p://www. micronic, com)中混合，在 每個管中加入2個不銹鋼球。將所述管和種子在液氮中冷凍1分鐘并立即將種子在深孔 振蕩器（Vaskon 96grinder，Belgium;http://www.vaskon.com)中在 16·8Ηζ(最大速度的 80%)下持續(xù)2分鐘以研磨至成細粉。將300 yL來自AG(JWA?Plant DNA Isolation Kit (http://www. agowa. de)的AgOWa?裂解緩沖液P加入到樣品板中，并通過在深孔振 蕩器中在16. 8Hz下振蕩1分鐘將所述粉末懸浮于溶液中。將板以4000rmp離心10分鐘。 使用 Janus MDT? (Perkin Elmer, USA ;http://www. perkinelmer.com)平臺（96 個分 液頭）將75 μ L上清液移液至96孔Kingfisher板上。使用Perkin Elmer JamiS?液體 處理裝置（liquid handler robot)和 96 Killgfishei** (Thermo labsystems, Finland; http://www.thermo.com)進行下述步驟。用結(jié)合緩沖液（150 μ L)和磁珠（20 μ L)稀釋含 有DNA的上清液。一旦DNA結(jié)合到所述磁珠上，進行兩步連續(xù)的洗滌步驟（洗滌緩沖液1 : 1/3的Agowa洗脫緩沖液1、1/3的乙醇、1/3的異丙醇；洗滌緩沖液2 :70%乙醇、30% Agowa 洗滌緩沖液2)并最后將其在洗脫緩沖液（100 μ L MQ、0. 025 μ L Tween)中洗脫。
[0205] 研磨的10粒番茄種子產(chǎn)生了足以使所述磁珠飽和的DNA，因此，獲得了全部樣品 的高度均勻且相當?shù)腄NA濃度。和ADNA參照比較，估計各樣品濃度為30ng/μ 1。將2倍 稀釋的DNA進行4倍平板混合（4fold flat pooled)。將2 μ 1混合的DNA用于多重PCR以 進行突變檢測分析。
[0206] 使用計算機程序（Primer3, http://primer3. sourceforge. net/)設(shè)計用于擴增 HRM的基因片段的引物。擴增產(chǎn)物的長度被限制在200和400個堿基對之間。通過應當產(chǎn) 生單一產(chǎn)物的測試PCR反應來測定所述引物的質(zhì)量。
[0207] 聚合酶鏈式反應（PCR)擴增基因片段。將IOng基因組DNA與4 μ L反應緩沖液 (5 X 反應緩沖液）、2 μ L 10 X LC 染料（LCGreen+ 染料，Idaho Technology Inc. , UT, USA)、 各 5pmole 的正向和反向引物、4nmole dNTPs(Life Technologies,NY,USA)和 1 單位 DNA 聚 合酶（Hot Start II DNA聚合酶）混合，總體積為10 μ L。反應條件為：98°C 30秒，接著40 個循環(huán)的98°C 10秒、60°C 15秒、72°C 25秒，最后72°C 60秒。
[0208] 已經(jīng)證明，高分辨熔解曲線分析（HRM)在人類和植物遺傳學中是靈敏且高通量 的方法。HRM是一種非酶學篩選技術(shù)。在PCR擴增過程中，染料（LCGreen+染料，Idaho Technology Inc.，UT, USA)分子插入到雙鏈DNA分子的每對退火的堿基對之間。在所述分 子中被捕獲時，所述染料在470nm處激發(fā)后在5IOnm處發(fā)射熒光。當DNA樣品被逐漸加熱 時，焚光檢測器（LightScanner, Idaho Technology Inc.，UT, USA)中的照相機記錄焚光強 度。在取決于DNA螺旋的序列特異性的穩(wěn)定性的溫度下，雙鏈PCR產(chǎn)物開始熔解，釋放出所 述染料。染料的釋放導致被熒光檢測器記錄為熔解曲線的熒光降低。含有突變的混合物在 PCR后的片段混合物中形成異質(zhì)雙鏈體。與同質(zhì)雙鏈體相比，這些被鑒定為差異熔解溫度曲 線。
