天數(shù)，例如，可以將野生型對照植物（在與突變體植物相同的條件下生長的并 且處于相同的發(fā)育階段）的第一果實進(jìn)入特定階段（例如，破色期或其后期階段）的那天 作為起點（第一天），從這天起定期（以特定的時間間隔，例如1、2、3、4、5或6天之后）觀 察果實，直到第一果實經(jīng)過完全成熟階段并變'壞'的那天（如視覺上和/或通過評估果實 柔軟度可測定的）。
[0042] 在本申請中，與詞語"貯藏期"結(jié)合使用的詞語"改善的"、"增加的"、"更長的"和 "延長的"可互換使用并且所有這些都是指本發(fā)明番茄植物的果實平均具有比所述對照果 實（Acs2/Acs2 果實，例如 Pusa Sheetal、Tapa 或 TPAADASU)更長的貯藏期。
[0043] "延遲的成熟"是指與野生型Acs2等位基因純合型（Acs2/ACS2)的植物的野生型 對照果實相比，本發(fā)明的番茄植物或植物株系（例如，突變體）的果實平均需要顯著更多 的天數(shù)以從番茄果實成熟的綠熟期、破色期、轉(zhuǎn)色期和/或粉紅期到達(dá)紅熟期。延遲成熟 可以在植物上測量和/或在收獲后作為特定百分比的果實（例如10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%和/或100%的果實）達(dá)到紅熟期所需的天數(shù)來進(jìn)行測量。如 果 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和/或100%的果實達(dá)到紅熟期所花 的天數(shù)與野生型對照果實達(dá)到相同百分比的紅色果實所花的天數(shù)相比至少長2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14或15天，則認(rèn)為該植物具有延遲成熟的表型。應(yīng)當(dāng)理解，對于在植 物上以及收獲后測量的延遲成熟，上文所舉例的天數(shù)（即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或15)與達(dá)到紅熟期階段的果實的每個％ (即10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80%、90%和/或100%)的各種組合都包含在本文中。例如，如果10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%和/或100%的果實達(dá)到紅熟期階段所花的天數(shù)與野生型對照 果實達(dá)到相同百分比的紅色果實所花的天數(shù)相比，長至少2天。另一個如何在植物上和/ 或收獲后測定延遲成熟的實例是100%的果實達(dá)到紅熟期階段所花的天數(shù)與野生型對照果 實達(dá)到相同百分比的紅色果實所花的天數(shù)相比長至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或15天。例如可以將野生型對照植物（在與突變植物相同的條件下生長并且處于相同的 發(fā)育階段）的第一果實進(jìn)入特定階段（例如破色期階段）的那天作為起點（第一天），從這 天起，定期（以特定時間間隔（例如1、2、3、4、5、或6天以后））對突變植物株系和對照植物 的處于破色期的果實的數(shù)目和處于紅熟期的果實的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)（參見實施例）。
[0044] 在本申請中，詞語"衰老"意指生物學(xué)衰老，即生物在其成熟后隨著其衰老而發(fā)生 的生物學(xué)變化。
[0045] 用于本文時，"降低的乙烯產(chǎn)生"在本文中是指在果實成熟過程中（例如在粉紅期 和/或淺紅期和/或紅熟期階段），本發(fā)明的番茄果實產(chǎn)生的乙烯的量（與野生型Acs2/ Acs2果實相比）在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低，如實施例中所描述，并且這可以通過實時乙烯測量 來測量。在一個實施方案中，乙烯水平在從粉紅期階段至紅熟期階段的果實成熟的整個過 程中顯著降低。
[0046] 應(yīng)當(dāng)理解，在不同植物株系之間進(jìn)行的比較包括在與一種或多種對照植物株系的 植物（優(yōu)選野生型植物）相同的條件下種植一種株系的多株植物（例如至少5株植物，優(yōu) 選每種株系至少10株植物），并且測定在相同環(huán)境條件下生長時的所述植物株系之間的統(tǒng) 計學(xué)顯著差異。
[0047] "破色期的延遲"指在相同條件下生長時，本發(fā)明突變體的第一果實和/或所有果 實與野生型對照相比需要顯著更多的天數(shù)以進(jìn)入破色期，例如與野生型對照相比至少多1 天，優(yōu)選至少多 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12 天。
