在acs2基因中具有非轉(zhuǎn)基因改變的番茄植物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)和植物育種的領(lǐng)域。提供了包含具有一個或多個突變的 acs2等位基因的番前（Solanum Iycopersicum)植物，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型Acs2蛋 白相比acs2蛋白功能喪失的或活性降低的突變acs2蛋白。本發(fā)明提供了植物，與野生型 Acs2等位基因純合型的番茄相比，所述植物的果實顯示出更低的乙烯產(chǎn)生和/或更慢的果 實成熟和/或更長的貯藏期。此外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的番茄植物的番茄果實、種子、花 粉、植物部分和后代。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明植物果實或由其組成的食品和食品產(chǎn)品。
[0002] 本發(fā)明還提供了內(nèi)源性acs2基因和由所述基因編碼的acs2蛋白，具有至少一個 人工誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)基因突變。
[0003] 在另一個實施方案中，本文提供了用來制備在其基因組中包含一個或多個突變 acs2等位基因的番茄植物的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 番茄的育種的目的在于產(chǎn)生被最佳地改造為適于生長和貯藏條件的商業(yè)品種。育 種者面臨的挑戰(zhàn)是在收獲后的果實硬度與消費者對味道、質(zhì)感和顏色的需求之間尋找一種 改進(jìn)的平衡。這些消費者需求與果實成熟密切相關(guān)。果實成熟是一個復(fù)雜的發(fā)育過程，其負(fù) 責(zé)將含種子的器官轉(zhuǎn)化成能吸引種子傳播者（seed dispenser)和農(nóng)業(yè)消費者的組織。與 果實成熟相關(guān)的改變（特別是收獲后軟化）限制了新鮮番茄的貯藏期。
[0005] 對于番茄果實的生長和發(fā)育，可以識別出許多連續(xù)的階段：花發(fā)育，授粉，接著發(fā) 生特征為高頻率的細(xì)胞分裂的早期果實發(fā)育，而且所述果實的大小快速增大，這主要是由 于細(xì)胞擴(kuò)增。在第三階段結(jié)束時，果實達(dá)到綠熟期。在第四階段期間，發(fā)生果實成熟，其以 顏色和味道以及果實硬度和質(zhì)感的變化來表征。
[0006] 番茄紅素和胡蘿卜素的累積致使形成番茄果實的特征性紅色。一般而言，可區(qū) 分不同的著色階段：綠熟期（mature green)、破色期（breaker)、粉紅期（pink)和紅熟期 (red)。在破色期階段，開始了典型的紅色色素沉積。紅熟階段或紅熟收獲果實階段是果實 在其主要部分上都達(dá)到其成熟顏色的階段。
[0007] 除了所述顏色改變，在果實成熟過程中，酶活性導(dǎo)致細(xì)胞壁的中間層狀區(qū)域發(fā)生 降解，該降解導(dǎo)致表現(xiàn)為果實軟化和果實質(zhì)感喪失的細(xì)胞松弛。通常，果實軟化的測量方式 為對壓縮的外部抵抗力，這可以通過例如果實硬度計（penetrometer)進(jìn)行量化。
[0008] 對已知參與成熟的單個基因的修飾還沒有獲得正常成熟但具有最小的組織軟化 的果實。
[0009] 乙烯促進(jìn)呼吸躍變型果實例如番茄的成熟和衰老。乙烯通過增加1-氨基環(huán)丙 烷-1-羧酸（ACC)合酶（ACS)和ACC氧化酶（ACO)而自我催化其自身的生物合成。ACS也 稱作1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶；Le-ACS ;或S-腺苷基-L-甲硫氨酸甲基硫代腺苷-裂 解酶。因此，ACS和ACO的數(shù)量增加導(dǎo)致L-甲硫氨酸到乙烯的轉(zhuǎn)化增加。在番茄中已經(jīng)鑒 定了至少八種 ACS 基因（LEACS1A、LEACS1B 和 LEACS2-7) (Alexander et. al.，Journal of Experimental Botany，Vol 53，No 377, pp2039-2055, 2002)，并且各種 ACS 具有不同的表達(dá) 方式。
[0010] ACC合酶（ACS)是催化從S-腺苷基甲硫氨酸合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC) 的酶。然后ACO催化ACC轉(zhuǎn)化為乙稀。例如Stearns和Glick(Biotechnology Advances 2003, vol 21pp 193-210)描述了乙烯的生物合成，其以引用的方式納入本文。