[0209] 通過重復對來自所鑒定的相應DNA混合物的單個M2種子批的DNA進行HRM分析 來確認單個植物中具體突變的存在情況。根據(jù)HRM圖譜，當在所述4個單個M2家族的DNA 樣品的一個中確認了所述突變的存在時，則對PCR片段進行測序以鑒定基因中的突變。
[0210] 一旦知道了突變，則使用計算機程序C0DDLe(用于選擇密碼子以優(yōu)化有害損傷的 發(fā)現(xiàn)，http://www. proweb. org/coddle/)來預測這個突變的作用，所述程序鑒定了用戶所 選擇的基因和其編碼序列的區(qū)域，在該區(qū)域中所預測的點突變最有可能對基因功能產(chǎn)生有 害效應。
[0211] 播種來自含有對蛋白質(zhì)活性有預期作用的突變的M2家族的種子，用于所述植物 的表型分析。
[0212] 在自交和隨后的選擇后選擇或獲得純合型的突變體。確定所述突變對所述植物的 相應蛋白質(zhì)和表型的效應。
[0213] 使含有所述不同的鑒定的突變的種子萌發(fā)，并將植物在溫室中種植在帶有土壤的 盆（pot)中，所述溫室的光暗方案（regime)是16/8,夜間溫度18°C，日間溫度22-25°C。對 于每種基因型，種植了 5株植物。將第二、第三和第四花序用于分析。修剪所述花序，在每 個花序上留下6朵花，使所述6朵花能夠通過自花授粉結(jié)出果實。記錄第一和第六朵花的 果實形成的日期以及所述第一和第六顆果實的破色期和紅熟期的日期。在第六顆果實的破 色期，收獲番茄串（truss)并將其儲存于溫室中的開口盒子里。在整個成熟階段中記錄所 述果實的狀況。
[0214] 在后期，基于對果實的視覺評估來確定果實狀況，并記錄最老的果實變"壞"的日 期，并進一步記錄果實變質(zhì)情況（由通過夾緊果實所評估的進一步果實軟化度，以及對脫 水/失水、果皮破損和真菌生長的視覺評估所指示）。
[0215] 鑒定了下述突變體：突變體783、突變體2145、突變體2714、突變體3793、突變體 4946、突變體7871和突變體8185,并將種子以上文給出的登錄號保藏在NCMB。
[0216] 上文已描述與SEQ ID NO: 9中所示野生型Acs2的cDNA相比的所述核苷酸序列中 的突變，以及所述突變對美一種突變體的蛋白序列的影響。
[0217] 在所述靶序列中含有突變的植物（例如上文的突變植物或由其得到（例如通過自 交或雜交）并含有突變acs2等位基因的植物）與野生型植物相比，除番茄果實的成熟外， 所有植物部分都表現(xiàn)為正常的營養(yǎng)生長。對在所述靶序列中含有突變的植物的果實成熟、 乙烯產(chǎn)生和貯藏期進行表型上的篩選。
[0218] 實施例2
[0219] 所述acs2突變體的成熟行為
[0220] 使含有所述不同突變的種子萌發(fā)，并將植物在溫室中種植在帶有土壤的盆中，所 述溫室的光暗方案是16/8,夜間溫度18°C，日間溫度22-25°C。對于每種基因型，種植了 5 株植物。將第二、第三和第四花序用于分析。修剪所述花序，在每個花序上留下6朵花，使 所述6朵花能夠通過自花授粉結(jié)出果實。記錄第一和第六朵花的果實形成的日期，以及第 一和第六顆果實的破色期和紅熟期的日期。在第四顆果實的紅熟期，收獲番茄串（truss) 并將其儲存于溫室中的開口盒子里。在整個成熟階段通過從每個番茄串拍攝照片來記錄所 述果實的狀況。收獲后，對含有來自一種基因型的所有番茄串的每個盒子拍攝照片。
[0221] 在后期，基于對果實的視覺評估來確定果實狀況，并記錄最老的果實變"壞"的日 期，并進一步記錄果實變質(zhì)情況（由通過夾緊果實所評估的進一步果實軟化度，以及對脫 水/失水、果皮破損和真菌生長的視覺評估所指示）。
