的植物雜交然后選擇含有所述突變等位基因的子代）容易地 將在具體的番茄植株中或在番茄的性相容近緣種中產(chǎn)生和/或鑒定的突變等位基因轉(zhuǎn)移 到任何其他的番茄植物中。
[0170] 任何番茄植物或植物部分中的本發(fā)明的突變acs2等位基因的存在或不存在和/ 或所述等位基因到后代植物的遺傳，都可以從表型上和/或使用分子工具來確定（例如使 用直接或間接的方法檢測acs2核苷酸或acs2蛋白的存在或不存在）。
[0171] 在一個實施方案中，在栽培植物中產(chǎn)生或鑒定所述突變等位基因，但是也可以在 野生植物或非栽培植物中產(chǎn)生和/或鑒定所述突變等位基因，然后使用例如雜交和選擇 (任選地使用種間雜交與例如胚胎拯救來轉(zhuǎn)移所述突變等位基因）將其轉(zhuǎn)移到栽培植物 中。因此，可以在番茄或其他茄屬種中產(chǎn)生（使用誘變技術(shù)誘變所述靶acs2基因或其變 體的人工誘導(dǎo)突變）和/或鑒定（自發(fā)的或天然的等位基因變異）突變acs2等位基因， 然后通過傳統(tǒng)育種技術(shù)將其轉(zhuǎn)移到栽培的茄屬植物例如番茄中，所述茄屬種包括例如番茄 的野生近緣種，如契斯曼尼番前、智利番前、多毛番前（(S. habrochaites, L. hirsutum))、 克梅留斯基番前、S. Iycopersicum X S.peruvianum、多腺番前（S.glandulosum)、多毛番 前（S.hirsutum)、小花番前（S.minutum)、小花番前（S.parviflorum)、潘那利番前、秘魯番 前、S. peruvianum var. humifusum和細(xì)葉番前。術(shù)語"傳統(tǒng)育種技術(shù)"在本文中包括育種者 已知的雜交、自交、選擇、雙單倍體產(chǎn)生、胚胎拯救、原生質(zhì)體融合、通過中間物種的轉(zhuǎn)移等， 即除了遺傳修飾之外的可轉(zhuǎn)移等位基因的方法。
[0172] 在另一個實施方案中，將含有突變acs2等位基因的植物（例如番茄）與相同種或 相近種的另一植物雜交，以產(chǎn)生含有所述突變acs2等位基因的雜交植物（雜交種子）。所 述雜交植物也是本發(fā)明的一個實施方案。
[0173] 在一個實施方案中，提供了Fl代雜交番茄種子（即，可以用于生長出Fl代雜交 番茄植物的種子），其含有至少一個本發(fā)明的acs2等位基因。Fl代雜交種子是從兩個近交 番茄親本植株之間的雜交中收獲的種子。這類Fl代雜種可以包含一個或兩個本發(fā)明的突 變acs2等位基因。這類包含兩個本發(fā)明的突變acs2等位基因的Fl代雜種可以包含本發(fā) 明的相同acs2等位基因的兩個拷貝或兩個不同的acs2等位基因。因此，在一個實施方案 中，將本發(fā)明的植物用作親本植物以產(chǎn)生Fl代雜種，所述Fl代雜種的果實與野生型Acs2/ Acs2植物相比具有降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或更長的貯藏期。
[0174] 還提供了將突變acs2等位基因轉(zhuǎn)移到另一植物的方法，所述方法包括提供在其 基因組中含有突變acs2等位基因的植物，由此所述包含突變等位基因的植物產(chǎn)生與野生 型Acs2等位基因純合型的番茄相比表現(xiàn)出降低的乙烯產(chǎn)生和/或更慢的果實成熟和/或 更長的貯藏期的果實（如上文所述），將所述植物與另一植物雜交并獲得所述雜交的種子。 任選地，可以將從這些種子獲得的植物進(jìn)一步自交和/或雜交，并選擇這樣的后代，即其含 有所述突變等位基因且由于所述突變等位基因的存在而產(chǎn)生與含有野生型Acs2等位基因 的植物相比具有延遲的成熟和/或更長的貯藏期和/或降低的乙烯產(chǎn)生的果實。
[0175] 如所述，應(yīng)當(dāng)理解，其他誘變和/或選擇方法可以等同地用于產(chǎn)生本發(fā)明的突 變植物。例如可以對種子進(jìn)行輻射或化學(xué)處理以產(chǎn)生突變?nèi)后w。也可使用acs2的直接 基因測序來篩選誘變的植物群中的突變等位基因。例如，KeyPoint篩選是可以用于鑒 定含有突變acs2等位基因的植物的基于測序的方法（Rigola et al.PloS One, March 2009, Vol4(3) :e4761) 〇