[0011] ACS屬于5' -磷酸吡哆醛（PLP)依賴酶的α-家族，并且與該家族的其他成員 (如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AATase)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（TATase))具有適度水平的相 似性。Capitani等人已經(jīng)描述了來自不同來源的ACS的結(jié)構(gòu)。在對八種ACS蛋白（蘋 果（Malus domestica)、綠豆（Phaseolus aureus)、馬鈴薯（Solanum tuberosum)、天竺 葵（Pelargonium hortorum)、煙草（Nicotiana tabacum)、甜瓜(Cucumis melo)、番前 (Lycopersicon esculentum)和甘藍(lán)（Brassica oleracea))的序列比對中，他們描述了在 所述Capitani的出版物的圖1中所示的保守區(qū)（Capitani et al·，Journal of Molecular Biology, 1999, vol 294, pp745_756)〇
[0012] 已經(jīng)提出了在呼吸躍變型植物調(diào)節(jié)乙烯產(chǎn)生中起作用的兩個系統(tǒng)。第一個在正 常的營養(yǎng)生長中起作用（系統(tǒng)1);它是自我抑制的并且負(fù)責(zé)產(chǎn)生基礎(chǔ)乙烯水平，所述基礎(chǔ) 乙烯水平在所有組織（包括非呼吸躍變型植物的那些組織）內(nèi)都可以檢測到。系統(tǒng)1在 果實發(fā)育中繼續(xù)直到獲得達(dá)到果實成熟的能力。然后到達(dá)過渡期，在此期間，LEACS1A和 LEACS4被激活，導(dǎo)致乙烯水平升高。乙烯水平的升高誘導(dǎo)LEACS2的表達(dá)，所述LEACS2啟 動在呼吸躍變型果實的成熟過程中發(fā)揮作用的系統(tǒng)2。在系統(tǒng)2中，乙烯的產(chǎn)生是自我催 化的。已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物中使用LEACS2的反義抑制來研宄乙烯調(diào)節(jié)的這種復(fù)雜性（Barry et al.，Plant Physiology vol 123, pp 979-986, 2000)〇
[0013] W02005/016504公開了 "保綠"植物，即與標(biāo)準(zhǔn)對照相比其葉片衰老延緩的植物表 型。其公開了具有中斷的ACS2、ACS6、ASC7基因的植物，所述中斷抑制了所述ACS的表達(dá)或 活性。
[0014] Yokotani等人描述了所有已知LeEIL基因（乙稀不敏感類基因 （Ethylene Insensitive Like gene))均被抑制的轉(zhuǎn)基因番前以研宄乙稀生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制 (Yokotani et al, Journal of Experimental Botany, vol 60,pp 3433-3442, 2009)〇
[0015] 例如，已知來自Vijee Mohan等人的ACS2突變體。他們公開了（Vijee Mohan et al.Sol 2010,page 67http://www.sol2010.org/sol2010/files/file/S0L2010 Abstracts, pdf)番茄中的EcoTILLING，其中核苷酸序列多樣性被用作物種中存在的 遺傳變異的量度，特別是單核苷酸多態(tài)性（SNP)被用來代表基因組中最常見的變異。 EcoTILLING被用作在天然種群中快速發(fā)現(xiàn)多態(tài)性的高通量、低成本技術(shù)，其是通過使用錯 配特異性核酸內(nèi)切酶的異源雙鏈體分析來實現(xiàn)。從不同來源例如NBPGR(印度）、IIVR(印 度）和TGRC (美國加州）獲得番前品種（tomato accessions)的集合，并分析其中的ACS2 中天然存在的SNP的頻率。檢測了不同基因的許多SNP，但是其頻率不同。在不同發(fā)育階段 的形態(tài)學(xué)特征和化學(xué)型觀察結(jié)果表明在所述品種（accession)之間的廣泛變異。這些變異 與SNP的位置之間的相關(guān)性被認(rèn)為可用于發(fā)現(xiàn)對作物發(fā)育的有益的等位基因。
[0016] 對其中乙烯產(chǎn)生受到抑制的轉(zhuǎn)基因番茄果實（ACS2突變體）的研宄（Oeller et al,1991Science, vol 254, pp 437-439 ；Picton et al. 1993The Plant Journal vol 3pp 469-481)顯示出延遲的果實成熟，并揭示出乙烯在果實成熟中的關(guān)鍵性作用。
[0017] WO 92/04456公開了通過ACS的重組產(chǎn)生和通過使用反義技術(shù)或突變的ACS基因， 在番前和西萌蘆（zuchini)中控制受到乙稀影響的植物發(fā)育特征。