[0048] 所述番茄果實的"成熟階段"可劃分如下：（1)綠熟期：表面完全是綠色的；綠色的 深淺可從淺色到深色不等。（2)破色期：在不多于10%的表面上存在顏色從綠色到棕黃色、 粉色或紅色的明確變化（break)。（3)轉(zhuǎn)色期：10%到30%的表面不是綠色的；整體來看， 顯示出從綠色到棕黃色、粉色、紅色或其組合的明確變化。（4)粉紅期：30%到60%的表面 不是綠色的；整體來看，顯示出粉紅或紅色。（5)淺紅期：60%到90%的表面不是綠色的； 整體來看，顯示出粉紅或紅色。（6)紅熟期：90%以上的表面不是綠色的；整體來看，顯示出 紅色。
[0049] 可通過使用全局或局部比對算法比對兩個肽或兩個核苷酸序列來確定"序列同一 性"或"序列相似性"。然后，當(dāng)通過例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序"Needle"（使 用默認(rèn)參數(shù)，參見下文）對序列進(jìn)行最佳比對時，這些序列共有至少某一特定的最小的序 列同一性百分比（如下文進(jìn)一步定義的）時，其可以被稱作"基本相同"或"基本相似"。這 些程序使用Needleman和Wunsch全局比對算法來對兩個序列的全長進(jìn)行比對，該算法最大 化匹配數(shù)并最小化空位數(shù)。通常，使用默認(rèn)參數(shù)，其中空位生成（gap creation)罰分=10， 空位延伸（gag extension)罰分=0.5(對于核苷酸和蛋白質(zhì)比對）。對于核苷酸，使用的 默認(rèn)得分矩陣是DNAFULL，而對于蛋白質(zhì)，默認(rèn)得分矩陣是Blosum62 (Henikoff&Henikoff， 1992, PNAS 89, 10915-10919)。例如可以使用計算機(jī)程序（例如 EMBOSS) (http://www. ebi. ac. uk/Tools/psa/emboss_needle/)來確定用于百分比序列同一"性的序列比對和得分?；?者，可以通過搜索數(shù)據(jù)庫（例如FASTA、BLAST等）來確定序列相似性或同一性，但是應(yīng)檢索 命中并進(jìn)行兩兩比對以比較序列同一性。如果百分比序列同一性為至少85%、90%、95%、 98%、99%或更高（例如至少 99. 1、99· 2、99· 3、99· 4、99· 5、99· 6、99· 7、99· 8、99· 9 或更高） (如使用默認(rèn)參數(shù)（即，空位生成罰分=10,空位延伸罰分=〇. 5)，對于核苷酸，使用得分矩 陣DNAFULL，對于蛋白質(zhì)，使用得分矩陣Blosum62)通過Emboss "Needle"所確定的），則兩 個蛋白質(zhì)或兩個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、或兩個核酸序列具有"基本序列同一性"。
[0050] 在本說明書及其權(quán)利要求中，動詞"包含"及其詞形變化以其非限制性的含義使 用，意指包括該詞之后所列的項目（item)，但是不排除未明確提到的項目。另外，由不定冠 詞"一"或"一個"提及一種要素（element)時，不排除存在超過一個所述元素的可能性，除 非上下文明確要求有且僅有一個所述元素。因此，不定冠詞"一"或"一個"通常指"至少一 個"。還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)本文中提到"序列"時，通常是指具有特定亞單位（例如氨基酸） 序列的實際物理分子。
[0051] 本文使用的術(shù)語"植物"包括完整的植物或其任何部分或衍生物，例如植物器官 (如收獲的或未收獲的果實、花、葉等）、植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可用于再生完整植物的 植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、可再生或不可再生的植物細(xì)胞、植物愈傷組織、植物細(xì)胞團(tuán)和植物 中完整的植物細(xì)胞、或植物的部分，例如胚胎、花粉、胚珠、子房、果實（例如收獲的組織或 器官，如收獲的番茄或其部分）、花、葉、種子、塊莖、無性繁殖的植物、根、莖、子葉、下胚軸、 根尖等。還包括任何發(fā)育階段，例如未成熟和成熟的幼苗等。
[0052] "植物株系"或"育種系"指植物及其后代。本文使用的術(shù)語"自交株系"指已經(jīng)被 反復(fù)自交的植物株系。
[0053] "植物品種"是在已知最低等級的相同植物分類中的一組植物，所述植物品種可以 基于源自某一特定基因型或基因型組合的特征的表達(dá)來定義（無論是否滿足《植物育種者 權(quán)利》(plant breeder's rights)中的識別條件），可以通過那些特征中的至少一種的表達(dá) 而將所述植物品種與任何其他組的植物區(qū)分開，也可將所述植物品種看作一個實體，因為 其可被繁殖而無任何改變。因此，如果它們的特征都在于存在1個基因座或基因（或者由 該單個基因座或基因產(chǎn)生的一系列表型特征），但是它們又在其它基因座或基因上可以彼 此顯著不同，那么即使它們是同一類的，也不可以使用術(shù)語"植物品種"來表述該組植物。