[0176] 因此，提供了非轉(zhuǎn)基因的突變番茄植物，所述番茄植物在果實中產(chǎn)生更低水平的 野生型Acs2蛋白、或在果實中完全缺失野生型Acs2蛋白，并且由于一個或多個內(nèi)源性acs2 等位基因中的一個或多個突變而在果實中產(chǎn)生功能喪失的acs2蛋白或功能降低的acs2蛋 白。可以通過誘變方法例如TILLING或其變型來產(chǎn)生這些突變體，或可以通過EcoTILLING 或通過任何其他方法來鑒定所述突變體。可以將編碼功能喪失的acs2蛋白或功能降低的 acs2蛋白的Acs2等位基因分離并測序，或可以通過傳統(tǒng)育種方法將其轉(zhuǎn)移到其他植物中。
[0177] 提供了基因組中含有本發(fā)明的突變acs2等位基因的所述植物或其后代的任意部 分，包括收獲的果實、收獲的組織或器官、種子、花粉、花、子房等。還提供了在其基因組中含 有突變acs2等位基因的植物細(xì)胞培養(yǎng)物或植物組織培養(yǎng)物。優(yōu)選地，所述植物細(xì)胞培養(yǎng) 物或植物組織培養(yǎng)物可再生為在其基因組中含有突變acs2等位基因的完整植株。本文還 包括通過對含有acs2突變等位基因的單倍體細(xì)胞進(jìn)行染色體加倍而產(chǎn)生的雙單倍體植物 (以及可以用于生長出所述雙單倍體植物的種子），和其基因組中含有突變acs2等位基因 的雜交植物（以及可以用于生長出所述雜交植物的種子），籍此所述雙單倍體植物和雜交 植物產(chǎn)生本發(fā)明的成熟延遲和/或貯藏期更長的果實。
[0178] 本發(fā)明還涉及具有至少一個人工誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)基因突變的內(nèi)源性acs2蛋白，所述 非轉(zhuǎn)基因突變選自 SEQ ID N0:1 的 A101T、A101V、A103T、G112R、P118L、V147E 和 C265Y，或 涉及編碼所述蛋白的內(nèi)源性acs2等位基因。
[0179] 另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的番茄種的栽培植物或植物部分（例如種子），其除 了包含如本文所述的acs2等位基因的一個或多個突變以外，還包含具有一個或多個突變 的acs4等位基因，在所述acs4等位基因中的所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生與番茄野生型Acs4蛋白相 比功能喪失或功能降低的突變acs4蛋白，所述野生型Acs4蛋白具有如圖5中所示和/或 獲得自基于Genbank登錄號AAA34131. 1 (由Genbank登錄號M63490. 1編碼）的mRNA的蛋 白序列。
[0180] "功能降低的acs4蛋白"或"活性降低的acs4蛋白"是指突變acs4蛋白，與野生 型Acs4蛋白相比，其具有降低的催化由S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，從而導(dǎo)致 乙烯合成減少。當(dāng)編碼所述突變蛋白的等位基因以純合或雜合形式存在于番茄植物中時， 所述acs4蛋白的催化活性的降低影響了包含這類功能降低的acs4蛋白的果實的成熟行 為，即果實的成熟延遲或貯存期更長。這種功能降低的acs4蛋白可以通過"部分敲除突變 acs4等位基因"（例如，在其核酸序列中包含一個或多個突變的野生型Acs4等位基因）的 轉(zhuǎn)錄和翻譯來獲得。在一個方面，這種部分敲除突變acs4等位基因是包含一個或多個突變 的野生型Acs4等位基因，所述突變優(yōu)選地導(dǎo)致產(chǎn)生其中至少一個保守的和/或功能性的氨 基酸被另一個氨基酸置換以使得生物活性顯著降低但不完全消失的acs4蛋白。但是，番茄 Acs4等位基因中的其他突變（例如一個或多個無義、錯義、剪接位點或移碼突變）也可以 導(dǎo)致功能降低的acs4蛋白，并且這種功能降低的蛋白與野生型Acs4蛋白相比，可以有一個 或多個氨基酸被替換、插入或缺失。