[0018] 盡管如此，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)適可于番茄果實成熟改良的等位基因。
[0019] 因此，需要具有改良的乙烯產(chǎn)生的栽培番茄植物，與野生型番茄植物相比，其番茄 果實具有延遲的成熟和/或更長的貯藏期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 因此，本發(fā)明的目的是產(chǎn)生并鑒定番茄種的栽培植物，所述栽培植物的果實具有 延遲的成熟和/或更長的果實貯藏期。
[0021] 因此，本發(fā)明涉及包含具有一個或多個突變的acs2等位基因的番茄種的栽培植 物，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生突變的acs2蛋白，其中所述突變的acs2蛋白具有一個或多個選自 SEQ ID NO: 1 或野生型 Acs2 蛋白中的 A101T、A101V、A103T、G112R、P118L、V147E 和 C265Y 的氨基酸改變，所述野生型Acs2蛋白與SEQ ID NO: 1至少有85%的氨基酸序列同一性，即 SEQ ID NO: 1的變體（如以下所定義）。
[0022] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物，其中所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型 Acs2蛋白相比acs2蛋白功能喪失或功能降低的突變acs2蛋白，其中所述野生型acs2蛋白 是與SEQ ID NO: 1有至少85%的氨基酸序列同一性的蛋白，并且當(dāng)所述突變等位基因以雜 合或純合形式存在時，所述突變acs2蛋白具有足夠的功能以使番茄果實成熟到紅熟期。
[0023] -般性定義
[0024] 術(shù)語"核酸序列"（或核酸分子）是指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，尤其是 編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的DNA。"分離的核酸序列"是指這樣的核酸序列，即其 不再處于分離出其的天然環(huán)境中，例如，在細(xì)菌宿主細(xì)胞中或者在植物細(xì)胞核或質(zhì)體基因 組中的核酸序列。
[0025] 術(shù)語"蛋白質(zhì)"或"多肽"可互換使用并且指的是由氨基酸鏈組成的分子，不管具體 的作用模式、大小、三維結(jié)構(gòu)或來源。因此，Acs2蛋白的"片段"或"部分"仍可以稱作"蛋 白質(zhì)"。"分離的蛋白質(zhì)"用于指不再處于其天然環(huán)境中的蛋白質(zhì)，例如在體外或者在重組的 細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中。
[0026] 術(shù)語"基因"指DNA序列，其包含與適合的調(diào)節(jié)區(qū)（例如啟動子）可操作地連接 的區(qū)域（轉(zhuǎn)錄區(qū)），所述區(qū)域（轉(zhuǎn)錄區(qū)）在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄為RNA分子（例如mRNA、hpRNA或 RNAi分子）。因此，基因可以包含若干個可操作地連接的序列，例如啟動子、含有例如參與 翻譯起始的序列的5'前導(dǎo)序列、（蛋白質(zhì)）編碼區(qū)（cDNA或基因組DNA)和含有例如轉(zhuǎn)錄 終止位點的3'非翻譯序列?；蚩梢允莾?nèi)源基因（在來源的物種中）或是嵌合基因（例 如轉(zhuǎn)基因或同源轉(zhuǎn)基因（cis-gene))。
[0027] "基因的表達(dá)"指與適合的調(diào)節(jié)區(qū)（特別是啟動子）可操作地連接的DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄 為RNA的過程，所述RNA具有生物活性，即其能夠被翻譯為有生物活性的蛋白質(zhì)或肽（或活 性肽片段）或其本身具有活性（例如，在轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNAi中具有活性）。編碼序列 可以是有義方向的并編碼所需的、有生物活性的蛋白質(zhì)或多肽、或活性肽片段。
[0028] "活性蛋白質(zhì)"或"功能性蛋白質(zhì)"是具有在體外（例如通過體外活性測定）和/或 在體內(nèi)（例如通過所述蛋白質(zhì)賦予的表型）可測量的蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)。"野生型"蛋白 質(zhì)是與SEQ ID NO: 1有至少85%的氨基酸序列同一性的完全功能性蛋白質(zhì)（還被稱為SEQ ID N0:1的變體）。同樣，野生型Acs2等位基因是編碼所述野生型蛋白質(zhì)或變體的等位基 因。本文的"突變蛋白質(zhì)"是在編碼該蛋白質(zhì)的核酸序列中包含一個或多個突變的蛋白質(zhì)， 其中所述突變導(dǎo)致（所述突變核酸分子編碼的）"功能降低"或"功能喪失"的蛋白質(zhì)，例 如在體內(nèi)可測量的（例如通過所述突變等位基因賦予的表型可測量的）。
