一種利用橡膠草葉片再生植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細胞工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用橡膠草葉片再生植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]橡膠草(Taraxacumkok-saghyz Rodin)又名俄羅斯蒲公英(Russian dandel1n)，為菊科蒲公英屬的一種多年生草本植物，原產(chǎn)于哈薩克斯坦、歐洲以及中國新疆等地。橡膠草根部含有高品質(zhì)的橡膠，含量可達20 %以上(多年生的干重)，在工業(yè)上的利用價值不次于巴西橡膠樹橡膠，而且橡膠草具有生長周期短、適應(yīng)性強、適合機械化種植和采收等優(yōu)點，使其成為具有發(fā)展前途的巴西橡膠樹橡膠替代作物。除了橡膠之外，橡膠草的根、葉中還可以提取菊糖，提膠后的殘渣可以加工酒精、沼氣，并且具有一定藥用價值。在原材料、能源日趨緊張的今天，橡膠草作為科研材料、工業(yè)原料和生物能源等方面均具有較大的優(yōu)勢。但橡膠草自交不親和，自花授粉結(jié)實率很低，雜種率高，通過種子繁殖不利于優(yōu)良品種的保存和繁殖，而且種子繁殖周期長，繁殖效率低，難以滿足產(chǎn)業(yè)化的要求。尤其對于野外采集的珍稀材料，種子采集受季節(jié)的限制很大，葉片和根相對比較容易獲得，因此，高效、成熟的橡膠草組織培養(yǎng)技術(shù)為珍稀材料的保存與繁殖以及推動橡膠草產(chǎn)業(yè)化具有十分重要的意義。
[0003]以橡膠草葉片作為外植體，誘導(dǎo)不定芽或者愈傷組織的研究已有報道[林伯煌，魏小弟[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程，2009，33(4):1-3;羅成華，閆潔，祝建波[J].北方園藝，2012 (07):115-119 ;陳菲，曲彥婷，李黎，等[J]國土與自然資源研究，2014，1:93-94 ;Uteulin K, Mukhambetzhanov S, Rakhimbaev I[J].Internat1nal Journal of B1logica
I,Veterinary, Agricultural and Food Engineering, 2014，8 (4): 373-375]。但由于橡膠草具有自交不親和的繁殖特點，造成其品系混雜比較嚴(yán)重，不同品系之間的組織培養(yǎng)條件和方法存在差異，現(xiàn)有方法中關(guān)于橡膠草葉片誘導(dǎo)愈傷組織及其再生植株的方法不系統(tǒng)，誘導(dǎo)效率不高，誘導(dǎo)效果不夠理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004](一 )要解決的技術(shù)問題
[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中橡膠草的葉片誘導(dǎo)愈傷組織及再生植株的方法誘導(dǎo)效果不理想的缺陷，本發(fā)明提供一種利用橡膠草葉片再生植株的方法。
[0006]( 二)技術(shù)方案
[0007]本發(fā)明所述的方法，包括如下步驟:
[0008]I)將預(yù)處理后的橡膠草葉片接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，至誘導(dǎo)出愈傷組織，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成包括:MS+1.8?2.2mg/L 6-BA+0.4?0.6mg/L NAA或IAA ；
[0009]2)將所述愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到大量生長狀況良好的愈傷組織，所述繼代培養(yǎng)基的物質(zhì)組成包括:MS+1.3?1.7mg/L 6-BA+0.1?0.3mg/L NAA或IAA ；
[0010]3)將所述生長狀況良好的愈傷組織接種到不定芽培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，至長出不定芽，所述不定芽培養(yǎng)基的物質(zhì)組成包括:MS+0.8?1.2mg/L 6-BA ;
[0011]4)將所述不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，所述生根培養(yǎng)基的組成包括:1/2MS+0.3 ?0.5mg/L NAA 或 IAA ；
[0012]5)將生根后的苗在室溫下煉苗后，移至培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)，得到橡膠草再生植株。本發(fā)明中，通過對各培養(yǎng)基中激素種類的選擇，進一步對激素濃度進行調(diào)整，得到了適于橡膠草葉片再生植株的培養(yǎng)基。
[0013]所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)中和繼代培養(yǎng)中的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強度為2000-2500Lux，每天光照12小時。
[0014]所述不定芽誘導(dǎo)過程和生根過程中的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強度為2500-3000Lux，每天光照16小時。
