專利名稱：以葉片為外植體的月季再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以月季葉片為外植體，通過 體細(xì)胞胚發(fā)生途徑進(jìn)行月季植株再生的方法。
背景技術(shù)：
月季(Rosa hybrida)屬于薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)多年生常綠木本植 物。月季栽培歷史悠久，被世界各國(guó)廣泛種植，是非常重要的觀賞花卉且具有重要的商業(yè)價(jià) 值，在園林綠化中起著重要的作用。月季因其姿態(tài)優(yōu)美、花色豐富艷麗，芳香濃郁、花期長(zhǎng)、 適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖容易且管理方便被譽(yù)為花中皇后。月季的用途非常廣泛，例如可以用藤本月 季布置長(zhǎng)廊和拱門，用樹狀月季裝飾主干道，將灌木月季做成綠籬，用聚花月季點(diǎn)綴花壇， 茶香月季可以用于展覽，微型月季用來作為室內(nèi)陳設(shè)，切花月季可以應(yīng)用于各種場(chǎng)所。但是月季花的瓶插壽命比較短，易患白粉病、黑斑病，這些都影響了它的觀賞價(jià)值 和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在這些性狀改良上，傳統(tǒng)育種方法存在著很大的局限性。植物基因工程技術(shù) 在保持品種的其他性狀相對(duì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，能夠利用外源基因?qū)ζ渌刂频男誀钸M(jìn)行定向 改良，從而為培育月季新品種提供了新的途徑。而月季再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是 利用基因工程技術(shù)育種的重要基礎(chǔ)。植物的體細(xì)胞胚發(fā)生是植物的體細(xì)胞在離體條件下，通過與合子胚類似的發(fā)育途 徑得到新個(gè)體的過程。體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生體系的建立有助于月季的試管苗快繁，人工 種子的生產(chǎn)和冷藏保存，同時(shí)胚性細(xì)胞是進(jìn)行月季遺傳轉(zhuǎn)化的最佳受體，可以以體細(xì)胞胚 為受體進(jìn)行月季遺傳轉(zhuǎn)化的研究。不同的月季品種和外植體及實(shí)驗(yàn)方法被應(yīng)用于月季體細(xì)胞胚發(fā)生的研究，結(jié)果 表明由于基因型的限制很難找到一種通用的方法進(jìn)行月季體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)(Marchant et al· ， Somatic embryogenesis and plant regeneration in floribunda rose(Rosa hybrida L cvs.Trumpeter and Glad Tidings). Plant Science，1996，120 :95_105)。以 月季Rosa hybrida cv. Carl Red和R. cmina的離體葉片或莖段為外植體可以獲得胚 性愈傷組織(Visessuwan et al.，Plant regeneration systems from leaf segment culture through embryogenic callus formation of Rosa hybrida and R. canina. Breed Sci，1997，47 :217_222)。DeWit et al. (Somatic embryogenesis and regeneration of flowering plants in rose. Plant Cell Rep,1990，9 :456_458)以 R. hybrida cv. Domingo和R. hybrida cv. Vicky Brown的葉片為外植體也獲得了胚性愈傷組織。Rout et al. (Somatic embryogenesis in callus culture of Rosa hybrida L. cv.Landora. Plant Cell Tiss Org Cult，1997，27 :65_69)在月季 R. hybrida cv. Landora 體細(xì)胞胚 誘導(dǎo)研究中，誘導(dǎo)未成熟的葉片或莖段可以獲得體細(xì)胞胚。Marchmt et al. (Somatic embryogenesis and plant regeneration in floribunda rose(Rosa hybrida L cvs· Trumpeter and Glad Tidings) · Plant Science，1996，120 :95_105)以月季 R. hybrida cv. Trumpeter和R. hybrida cv. Glad Tidings的葉柄和根為外植體誘導(dǎo)得到了體細(xì)胞胚。利用未成熟種子誘導(dǎo)得到體細(xì)胞胚(Kim et al.，Control of direct and indirect somatic embryogenesis by exogenous growth regulators in immature zygotic embryo cultures of rose. Plant Cell Tiss Org Cult,2003, 74:61_66 ；Kamo et al.,Dispersal and size fractionation of embryogenic of callus increases the frequency of embryo maturation and conversion in hybrid tea roses. Plant Cell Rep,2004,22 787-792)。此外，體細(xì)胞胚可以通過誘導(dǎo)月季的花瓣獲得(Arene et al.