一種金線蓮種質資源的低溫保存方法
【專利說明】一種金線蓮種質資源的低溫保存方法
[0001]
技術領域
[0002]本發(fā)明屬于植物保存技術領域，具體涉及一種金線蓮種質資源的低溫保存方法。
【背景技術】
[0003]金線蓮別名金線蘭、金絲草，為蘭科開唇植物花葉蘭屬多年生珍稀中草藥。它在民間使用范圍較廣，素有“藥王”、“金草”、“神藥”、“烏人參”等美稱。經(jīng)有關部門測定發(fā)現(xiàn)，金絲蓮中氨基酸組成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于國產(chǎn)和野生西洋參。幾百年來作為民間常用草藥。功能與主治:清熱涼血，除濕解毒，平衡陰陽、扶正固本，陰陽互補、生津養(yǎng)顏、調(diào)和氣血、五臟、養(yǎng)壽延年的功用。入腎、心、肺三經(jīng)，能全面提高人體免疫力，增強人體對疾病的抵抗力。主治肺熱咳嗽，肺結核咯血，尿血，小兒驚風，破傷風，腎炎水腫，風濕痹痛，跌打損傷，毒蛇咬傷、支氣管炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、急慢性肝炎、風濕性關節(jié)炎腫瘤等疑難病癥。
[0004]近幾十年來，由于該藥具有神奇的療效，鮮品價格不菲，藥農(nóng)、村民在原生地過篩樣濫采，如今野生金線蓮幾近滅絕；由于金線蓮種子胚高度發(fā)育不全，自然繁殖力極低，且僅分布于我國廣西等五省區(qū)，宜生環(huán)境狹窄。因此，如何保護金線蓮種質資源成為非常緊迫的課題。目前，人們對金線蓮的研究僅限于快速繁殖、藥用成分等方面，而對金線蓮種質資源的保存技術未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了更好地保護金線蓮這一珍貴的藥用資源，保護生物的多樣性，經(jīng)過長期的研究實踐，發(fā)明了一種能長期保存金線蓮種質資源的方法，該方法具有成本低，操作簡易，實用性強的優(yōu)點。本發(fā)明所使用的技術方案為:
一種金線蓮種質資源的低溫保存方法，其特征在于，包括以下步驟:
1)野生種苗的采集:到原生境采集生長健壯、無病蟲害的金線蓮植株；
2)原料處理:將采集的野生種苗清洗干凈，晾干水分后，用3_5g/L的滅菌洗衣粉液浸泡20-30分鐘后，將其沖洗干凈后晾干水分，進行高溫鈍化；
3)無菌操作:切取種苗的莖尖或莖段進行滅菌處理，轉入金線蓮初代培養(yǎng)基，所述的金線蓮初代培養(yǎng)基包括MS、6-BA、ZT、2，4-D、NAA、蔗糖和瓊脂，培養(yǎng)基pH為5.5-6.0；
4)第一階段，即第1-12個月，將無菌操作后的種苗進行低溫誘導分化；
5)第二階段，即第13-60個月，將分化后的種苗進行低溫、暗處理；
6)第三階段，即第61-72個月，將種苗轉入金線蓮繼代培養(yǎng)基，所述的金線蓮繼代培養(yǎng)基包括MS、6-BA、ZT、NAA、蔗糖和瓊脂，培養(yǎng)基的pH為5.5-6.0，將其置于常溫、光照下培養(yǎng)；
7)第四階段，即第73-96個月，將種苗轉入低溫、暗處理； 8)第五階段，即第97-120個月，再將種苗轉入金線蓮培養(yǎng)基中，所述的金線蓮培養(yǎng)基包括MS、6-BA、ZT、NAA、蔗糖和瓊脂，培養(yǎng)基的pH為5.5-6.0，置于常溫、光照下培養(yǎng)。
[0006]以上所述的步驟2)中高溫鈍化的溫度為35-45°C，鈍化時間為10-12小時。
[0007]以上所述的步驟3)滅菌處理具體步驟為將種苗的莖尖或莖段用70%乙醇浸泡1-5分鐘后，用無菌水沖洗I次，再用10% H202浸泡浸泡5-10分鐘后，用無菌水沖洗2次，最后用
0.4%HgCL2浸泡3-7分鐘后，無菌水沖洗2次后，將莖尖或莖段剪去葉片轉入金線蓮初代培養(yǎng)基中。
[0008]以上所述的步驟3)金線蓮初代培養(yǎng)基中以MS為基礎培養(yǎng)基，其余各組分含量分別為:6-BA l-5mg/L、ZT 1.5-6.5mg/L、2，4-D 0.5-2.0mg/L、NAA 0.5-2.5mg/L、蔗糖30_45g/L和瓊脂 5.5-6.5g/L。
[0009]以上所述的步驟4)低溫誘導分化溫度為2-8°C。
[0010]以上所述的步驟5)和7)低溫、暗處理，溫度控制在2-7 0C。
[0011]以上所述的步驟6)金線蓮繼代培養(yǎng)基中以MS為基礎培養(yǎng)基，其余各組分含量分別為:6-BA l-5mg/L、ZT I.5-5.5mg/、NAA 0.5-1.5mg/L、蔗糖30_45g/L和瓊脂5.5-6.5g/L。
