，使得植株移栽成活率可達到96%以上，種苗生長健壯，可有效解決優(yōu)良種苗種質(zhì)退化問題，也可為生產(chǎn)上提供大量優(yōu)質(zhì)提純復壯的梨樹苗木，此外，還可為梨樹遺傳轉(zhuǎn)化或誘變育種選育新品種提供一個理想的受體體系。
【具體實施方式】
[0013]下面將結(jié)合具體實施例詳細說明本發(fā)明的【具體實施方式】:
以下實施例中所應用到的改良MS包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑，且所述的常量營養(yǎng)元素的組分和其對應的濃度如下:
硝酸鉀2100 mg/L；
硫酸銨583 mg/L；
七水硫酸鎂21 Omg/L;
二水氯化鈣220 mg/L；
無水磷酸二氫鉀380 mg/L；
乙二胺四乙酸二鈉3.5 mg/L；
七水硫酸亞鐵5.9 mg/L,
所述的微量營養(yǎng)元素的組分和其對應的濃度如下:
四水硫酸錳15.2 mg/L；
硫酸鋅1.5 mg/L；
硼酸6.2 mg/L；
碘化鉀1.0 mg/L； 鉬酸鈉0.2 mg/L；
硫酸銅0.1 mg/L；
氯化鈷0.05 mg/L,
所述的有機試劑的組分和其對應的濃度如下:
鹽酸硫胺素 10.0 mg/L；
煙酸1.0 mg/L；
鹽酸卩比B多醇 1.0mg/L；
肌醇100.0 mg/L。
[0014]而所述的改良SH則包括常量營養(yǎng)元素、微量營養(yǎng)元素和有機試劑，且所述的常量營養(yǎng)元素的組分和其對應的濃度如下:
硝酸鉀1900 mg/L；
硫酸銨1500 mg/L；
七水硫酸鎂350mg/L;
二水氯化鈣420 mg/L；
無水磷酸二氫鉀185 mg/L；
乙二胺四乙酸二鈉26.8 mg/L；
七水硫酸亞鐵15.9 mg/L,
所述的微量營養(yǎng)元素的組分和其對應的濃度如下:
四水硫酸錳22.5 mg/L；
硫酸鋅6.8 mg/L；
硼酸5.4 mg/L；
碘化鉀1.0 mg/L；
鉬酸鈉0.2 mg/L；
硫酸銅0.02 mg/L；
氯化鈷0.05 mg/L,
所述的有機試劑的組分和其對應的濃度如下:
鹽酸硫胺素 10.0 mg/L；
煙酸1.0 mg/L；
鹽酸卩比B多醇 1.0mg/L；
肌醇100.0 mg/L。
[0015]實施例1
梨樹離體葉片體細胞胚誘導快繁培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(1)選材:于春季選取生長健壯、性狀表現(xiàn)優(yōu)良的單株，剪取嫩枝，經(jīng)清洗、滅菌處理后，剪取l-2cm莖段，將莖段插入芽啟動培養(yǎng)基上，芽啟動培養(yǎng)基為:1/2改良SH+ 0.5 mgL—W-BA+ 3mgL_12,4-D + 0.1mgL-1NAA + 6.0gL—1 瓊脂 + 30gL—1 鹿糖+0.1% phytagel,且pH值為5.8，在培養(yǎng)室溫度白天22±2°〇，夜晚18±2°C，光照強度1500—2000 lx，光照時間12 h/d的條件下，進行30d的培養(yǎng)，形成無菌試管苗；
(2)無菌試管苗增殖培養(yǎng):將步驟(I)誘導出的無菌試管苗去掉基部葉片，切成含1-2個腋芽的莖段接種在試管苗增殖培養(yǎng)基上，試管苗增殖培養(yǎng)基為:1/2改良SH+ 0.5 mgL—BA + lmgL_12,4-D + 0.3mgL_1NAA + 6.0gL—1 瓊月旨 + 30gL—1 鹿糖+0.1% phytagel,且pH值為5.8，22d后繼代I次，形成梨樹無菌試管苗再生體系；
(3)誘導體胚形成培養(yǎng):以試管苗第2-4片展開葉為外植體，接種在誘導體胚形成培養(yǎng)基上，誘導體胚形成培養(yǎng)基為:1/2改良MS+ 0.5 mgL-VBA + 0.3mgL—hj-D + 0.5mgL—1NAA + 6.0gL-1瓊脂+ 30gL—1蔗糖+0.1% phytagel,且pH值為5.8，暗培養(yǎng)15d，誘導不定芽的形成；
(4)體細胞胚的生長與分化培養(yǎng):將誘導體胚形成培養(yǎng)基培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)接到體細胞胚的生長與分化培養(yǎng)基上，所述的體細胞胚的生長與分化培養(yǎng)基，其特征在于，包括1/2改良MS+ 1.0 mgL—Vba + 0.5mgL—hj-D + 2.0mgIZ1KT + 6.0gL—1 瓊脂 + 20gL—1 蔗糖+2.0%phytagel，然后暗室培養(yǎng)40d，中間繼代一次，外植體上形成許多叢生芽；
(5)壯苗生根培養(yǎng):將步驟(4)生長發(fā)育且長度為5-6cm的叢生芽切成單株轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上，體細胞胚的壯苗生根培養(yǎng)基，包括1/2改良SH+ 0.2 mgL—S-BA