這種部分敲除突變acs4等位基因也可以編碼顯性負(fù)性 的acs4蛋白，該蛋白能夠?qū)ν患?xì)胞內(nèi)的其他Acs4蛋白的生物活性產(chǎn)生不利影響。這種 顯性負(fù)性的acs4蛋白可以是這樣的acs4蛋白：其仍然能夠如野生型Acs4蛋白一樣與相 同的元件相互作用但是阻斷了其功能的一些方面。顯性負(fù)性的acs4蛋白的實例是這樣的 acs4蛋白：其缺少對于激活的關(guān)鍵的特定氨基酸殘基，或在所述特定的氨基酸殘基中具有 修飾，但是仍然包含其結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使得不僅其自身的生物活性降低或消失，而且它們還通 過與存在于細(xì)胞中的野生型和/或部分敲除acs4蛋白競爭結(jié)合位點從而降低細(xì)胞內(nèi)的總 acs4活性。突變等位基因可以是"天然突變"等位基因（其是天然存在的突變等位基因，例 如，沒有人工應(yīng)用誘變劑的情況下而自發(fā)產(chǎn)生的）或"誘導(dǎo)突變"等位基因（其是由人工干 擾誘導(dǎo)的，例如，通過誘變）。
[0181] "功能喪失的acs4蛋白"指突變acs4蛋白，其與野生型Acs4蛋白相比基本上沒有 從S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，致使與野生型Acs4蛋白相比乙烯合成減少。當(dāng) 編碼所述突變蛋白的等位基因以純合或雜合的形式存在于番茄植物中時，所述缺失催化活 性的合成影響了包含這種功能喪失的acs4蛋白的果實的成熟行為。這種"功能喪失的acs4 蛋白"的純合型番茄植物的果實仍可以產(chǎn)生由其他蛋白（例如其他Acs蛋白如AcslA)催化 的乙烯。因此，這種"功能喪失的acs4蛋白"的純合型番茄植物的果實仍可以成熟，但是成 熟可能延遲和/或貯存期可能更長。
[0182] -方面，所述突變acs4等位基因是存在于并且獲得自和/或可獲得自和/或來 源自和/或可來源自突變體2477和/或突變體4043和/或突變體4222和/或突變體 4303和/或突變體4691和/或突變體5251的種子的等位基因。這些acs4突變體已詳細(xì) 記載于EP申請?zhí)?2186606. 5中。優(yōu)選地，與功能性野生型Acs2和Acs4等位基因（例如 PusaSheetal、Tapa或TPAADASU)或其變體的純合型番前相比，所述acs2和/或acs4等位 基因中的所述突變導(dǎo)致番茄果實的降低的乙烯產(chǎn)生和/或更慢的果實成熟和/或更長的 貯藏期?？山?jīng)由本領(lǐng)域中已知的育種方法，通過使具有所需的acs2突變的植物與具有所需 的acs4突變的植物雜交而獲得所述植物。所述植物或植物部分可以是acs2突變或acs4 突變或acs2和acs4突變兩者的純合型或雜合型。因此，在遺傳上所述植物可以是acs2/ Acs2acs4/Acs4 或 acs2/acs2acs4/Acs4 或 acs2/Acs2acs4/acs4 或 acs2/acs2acs4/acs4〇
[0183] 優(yōu)選地，所述突變植物還具有良好的其他農(nóng)藝學(xué)特征，即與野生型植物相比，它們 的果實數(shù)目不減少和/或果實質(zhì)量不降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述植物是番茄植 物，所述果實是番茄果實，例如具有任何形狀、大小或顏色的加工的番茄、生鮮市場番茄。因 此，還提供了含有一個或兩個突變acs2等位基因的植物或植物部分的收獲產(chǎn)品。所述產(chǎn)品 包括下游的經(jīng)加工產(chǎn)品，例如番茄糊、番茄醬、番茄汁、切開的番茄果實、灌裝果實、干燥的 果實、去皮的果實等?？梢酝ㄟ^其基因組DNA中含有所述突變等位基因來鑒定所述產(chǎn)品。
[0184] 種子保藏