[0222] 圖2示出了果實的成熟行為。將野生型植物的第一果實進入破色期的那天記為第 一天。對此后的天數(shù)以連續(xù)的天數(shù)進行編號。突變體表現(xiàn)出成熟延遲，即所述突變體的果 實需要更多天來變紅和/或變"壞"。特別是，突變體3793和突變體2714表現(xiàn)出數(shù)天的顯 著延遲。突變體3793表現(xiàn)出從第一顆果實處于破色期至100%的果實處于紅熟期該突變體 花費了更多的時間。
[0223] 本發(fā)明植物的果實的特征在于破色期開始較晚（例如突變體783、2145、2714、 3793)。下文示出了收獲后的特征。將野生型植物的第一果實進入破色期的那天記為第一 天。對此后的天數(shù)以連續(xù)的天數(shù)進行編號。
[0226] 可以看出，突變果實更晚進入破色期。同樣的，突變果實更晚進入紅熟期，并且突 變株系的第一果實處于"壞"的階段的日期也明顯晚于野生型。
[0227] 實施例3
[0228] 乙烯釋放
[0229] 用基于激光的乙稀檢測器（ETD-300, Sensor Sense B. V.，Ni jmegen, the Netherlands)結(jié)合氣體處理系統(tǒng)（Cristescu et al.，Laser-based systems for trace gas detection in life sciences. Appl Phys B 2008 ;92pp343_349)來實時測量番前 果實釋放的乙烯。每次實驗使用6個玻璃比色皿（IOOmL體積），其中一個作為沒有植 物材料的參照。對實驗室空氣取樣并使所述空氣通過基于鉑的催化劑（Sensor Sense B. V.，Nijmegen, the Netherlands)以去除微量乙稀或其他碳氫化合物。在樣品和檢測器之 間放置帶有KOH和CaClJ^滌氣器，以分別降低氣流中的CO 2濃度（至低于Ippm)和減少含 水量。
[0230] 比較突變體2145、2714、3793、4946、7871和8185與野生型（Tapa)的果實在粉紅 期和紅熟期所釋放的乙烯（如圖1所示），顯示了在這些階段的至少一個中，所有突變體的 乙烯產(chǎn)生都比野生型（Tapa)低。Tapa是用于商業(yè)加工番茄的高度純合的近交親本株系 (Gady et al，2012Molecular Breeding 29pp 801-812 中的TPMDASU)，并且是野生型Acs2 等位基因純合型（Acs2/Acs2)。突變體2145、3793和4946在所述兩個階段中與Tapa相比 產(chǎn)生更少的乙烯，而突變體2714和8185僅在粉紅期產(chǎn)生更少的乙烯，突變體7871僅在紅 熟期產(chǎn)生更少的乙烯。
[0231] 在粉紅期，突變體2145產(chǎn)生的乙烯比野生型少約14%，突變體2714產(chǎn)生的乙烯 比野生型少約5 %，突變體3793和8185產(chǎn)生的乙烯比野生型少約39 %至約47 %。突變體 4946在粉紅期產(chǎn)生的乙烯比野生型少約80%:突變體為〈1. 0nV(h *g)而野生型為4. 8nl/ (h*g)。而在紅熟期，突變體2714和8185產(chǎn)生的乙烯分別比野生型多14%和12%。在紅 熟期，突變體3793產(chǎn)生的乙烯比野生型少約8%，突變體7871、2145和4946產(chǎn)生的乙烯分 別比野生型少約29%、33%和40%。其中111八11，8)指每克果實每小時納升。
[0232] 實施例4
[0233] 番茄果實硬度/壓縮測試
[0234] 從2月到9月，在標準溫室條件下，在5L盆中播種突變體8185株系的種子并生 長出6個植株。選擇并標記每個植株的3串番茄。從每個果實串中選擇第三和第四番茄， 用于成熟過程中的果實發(fā)育和軟化分析。每個植株共有6顆番茄用于分析。記錄每顆番 茄的破色期、黃色/粉紅期和完全紅熟期的日期。根據(jù)新鮮番茄等級的美國標準（United States Standards for Grade of Fresh Romatoes) (USDA ; 1997,US department of Agriculture, Agricultural Marketing, Service, Washington, DC)來定義時期。通過番前 顏色（RHS比色圖表）來確定番茄成熟期。綠熟期，144B ;破色期，N144D ;橙色期，N163C/D ; 紅熟期，44A/B ;過熟期（壞的），N34A和46A。