，A comparison of the somaclonal variation level of Rosa hybrida L. cv. Meirutral plants regenerated from callus of direct induction from different vegetative and embryonic tissues. Euphytica，1993，71 :83_90)。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有關(guān)于月季‘薩蔓莎’ 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種以月季未展開葉片為材料，通 過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，建立月季再生體系的方法。同時(shí)本發(fā)明方法所獲得的體細(xì)胞胚能夠 長(zhǎng)期繼代并保持其分化能力，可作為月季遺傳轉(zhuǎn)化的材料。本發(fā)明的技術(shù)方案和步驟如下①以月季未成熟葉片為外植體，將所述的外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中直接誘導(dǎo)出體細(xì) 胞胚；②將步驟①中的體細(xì)胞胚接種到體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基中增殖并使其進(jìn)一步分化， 得到成熟體細(xì)胞胚；③將步驟②得到的成熟體細(xì)胞胚接種到體細(xì)胞胚成苗培養(yǎng)基中使其再生出植 株；④將步驟③得到的植株接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)從而形成完整的植株。其中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成如下MS基本培養(yǎng)基，2,4- 二氯苯氧乙酸3_4mg/L，葡萄 糖30g/L，植物凝膠2. 5g/L；所述的體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基的組成如下MS基本培養(yǎng)基，2，4_ 二氯苯氧乙酸 0-1. 0mg/L, 6-芐基腺嘌呤0-0. 05mg/L,葡萄糖60g/L，植物凝膠2. 5g/L ；所述的體細(xì)胞胚成苗培養(yǎng)基的組成如下MS基本培養(yǎng)基，唑重氮苯莖脲 (TDZ) 0-2. 0mg/L, 6-芐基腺嘌呤 0. 5-1. 0mg/L,葡萄糖 30g/L，植物凝膠 2. 5g/L。所述的生根培養(yǎng)基的組成如下MS基本培養(yǎng)基，萘乙酸0. 01mg/L，蔗糖30. 0g/L, 瓊脂粉7. 5mg/L。作為優(yōu)選方案，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2，4_ 二氯苯氧乙酸為3.0mg/L。作為優(yōu)選方案，所述的體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基中的2，4_ 二氯苯氧乙酸為1.0mg/L， 6-芐基腺嘌呤為0. 05mg/L。作為優(yōu)選方案，所述的體細(xì)胚胞成苗培養(yǎng)基中的唑重氮苯莖脲(TDZ) 1. 0mg/L， 6-芐基腺嘌呤為0. 5mg/L。為了便于對(duì)本發(fā)明的理解，申請(qǐng)人對(duì)上述各個(gè)步驟中所用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基中所 用到的植物激素做了如下定義培養(yǎng)基包括體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基、體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基、體細(xì)胞胚成苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。本發(fā)明所使用基本培養(yǎng)基來源如下MS基本培養(yǎng)基 (Murashige T. and F. Skoog. Physiol. Plant, 1962，15 :473_497)。
在本發(fā)明中，所述的植物激素定義及簡(jiǎn)稱如下植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)包括2，4- 二氯 苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)，植物細(xì)胞分裂素包括唑重氮苯莖脲(TDZ)、6_芐基腺嘌呤 (6-BA)。本發(fā)明以月季品種‘薩蔓莎’未展開葉片為外植體，直接誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，并能 保持體細(xì)胞胚不斷增殖和成苗的特性。這些體細(xì)胞胚為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的月季的遺傳轉(zhuǎn)化提供 了良好的受體；同時(shí)，該再生體系也是月季遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體并為制備轉(zhuǎn)基因月季新品 種的人工種子奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明的積極效果是1、本發(fā)明所采用的外植體來源不受季節(jié)限制，可以周年進(jìn)行月季‘薩蔓莎’的組織 和細(xì)胞培養(yǎng)。2、離體培養(yǎng)下的月季‘薩蔓莎’體細(xì)胞胚可通過次生胚不斷增殖，具有良好的增殖 效果。3、離體培養(yǎng)下的月季‘薩蔓莎’體細(xì)胞胚可以長(zhǎng)期繼代保存并能保持其進(jìn)一步分 化為小植株的能力。


圖1 :本發(fā)明中月季‘薩蔓莎’體細(xì)胞胚的增殖。圖2 本發(fā)明中月季‘薩蔓莎’體細(xì)胞胚的萌發(fā)。圖3 本發(fā)明中月季‘薩蔓莎’的體細(xì)胞胚在體細(xì)胞胚成苗培養(yǎng)基上形成的無根小