[0012]以上所述的步驟8)金線蓮培養(yǎng)基中以MS為基礎培養(yǎng)基，其余各組分含量分別為:6-BA 0.5-5.5mg/L、ZT I.5-6.5mg/L、NAA 0.5-1.0mg/L、蔗糖30_45g/L和瓊脂5.5-6.5g/L。
[0013]以上，所述的步驟6)和8)常溫、光照，溫度控制為15-30°C，光照強度為3000—3500lux。
[0014]本發(fā)明通過對金線蓮組培苗進行低溫、常溫、黑暗、光照和不同培養(yǎng)基等條件的交替處理，利用外部條件驅動，低溫誘使細胞分裂分化減慢，延緩了細胞再分化的時間，從而達到長期保存種質資源的目的。此外，本發(fā)明還具有以下優(yōu)點:
1、方法易操作:金線蓮種質資源保存10年間只轉3次培養(yǎng)基，中途無需添加營養(yǎng)液，延長繼代時間間隔，極大地降低生產(chǎn)成本，提高工作效率。
[0015]2、實用性強:占用極小的空間就能保存較多的種質資源。
[0016]3、不用冷凍防護劑DMSO處理，簡單可靠，存活率高，能確保遺傳的穩(wěn)定性，很好地解決了金線蓮低溫保存技術。
[0017]4、此方法為保存其它珍稀植物資源提供了極具價值的研究思路和實驗方法。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
一種金線蓮種質資源的低溫保存方法，包括以下步驟:
1)野生種苗的采集:到原生境采集生長健壯、無病蟲害的金線蓮植株；
2)原料處理:將采集的野生種苗清洗干凈，晾干水分后，用3-5g/L的滅菌洗衣粉液浸泡20-30分鐘后，將其沖洗干凈后晾干水分，在溫度為35-45°C進行鈍化10-12小時；
3)無菌操作:切取種苗的莖尖或莖段，將種苗的莖尖或莖段用70%乙醇浸泡1-5分鐘后，用無菌水沖洗I次，再用10% H202浸泡浸泡5-10分鐘后，用無菌水沖洗2次，最后用0.4%HgCL2浸泡3-7分鐘后，無菌水沖洗2次后，將莖尖或莖段剪去葉片轉入金線蓮初代培養(yǎng)基中，所述的金線蓮初代培養(yǎng)基中以MS為基礎培養(yǎng)基，其余各組分含量分別為:6-BA l-5mg/L、ZT 1.5-6.5mg/L、2，4-D 0.5-2.0mg/L、NAA 0.5-2.5mg/L、蔗糖30_45g/L和瓊脂5.5-6.5g/L，培養(yǎng)基 pH 為 5.5-6.0;
4)第一階段，即第1-12個月，將無菌操作后的莖尖或莖段在溫度為2-8°C進行低溫誘導分化；
5)第二階段，即第13-60個月，將分化后的種苗進行低溫、暗處理，溫度控制在2-7°C，得種苗；
6)第三階段，即第61-72個月，將種苗轉入金線蓮繼代培養(yǎng)基，所述的金線蓮繼代培養(yǎng)基中以MS為基礎培養(yǎng)基，其余各組分含量分別為:6-BA l-5mg/L、ZT I.5-5.5mg/、NAA
0.5-1.5mg/L、蔗糖30-45g/L和瓊脂5.5-6.5g/L，培養(yǎng)基的pH為5.5-6.0，將其置于溫度為15-30°C，光照強度為3000—3500 Iux條件下培養(yǎng)；
7)第四階段，即第73-96個月，將種苗轉入低溫、暗處理，溫度控制在2-7°C;
8)第五階段，即第97-120個月，再將種苗轉入金線蓮培養(yǎng)基中，所述的金線蓮培養(yǎng)基中以MS為基礎培養(yǎng)基，其余各組分含量分別為:6-BA 0.5-5.5mg/L、ZT 1.5-6.5mg/L、NAA
0.5-1.0mg/L、蔗糖30-45g/L和瓊脂5.5-6.5g/L，培養(yǎng)基的pH為5.5-6.0,將其置于溫度為15-300C，光照強度為3000—3500 Iux條件下培養(yǎng)。
[0019]實施例2
一種金線蓮種質資源的低溫保存方法，包括以下步驟:
1)野生種苗的采集:到原生境采集生長健壯、無病蟲害的金線蓮植株；
2)原料處理:將采集的野生種苗清洗干凈，晾干水分后，用3g/L的滅菌洗衣粉液浸泡30分鐘后，將其沖洗干凈后晾干水分，在溫度為35 °C進行鈍化12小時；
3)無菌操作:切取種苗的莖尖或莖段，將種苗的莖尖或莖段用70%乙醇浸泡I分鐘后，用無菌水沖洗I次，再用10% H202浸泡浸泡5分鐘后，用無菌水沖洗2次，最后用0.4%HgCL2浸泡3分鐘后，無菌水沖洗2次后，將莖尖或莖段剪去葉片轉入金線蓮初代培養(yǎng)基中，所述的金線蓮初代培養(yǎng)基中以MS為基礎培養(yǎng)基，其余各組分含量分別為:6-BA 5mg/L、ZT 1.5mg/L、2，4-D 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5.5g/L，培養(yǎng)基pH為5.5;
4)第一階段，即第1-12個月，將無菌操作后的莖尖或莖段在溫度為8°C進行低溫誘導分化；
5)第二階段，即第13-60個月，將分化后的種苗進行低溫、暗處理，溫度控制在2°C，得種苗；