[0054] "F1、F2等"是指兩個親本植物或親本株系之間雜交后的連續(xù)相關(guān)世代。由兩個植 物或株系雜交產(chǎn)生的種子長出的植物稱為Fl代。Fl代植物自交產(chǎn)生F2代，等等。"F1雜 種"植物（或Fl種子）是由兩個近交的親本株系雜交得到的世代。"Ml群體"是某植物株 系或栽培種的多個誘變種子/植株。"M2、M3、M4等"指第一誘變種子/植株（Ml)自交后得 到的連續(xù)世代。
[0055] 術(shù)語"等位基因"是指特定基因座上的基因的一種或多種替代形式中的任一種，所 有這些等位基因均與特定基因座處的一種性狀（trait)或特征相關(guān)。在生物體的二倍體細(xì) 胞中，給定基因的等位基因位于染色體上的特定位置或基因座。一對同源染色體中的每條 染色體上存在一個等位基因。二倍體植物物種可以在特定基因座上包含大量不同的等位基 因。這些等位基因可以是所述基因的相同等位基因（純合的）或兩個不同的等位基因（雜 合的）。
[0056] 術(shù)語"基因座"是指染色體上的存在例如基因或遺傳標(biāo)記物的一個或多個具體位 置或位點。因此，ACS2基因座是在基因組中的存在ACS2基因的位置。
[0057] "野生型等位基因"（WT或Wt)在本文中是指編碼完全功能性蛋白（野生型 蛋白）的基因形式。這類編碼完全功能性Acs2蛋白的序列是例如基于Genbank登錄 號NM001247249. 1番前1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶mRNA (完整cdshttp: //www. ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/NM 001247249. 1 或 http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/ AY326958. 1)的 SEQ ID NO:9 中描述的野生型 Acs2cDNA(mRNA)序列或 SEQ ID NO: 17 中描 述的野生型Acs2基因組序列。SEQ ID N0:1中描述了由該野生型Acs2mRNA編碼的蛋白質(zhì) 序列。其由485個氨基酸組成。其他編碼完全功能性Acs2蛋白的等位基因（即賦予與SEQ ID NO: 1的蛋白相同程度的成熟和乙烯產(chǎn)生的等位基因）可能存在于其他番茄植物中并可 能與SEQ ID N0:1具有基本序列同一性，即與SEQ ID N0:1具有至少約85%、90%、95%、 98%、99%、99· 2%、99· 3%、99· 4%、99· 5%、99· 6%、99· 7%的序列同一性。這類完全功能 性野生型Acs2蛋白在本文中被稱作SEQ ID N0:1的"變體"。同樣的，編碼這類完全功能性 Acs2蛋白的核苷酸序列被稱作SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 17的變體。
[0058] 下面的突變acs2等位基因是本發(fā)明所鑒定的賦予降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的 成熟和/或延長的貯藏期的acs2突變的實例。值得注意的是，本文提到的核苷酸序列（SEQ ID N0:9-16)是編碼SEQ ID N0:l-8的蛋白的cDNA，即編碼DNA序列。顯然，當(dāng)提到這些 cDNA核苷酸序列時，應(yīng)當(dāng)理解，cDNA是相應(yīng)的番茄基因組acs2序列的編碼區(qū)，而番茄基因 組acs2序列還額外地包括內(nèi)含子，因此其核苷酸具有不同的編號。因此，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)提到 包含例如SEQ ID N0:9-16中的任一序列的acs2序列的番茄植物時，該番茄植物包含含有 編碼DNA(cDNA)的基因組acs2序列，SEQ ID N0:8-14的mRNA是從該編碼DNA(cDNA)轉(zhuǎn)錄 而來（并進(jìn)而被翻譯為蛋白質(zhì)）。除了 mRNA中的胸腺嘧啶⑴是尿嘧啶⑶之外，mRNA的 核苷酸序列與cDNA相同。此外，當(dāng)提到包含編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)（例如SEQ ID N〇:2、3、 4、5、6、7或8的突變蛋白）的核苷酸序列的番茄植物時，由于遺傳密碼的簡并性，其包含不 同的核苷酸序列。在一個實施方案中，所述植物包含SEQ ID N0:17中描述的基因組Acs2 序列或與其基本相同的基因組Acs2序列（例如與SEQ ID N0:17具有至少約70%、75%、 80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%的序列 同一性），但在所述序列特別是所述基因組序列的外顯子（外顯子1的范圍為第1至171位 核苷酸；外顯子2的范圍為第270至399位核苷酸，外顯子3的范圍為第485至644位核苷 酸，以及外顯子4的范圍為第1526至2523位核苷酸；將起始密碼子的ATG中的A計數(shù)為核 苷酸位置1)中具有一個或多個突變，導(dǎo)致所編碼的突變acs2蛋白的功能降低或功能喪失。