[0235] 對進入完全紅熟期（第0天）的番茄進行標記，并且將其從植株摘下用于分析或 者將其留在植株上以待在之后的時間點分析。在后一種情況中，在完全紅熟后第3、7、10、14 或18天采摘被留在植株上的果實，用于分析。因此，在每個時間點采摘6顆果實。測量后 將收獲的番茄貯存于22°C下。使用由運行Bluehill 3程序（Instron)的計算機控制的食 品質(zhì)地測定儀（texturometer) (Compressor/load frame Instron, http://www. instron. us, System ID:3342L2018;Force Transducer model2519_104)來測量果實硬度。
[0236] 根據(jù)以本發(fā)明人的偏好調(diào)整的由Sirisomboon和Tanaka開發(fā)的方法（Panmanas Sirisomboon, Munehiro Tanaka, Takayuki Kojima 2012Evaluation of tomato textural mechanical properties. J Food Engineeringlll, 618-624)來測量番前的硬度。在兩個鋼 板（上方鋼板是測壓傳感器平臺（load cell plateau))之間壓縮果實，每秒移動1mm，產(chǎn)生 增加的力直到達到4牛頓。通過經(jīng)驗測定此力為高到足以產(chǎn)生可定量的果實壓縮而不損傷 果實組織，還允許重復測量。此后立即將壓力釋放到0.1N。然后再次增大壓力直到測量到 4N。從兩次測量中計算力從0.1 N增加至4N的過程中的平均變形（Dav，Dav/3. 9(mm/N))。因 為果實大小不同，所以相對于果實直徑來計算變形（Drel = Dav/果實直徑（mm/(N · cm))。 將果實的硬度表示為每cm果實減小果實直徑lmm(10% )所需的力（硬度=1/Drel (N))。
[0237] 第0天相當于收獲果實并初次測量的那天。因此，對相同的果實進行4次測量以 在第7、7、14和21天獲得數(shù)據(jù)點。果實硬度測量表明，突變體8185具有更高的硬度，特別 是在約第7、14和/或21天，在這些時間點，對于突變體8185的果實，每cm果實減小果實 直徑Imm (10 % )需要增加約IN以上。
【主權(quán)項】
1. 一種番前（Solanumlycopersicum)種的栽培植物，其包含具有一個或多個突變的 acs2等位基因，所述突變導致產(chǎn)生突變acs2蛋白，其中所述突變acs2蛋白具有一個或多個 選自野生型Acs2蛋白中的41011\4101￥、41031\61121?、？1181、￥147￡和0265￥的氨基酸改 變，所述蛋白與SEQIDNO: 1具有至少85%的氨基酸序列同一性。2. 權(quán)利要求1的栽培植物，其中所述突變導致產(chǎn)生與野生型Acs2蛋白相比功能喪失或 功能降低的突變acs2蛋白，所述野生型Acs2蛋白是與SEQIDNO: 1具有至少85%的氨基 酸序列同一性的蛋白。3. 權(quán)利要求1或2的栽培植物，其中與編碼所述野生型Acs2蛋白的野生型Acs2等位 基因純合型的番茄相比，所述一個或多個突變導致降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的果實成熟 和/或更長的貯藏期。4. 權(quán)利要求1、2或3中任一項的栽培植物，其中與編碼所述野生型Acs2蛋白的野生型 Acs2等位基因純合型的番茄相比，所述一個或多個突變導致番茄果實需要顯著更多天以到 達紅熟期。