[0029] "功能降低的acs2蛋白"或"活性降低的acs2蛋白"是指突變acs2蛋白，與野生 型Acs2蛋白相比，其具有降低的催化由S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，從而導(dǎo)致乙 烯合成減少。當(dāng)編碼所述突變蛋白的等位基因以純合或雜合形式存在于番茄植物中時，所 述acs2蛋白的催化活性的降低影響了包含這類功能降低的acs2蛋白的果實的成熟行為， 即果實的成熟延遲或貯存期更長。這種功能降低的acs2蛋白可以通過"部分敲除突變acs2 等位基因"（例如，在其核酸序列中包含一個或多個突變的野生型Acs2等位基因）的轉(zhuǎn)錄 和翻譯來獲得。在一個方面，這種部分敲除突變acs2等位基因是包含一個或多個突變的野 生型Acs2等位基因，所述突變優(yōu)選地導(dǎo)致產(chǎn)生其中至少一個保守的和/或功能性的氨基酸 被另一個氨基酸置換以使得生物活性顯著降低但不完全消失的acs2蛋白。但是，番茄Acs2 等位基因中的其他突變（例如一個或多個無義、錯義、剪接位點或移碼突變）也可以導(dǎo)致功 能降低的acs2蛋白，并且這種功能降低的蛋白與野生型ACS2蛋白相比，可以有一個或多個 氨基酸被替換、插入或缺失。這種部分敲除突變acs2等位基因也可以編碼顯性負(fù)性的acs2 蛋白，該蛋白能夠?qū)ν患?xì)胞內(nèi)的其他Acs2蛋白的生物活性產(chǎn)生不利影響。這種顯性負(fù)性 的acs2蛋白可以是這樣的acs2蛋白：其仍然能夠如野生型Acs2蛋白一樣與相同的元件相 互作用但是阻斷了其功能的一些方面。顯性負(fù)性的acs2蛋白的實例是這樣的acs2蛋白： 其缺少對于激活和/或二聚化的關(guān)鍵的特定氨基酸殘基，或在所述特定的氨基酸殘基中具 有修飾，但是仍然包含其結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使得不僅其自身的生物活性降低或消失，而且它們還 通過與存在于細(xì)胞中的野生型和/或部分敲除acs2蛋白競爭結(jié)合位點從而降低細(xì)胞內(nèi)的 總acs2活性。突變等位基因可以是"天然突變"等位基因（其是天然存在的突變等位基因， 例如，沒有人工應(yīng)用誘變劑的情況下而自發(fā)產(chǎn)生的）或"誘導(dǎo)突變"等位基因（其是由人工 干擾誘導(dǎo)的，例如，通過誘變）。
[0030] "功能喪失的acs2蛋白"指突變acs2蛋白，其與野生型Acs2蛋白相比基本上沒 有從S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，致使與野生型Acs2蛋白相比乙烯合成減少。 當(dāng)編碼所述突變蛋白的等位基因以純合或雜合的形式存在于番茄植物中時，所述缺失催化 活性的合成影響了包含這種功能喪失的acs2蛋白的果實的成熟行為。這種"功能喪失的 acs2蛋白"的純合型番茄植物的果實仍可以產(chǎn)生由其他蛋白（例如其他Acs蛋白如AcslA 或Acs4)催化的乙烯。因此，這種"功能喪失的acs2蛋白"的純合型番茄植物的果實仍可 以成熟，但是成熟可能延遲和/或貯存期可能更長。
[0031] 編碼蛋白質(zhì)的核酸分子中的"突變"是與野生型序列相比一個或多個核苷酸的改 變，例如通過一個或多個核苷酸的置換、缺失或插入。"點突變"是單個核苷酸的置換，或單 個核苷酸的插入或缺失。
[0032] "無義"突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的（點）突變，由此一個密碼子變?yōu)榻K止 密碼子。這導(dǎo)致在mRNA中存在提前終止密碼子并導(dǎo)致截短的蛋白。截短的蛋白可能具有 降低的功能或喪失功能。
[0033] "錯義"或非同義突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的（點）突變，由此一個密碼子 變?yōu)榫幋a不同氨基酸的密碼子。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能具有降低的功能或喪失功能。
[0034] "剪接位點"突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，由此前mRNA(pre-mRNA)的 RNA剪接發(fā)生改變，產(chǎn)生了具有與野生型不同的核苷酸序列的mRNA和具有與野生型不同的 氨基酸序列的蛋白質(zhì)。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能具有降低的功能或喪失功能。