田ο圖4 本發(fā)明中月季‘薩蔓莎’的無根小苗生根培養(yǎng)后形成的根。圖5 本發(fā)明中田間條件下生長(zhǎng)的月季‘薩蔓莎’的再生植株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1試驗(yàn)材料選擇、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)與接種培養(yǎng)1、試驗(yàn)材料來源及其處理本發(fā)明中的試驗(yàn)材料選自月季‘薩蔓莎’未展開的葉片，采自湖北省武漢市華中農(nóng) 業(yè)大學(xué)花卉試驗(yàn)基地，采取生長(zhǎng)健壯，無病蟲害的優(yōu)良月季‘薩蔓莎’的未展開的復(fù)葉片。該 品種原始來源為購(gòu)自湖北省武漢市武昌雄楚大街湖北省花卉苗木市場(chǎng)的公開銷售品種。田 間采集的月季‘薩蔓莎’的未展開的復(fù)葉片按常規(guī)方法消毒(高莉萍.月季品種‘薩蔓莎’ 植株再生體系的建立和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究.[博士學(xué)位論文].武漢華中農(nóng) 業(yè)大學(xué)圖書館，2004，見中國(guó)知網(wǎng)http://WWW. cnki. net/)，將消毒后的月季‘薩蔓莎’的未 展開的復(fù)葉片，自小葉柄處將其切成帶有小葉柄的單葉，以葉背面朝下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基 上。2、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)表1列出了本發(fā)明的各種培養(yǎng)基的成分及其用量。
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表1月季的離體培養(yǎng)基設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
一種月季再生為完整植株的方法，它包括下列步驟①以月季未成熟葉片為外植體，將所述的外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中直接誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚；②將步驟①中的體細(xì)胞胚接種到體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基中增殖并使其進(jìn)一步分化，得到成熟體細(xì)胞胚；③將步驟②得到的成熟體細(xì)胞胚接種到體細(xì)胞胚成苗培養(yǎng)基中使其再生出植株；④將步驟③得到的植株接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)得到完整植株；其中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成如下MS基本培養(yǎng)基，2，4 二氯苯氧乙酸3 4mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝膠2.5g/L；所述的體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基的組成如下MS基本培養(yǎng)基，2，4 二氯苯氧乙酸0 1.0mg/L，6 芐基腺嘌呤0 0.05mg/L，葡萄糖60g/L，植物凝膠2.5g/L；所述的體細(xì)胞胚成苗培養(yǎng)基的組成如下MS基本培養(yǎng)基，唑重氮苯莖脲0 2.0mg/L，6 芐基腺嘌呤0.5 1.0mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝膠2.5g/L；所述的生根培養(yǎng)基的組成如下MS基本培養(yǎng)基，萘乙酸0.01mg/L，蔗糖30.0g/L，瓊脂粉7.5mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的體細(xì)胞胚增殖培養(yǎng)基中的2，4_二氯苯氧乙 酸為1. Omg/L, 6-芐基腺嘌呤為0. 05mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的體細(xì)胚胞胚成苗培養(yǎng)基中的唑重氮苯莖脲 1. 0mg/L, 6-芐基腺嘌呤為0. 5mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟②所述的方法還包括將所述的體細(xì)胞胚接種 到體細(xì)胞胚繼代培養(yǎng)基上，使其繼代并保持分化能力。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以月季葉片為外植體經(jīng)過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的再生植株方法。本發(fā)明包括以下三個(gè)培養(yǎng)階段(1)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)月季外植體，該外植體分別為月季未展開的葉片，從外植體上直接誘導(dǎo)體細(xì)胞胚；(2)將體細(xì)胞胚接種到增殖培養(yǎng)基上增殖并促進(jìn)其進(jìn)一步分化；(3)將增殖培養(yǎng)后的體細(xì)胞胚接種到體細(xì)胞胚成苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基上再生成完整植株。本發(fā)明的方法具有外植體來源廣泛，取材方便等優(yōu)點(diǎn)。所得到的體細(xì)胞胚是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體，可用于月季遺傳轉(zhuǎn)化的研究。本發(fā)明還涉及用于該方法的培養(yǎng)基組成。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101946703SQ20101025689
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者傅小鵬, 劉國(guó)鋒, 包滿珠, 包穎, 寧國(guó)貴, 張俊衛(wèi), 邢文 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)