5. 前述權(quán)利要求中任一項的栽培植物，其中與編碼所述野生型Acs2蛋白的野生型 Acs2等位基因純合型的番茄相比，所述一個或多個突變導致番茄果實需要顯著更多天以到 達壞的階段。6. 權(quán)利要求1至5任一項的栽培植物，其中與編碼所述野生型Acs2蛋白的野生型Acs2 等位基因純合型的番茄相比，所述一個或多個突變導致所述植物的番茄果實的乙烯產(chǎn)生降 低至少10%。7. 前述權(quán)利要求中任一項的植物，其中所述植物是Fl代雜交植物。8. 前述權(quán)利要求中任一項的植物，其中具有一個或多個突變的acs2等位基因是純合 形式。9. 前述權(quán)利要求中任一項的栽培植物，其中所述植物還包含具有一個或多個突變的 acs4等位基因，所述acs4等位基因中的所述突變導致產(chǎn)生突變acs4蛋白，所述突變acs4 蛋白與野生型Acs4蛋白相比功能喪失或功能降低并且與GenBank登錄號M63490. 1所提供 的Acs4氨基酸序列具有至少85%的氨基酸序列同一性；并且任選地，其中所述突變acs4 等位基因獲得自突變體2477和/或突變體4043和/或突變體4222和/或突變體4303和 /或突變體4691和/或突變體5251。10. 可以生長出前述權(quán)利要求任一項的植物的種子。11. 包含acs2蛋白的權(quán)利要求1-9中任一項的植物的番茄果實、種子、花粉、植物部分 或后代，所述acs2蛋白具有一個或多個選自野生型Acs2蛋白中的A101T、A101V、A103T、 61121?、？1181、￥147￡和0265￥的氨基酸改變，所述蛋白與5￡〇10勵 ：1具有至少85%的氨 基酸序列同一性。12. 權(quán)利要求11的番茄果實，其中與野生型Acs2等位基因純合型的番茄植物的果實相 比，所述番茄果實具有降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或增加的貯藏期。13. 權(quán)利要求12的果實，其中所述貯藏期比野生型Acs2等位基因純合型的番茄果實的 貯藏期長至少2天。14. 權(quán)利要求12的果實，其中所述降低的乙烯產(chǎn)生是與野生型Acs2等位基因純合型的 番前相比降低至少10%。15. 權(quán)利要求6的植物或權(quán)利要求14的果實，其中在所述果實的粉紅期和/或紅熟期 測定所述降低的乙烯產(chǎn)生。16. 包含權(quán)利要求11-14中任一項的果實或所述果實的果實部分或者由權(quán)利要求 11-14中任一項的果實或所述果實的果實部分組成的食品或食品產(chǎn)品。
【專利摘要】本發(fā)明涉及番茄種的栽培植物，其包含具有一個或多個突變的acs2等位基因，所述突變導致產(chǎn)生與野生型Acs2蛋白相比acs2蛋白功能喪失或功能降低的突變acs2蛋白。NCIMB 4203220120821NCIMB 4203320120821NCIMB 4203420120821NCIMB 4203520120821NCIMB 4203620120821NCIMB 4203720120821NCIMB 4203820120821NCIMB 4203920120821NCIMB 4204020120821NCIMB 4204120120821NCIMB 4204220120821NCIMB 4204320120821
【IPC分類】C12N15/82, A01H5/08, C12N9/88
【公開號】CN104936438
【申請?zhí)枴緾N201380071061
【發(fā)明人】H·W·維里森
【申請人】紐海姆有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2013年11月20日
【公告號】CA2891720A1, EP2931026A1, US20150282446, WO2014079896A1