[0185] 實施例1的七（7)種番茄TILLING突變體（acs2突變體）的代表性種子樣本由 Nunhems B.V.保藏并根據(jù)布達(dá)佩斯條約按照 Expert Solution(EPC 2000, Rule 32(1)) 于2012年8月21日被接受保藏在NCMB Ltd.(英國蘇格蘭阿伯丁郡AB219YA，巴克斯 本，克萊伯斯通區(qū)，弗格森大廈（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9 YA, UK))。種子被給予以下保藏號：NCMB 42032(突變體 783)、 NCMB 42033(突變體 2145)、NCMB42035(突變體 2714)、NCMB 42036(突變體 3793)、 NCMB 42040 (突變體 4946)、NCMB 42042 (突變體 7871)、NCMB 42043 (突變體 8185)。
[0186] 實施例1的五（5)種番茄TILLING突變體（acs4突變體）的代表性種子樣本由 Nunhems B.V.保藏并根據(jù)布達(dá)佩斯條約按照 Expert Solution(EPC 2000, Rule 32(1)) 于2012年8月21日被接受保藏在NCMB Ltd.(英國蘇格蘭阿伯丁郡AB219YA，巴克斯 本，克萊伯斯通區(qū)，弗格森大廈（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9 YA, UK))。種子被給予以下保藏號：NCMB 42034(突變體 2477)、NCMB 42037(突變體 4043)、NCMB42038(突變體 4222)、NCMB 42039(突變體 4691)、NCMB 42041 (突變體5251)。這些acs4突變體已記載于歐洲專利申請?zhí)?2186606. 5 中。
[0187] 申請人要求，依據(jù)Rule 32(1)EPC或具有類似條款和規(guī)章的國家或條約的相關(guān)法 規(guī)，所述生物材料及其衍生的任何材料的樣本只向指定的專業(yè)人員提供，直至專利授權(quán)公 告或者提交之日起20年（如果所述申請被駁回、放棄、撤回或視為撤回）。
[0188] 在本申請未決期間，由美國專利局主任確定的有資格的人員可請求并獲得所述保 藏。受37 C.F.R. § 1.808(b)的制約，在專利授權(quán)時，保藏者針對所保藏材料的公眾可得 性提出的所有限制都會被永久取消。所述保藏在最近一次請求之后會被維持30年或5年 的時間，或被維持到專利的有效壽命期，以較長時間為準(zhǔn)，在此期間如果所述保藏一旦不能 存活，都要將其替換。申請人不會放棄任何本申請的專利或植物品種保護(hù)法（7USC 2321et seq.)授予的任何權(quán)利。
[0189] 實施例
[0190] 一般方法
[0191] 通過服務(wù)公司（BaseClear, The Netherlands, http://www. baseclear. com/)使用 與用于擴(kuò)增的引物相同的引物對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序。使用計算機(jī)程序（CLC Bio Main Work Bench, Denmark, www. clcbio. com)對所得到的序列進(jìn)行比對以鑒定核苷酸的改變。
[0192] 材料
[0193] 用于分析和誘變的水是在Milli-Q水整合系統(tǒng)--配有Q-gard T2筒和Quantum TEX筒的Milli-Q型Reference A+--中過濾的自來水。水的電阻為> =18M0hm。
[0194] 甲基磺酸乙酯（EMS)(純）獲得自Sigma，產(chǎn)品編號為M0880。
[0195] 番茄成熟和/或貯藏時間或周期的測量
[0196] 可通過本領(lǐng)域已知的多種方法測定番茄成熟和/或貯藏時間或周期，所述方法 例如定期對果實進(jìn)行視覺上的評估和/或測量果實硬度或軟化度、測量番茄果實中番茄 紅素的含量、果實的乙烯產(chǎn)生、果實的顏色或任何替代方法，或者方法的組合?？梢岳?通過對使用裝配有適當(dāng)探針（例如3mm的探針）的果實硬度計測量的單位為例如0.1mm 的變形阻力進(jìn)行評估，來測量果實的硬度（Mutschler et al，1992, Hortscience 27pp 352-355) (Martinez et al 1995Acta Horticulturae 412pp 463-469)。本領(lǐng)域中存在替 代的方法，例如使用食品質(zhì)地測定計（Bui et al. 2010 ;International Journal of Food Properties,第 13 卷，第 4 期，pp830_846) 〇