[0035] "移碼"突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，由此mRNA的讀碼框發(fā)生改變，產(chǎn) 生不同的氨基酸序列。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能具有降低的功能或喪失功能。
[0036] 調(diào)節(jié)序列（例如基因的啟動子）中的突變是例如通過一個或多個核苷酸的置換、 缺失或插入造成的與野生型序列相比的一個或多個核苷酸的改變，從而導(dǎo)致例如產(chǎn)生減少 的或不產(chǎn)生所述基因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0037] "沉默"指下調(diào)或完全抑制靶基因或基因家族的基因表達(dá)。
[0038] 基因沉默方法中的"靶基因"是這樣的基因或基因家族（或基因的一個或多個具 體等位基因）：當(dāng)嵌合沉默基因（或"嵌合RNAi基因"）被表達(dá)并且例如產(chǎn)生沉默RNA轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物（例如能夠沉默內(nèi)源靶基因表達(dá)的dsRNA或發(fā)夾RNA)時，其內(nèi)源性基因表達(dá)被下調(diào)或 完全抑制（沉默）。在誘變方法中，靶基因是待突變的內(nèi)源基因，導(dǎo)致基因表達(dá)的改變（降 低或喪失）或所編碼的蛋白質(zhì)的功能的改變（降低或喪失）。
[0039] 本文使用的術(shù)語"可操作地連接"指處于功能性關(guān)系中的多核苷酸元件的連接。當(dāng) 一種核酸與另一核酸序列置于功能性關(guān)系中時，該核酸被"可操作地連接"。例如，如果啟動 子（或者更確切地說是轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列）影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子與所述編碼序列 可操作地連接。可操作地連接意指所連接的DNA序列通常是相鄰，并且當(dāng)需要連接兩種蛋 白質(zhì)編碼區(qū)時所連接的DNA序列是鄰近的且處于讀碼框中以產(chǎn)生"嵌合蛋白"。"嵌合蛋白" 或"雜合蛋白"是由不同的蛋白"結(jié)構(gòu)域"（或基序）組成的蛋白質(zhì)，所述蛋白本身不是天然 存在的，但是連接后形成了顯示出被連接的結(jié)構(gòu)域的功能的功能性蛋白。嵌合蛋白也可以 是兩個或更多個天然存在的蛋白的融合蛋白。
[0040] 術(shù)語"食品"是被消耗以給機(jī)體提供營養(yǎng)支持的任何物質(zhì)。其通常是植物或動物 來源的，并且包含必需營養(yǎng)物質(zhì)（例如碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素或礦物質(zhì)）。所述 物質(zhì)被生物體攝取并被生物體的細(xì)胞吸收以努力產(chǎn)生能量、維持生命或刺激生長。術(shù)語食 品包括被消耗以給人類和動物機(jī)體提供營養(yǎng)支持的物質(zhì)。
[0041] 術(shù)語"貯藏期"或"收獲后貯藏期"是指在果實被認(rèn)為不適合出售或食用（'壞的' 或'壞的階段'）之前給予果實的（平均）時間長度。貯藏期是產(chǎn)品能被儲存的時間段，在 該時期內(nèi)所定義的具體比例貨物的質(zhì)量在預(yù)期的分配、儲藏和展示的條件下仍然是可接受 的。貯藏期受以下幾個因素的影響：光和熱的暴露、氣體的傳送（包括濕度）、機(jī)械應(yīng)力和 例如微生物的事物的污染。通常圍繞所述果實的硬度/柔軟度參數(shù)對產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行數(shù)學(xué)建 模?？蓪①A藏期定義為植物株系的果實開始變壞并且不適合出售或食用時所花費的（平 均）時間，例如從植物的第一果實進(jìn)入破色期或轉(zhuǎn)色期（turning stage)開始或從第一果 實完全變紅開始或從收獲時開始。在一個實施方案中，本發(fā)明的突變體具有比野生型植物 的貯藏期顯著更長的貯藏期，例如，當(dāng)植物在相同的條件下生長并且果實被用相同的方式 處理且在相同的條件下保存時，從第一果實處于破色期（或轉(zhuǎn)色期、粉紅期、紅熟期或從收 獲時起）直到所述第一果實開始變'壞'并且不適合出售或食用的天數(shù)是明顯更長的，例 如，比對照植物（例如野生型Acs2/Acs2植物）的果實的貯藏期長至少1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10天或更多天。因此，為了確定從特定階段（例如從破色期或其后期階段）到變'壞'階 段所需要的