[0015]對所述橡膠草的葉片進行表面清洗和消毒的步驟為:取幼嫩的橡膠草葉片，用自來水將表面清洗干凈，將所述葉片浸入70%酒精中，表面消毒I?2min，然后用無菌水洗2-3遍，之后浸于15%的雙氧水中表面消毒6?8min，最后用無菌水沖洗5_6遍，然后將表面的水吸干。
[0016]所述步驟5)中，具體操作為:根長至8-lOcm時，將橡膠草幼苗移至室溫?zé)捗??5天；然后將所述幼苗移栽至泥炭土、蛭石的混合培養(yǎng)基質(zhì)中，并在80%?95%的空氣濕度和25±2°C的環(huán)境中對橡膠草培養(yǎng)兩周；最后移至正常的光照和溫度條件下進行培養(yǎng)。
[0017]所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括蔗糖25?35g/L，瓊脂6?8g/L ;所述繼代培養(yǎng)基中還包括蔗糖25?30g/L，瓊脂6?7g/L ;所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括蔗糖15?25g/L，瓊脂5?7g/L ;所述生根培養(yǎng)基中還包括蔗糖10?20g/L，瓊脂5?7g/L ;所述培養(yǎng)基的pH均為6.0?7.0。
[0018]本發(fā)明所述的愈傷組織的誘導(dǎo)和植株的培養(yǎng)方法，優(yōu)選包括如下步驟:
[0019]I)取幼嫩的橡膠草葉片，用自來水將表面清洗干凈，將所述葉片浸入70%酒精中，表面消毒I?2min，然后用無菌水洗2-3遍，之后浸于15 %的雙氧水中表面消毒6?8min，然后用無菌水沖洗5-6遍，將葉片表面的水吸干，得備用材料；
[0020]2)將所述備用材料接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，至誘導(dǎo)出愈傷組織；所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強度為2000-2500Lux，每天光照12小時；所述的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA,并添加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH調(diào)整至6.0-7.0 ；
[0021]3)將所述愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織繼代培養(yǎng)基上進行繼代，繼代培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強度為2000-2500LUX，每天光照12小時；所述的愈傷組織繼代培養(yǎng)基為:MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L IAA,并添加蔗糖 30g/L，瓊脂 7g/L，pH 調(diào)整至 6.0-7.0 ；
[0022]4)愈傷組織增殖至所需數(shù)量時，將愈傷組織轉(zhuǎn)接至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行不定芽誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強度為2500-3000LUX，每天光照16小時；所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+1.0mg/L 6-BA,并添加蔗糖20g/L，瓊脂7g/L，pH調(diào)整至6.0-7.0 ;
[0023]5)不定芽長至3_5cm時，將不定芽切下并轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)溫度為23 ± 2 °C，光照光強為2500-3000LUX，每天光照16小時；所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS+0.4mg/L IAA,并添加蔗糖 15g/L，瓊脂 7g/L，pH 調(diào)整至 6.0-7.0 ；
[0024]6)根長至8-lOcm時，將橡膠草幼苗移至室溫?zé)捗??5天；然后將所述幼苗移栽至泥炭土、蛭石的體積比為4:1的混合培養(yǎng)基質(zhì)中，并在80%?95%的空氣濕度和25±2°C的環(huán)境中對橡膠草培養(yǎng)兩周；最后移至正常的光照和溫度條件下進行培養(yǎng)。
[0025](三)有益效果
[0026]上述利用橡膠草葉片再生植株的方法，繁殖系數(shù)高，沒有褐化和白化苗發(fā)生，再生植株生長健壯，根系發(fā)達，移植成活率尚，可在短時間內(nèi)獲得大量的再生植株。
[0027]本發(fā)明為橡膠草大規(guī)模無性繁殖提供一種效率高、周期較短、繁殖系數(shù)高的方法，為橡膠草分子育種奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0028]圖1是轉(zhuǎn)接至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的葉片外植體；
[0029]圖2是誘導(dǎo)分化的愈傷組織；
[0030]圖3是由愈傷組織誘導(dǎo)分化的不定芽；
[0031]圖4是不定芽誘導(dǎo)生根的情況；
【具體實施方式】
[0032]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用