[0197] 可通過新鮮番前等級的美國標(biāo)準(zhǔn)（U. S. Dept of Agriculture, 1973, US standards for grades of fresh tomatoes, U. S. Dept Agr. Agr. Mktg. Serv.，Washington D. C.)用比 色計測量顏色（Mutschler et al, 1992, Hortscience 27pp 352-355)，或通過將所述顏色 與比色圖表如英國皇家園藝學(xué)會（RHS)比色圖表進(jìn)行比較（www. rhs.org. uk)來對果實顏 色進(jìn)行分類。
[0198] 可根據(jù) Fish et al. A quantitative assay for lycopene that utilizes reduced volumes of organic solvents. Fish et al.J.Food Compos. Anal. 2002, 15, 309-317的有機(jī)溶劑的體積降低的方法來確定番茄紅素含量?？梢?將該方法用于測定在完整的番茄果實上直接測量的番茄紅素的含量，并同時評估以 下基本理化特征：顏色、硬度、可溶性固體、酸度和pH(Clement et al，J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 9813-9818)。
[0199] 可以通過將果實放置在密閉空間中（例如在0. 5L的玻璃容器（glass holder) 中）來測量乙烯釋放。可在1小時后提取Iml容器氣體并可使用配有合適的檢測單元（例 如火焰離子化檢測器）和合適的柱子（例如內(nèi)徑為3. 5_并含有80/100目的活性氧化鋁 的3m不銹鋼柱）的氣相色譜儀（例如Hewlett-Packard 5890)對產(chǎn)生的乙稀氣體量進(jìn)行定 量。乙稀產(chǎn)生可以表示為每小時每克果實放出的乙稀的納升（nl)數(shù)（nl g^tT1) (Martinez et al 1995Acta Horticulturae 412pp 463-469)〇
[0200] 或者，如下文進(jìn)一步所述，可使用基于激光的乙稀檢測器（ETD-300, Sensor Sense B.V., Nijmegen, the Netherlands)結(jié)合氣體處理系統(tǒng)（Cristescu et al. , 2008Laser-based systems for trace gas detection in life sciences. Appl Phys B 2008 ;92pp 343 - 9)進(jìn)行的實時測量來測量乙烯產(chǎn)生。
[0201] 實施例1
[0202] 誘奪
[0203] 將商業(yè)化加工番茄育種中使用的高度純合的近交株系用于使用下述的方案的誘 變處理。種子在濕潤的Whatman?紙上吸漲24h后，將被分為各2500粒的8批次的約 20, 000粒種子浸泡在錐形燒瓶中的100mL超純水和1%濃度的甲基磺酸乙酯（EMS)中。將 燒瓶在室溫下輕輕振蕩16小時。最后，在流水下將EMS沖洗掉。在EMS處理后，將種子直接 播種于溫室中。在60%的萌發(fā)種子中，將其中的10600株小植株（plantlet)移植到田里。 在這10600株小植株中，有1790株不育或在產(chǎn)生果實之前死亡。對于每個其余的Ml突變 植物，收獲一個果實并分離其種子。所得到的群體（命名為M2群體）由各代表一個M2家 族的8810個種子批組成。其中有585個家族由于種子形成率較低（low seed set)而將其 從所述群中排除。
[0204] 從源自每個M2種子批的10粒種子的混合物中提取DNA。對于每個突變株系，將 10粒種子在96孔深孔板的Micronic?深孔管（htt