[0059] 本發(fā)明所鑒定的賦予降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或延長的貯藏期的一 個示例性突變acs2等位基因（突變體783)包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)中第103位氨基酸處 從丙氨酸（Ala或A)到蘇氨酸（Thr或T)的置換（A103T)的突變。SEQ ID NO: 2描述了突 變體783的蛋白序列。所述氨基酸的置換是由于SEQ ID N0:9的第307位核苷酸處的G到 A的突變，將起始密碼子ATG的A計數(shù)為核苷酸位置1。SEQ ID NO: 10描述了所述突變體 783的突變cDNA。
[0060] 本發(fā)明所鑒定的賦予降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或延長的貯藏期的另 一個示例性突變acs2等位基因（突變體2145)包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)中第112位氨基 酸處從甘氨酸（Gly或G)到精氨酸（Arg或R)的置換（G112R)的突變。SEQ ID NO: 3描述 了突變體2145的蛋白序列。所述氨基酸的置換是由于SEQ ID N0:9中所示的第334位核 苷酸處的G到A的改變，將起始密碼子ATG的A計數(shù)為核苷酸位置1。SEQ ID NO: 11描述 了所述突變體2145的突變cDNA。
[0061] 本發(fā)明所鑒定的賦予降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或延長的貯藏期的另 一個示例性突變acs2等位基因（突變體2714)包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:4) 中第118位氨基酸處從脯氨酸（Pro或P)變?yōu)榱涟彼幔↙eu或L) (P118L)的突變。SEQ ID N0:4描述了突變體2714的蛋白序列。所述氨基酸的置換是由于SEQ ID N0:9的第353位 核苷酸處的C到T的突變（C353T)，將起始密碼子ATG的A計數(shù)為核苷酸位置1。SEQ ID NO: 12描述了所述突變cDNA 2714。
[0062] 本發(fā)明所鑒定的賦予降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或延長的貯藏期的另 一個示例性突變acs2等位基因（突變體3793)包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:5) 中第101位氨基酸處從丙氨酸（Ala或A)變?yōu)槔i氨酸（Val或V) (AlOlV)的突變。所述氨 基酸的置換是由于SEQ ID N0:9的第302位核苷酸處的C到T的突變（C302T)，將起始密碼 子ATG的A計數(shù)為核苷酸位置1。SEQ ID NO: 13描述了所述突變cDNA。
[0063] 本發(fā)明所鑒定的賦予降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或延長的貯藏期的另 一個示例性突變acs2等位基因（突變體4946)包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:6) 中第101位氨基酸處從丙氨酸（Ala或A)變?yōu)樘K氨酸（Thr或T) (A101T)的突變。所述氨 基酸的置換是由于SEQ ID N0:9的第301位核苷酸處的G到A的改變（G301A)，將起始密碼 子ATG的A計數(shù)為核苷酸位置1。SEQ ID NO: 14描述了所述突變cDNA。
[0064] 本發(fā)明所鑒定的賦予降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或延長的貯藏期的另 一個示例性突變acs2等位基因（突變體7871)包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:7) 中第265位氨基酸處從半胱氨酸（Cys或C)變?yōu)槔野彼幔═yr或Y)(C265Y)的突變。所述 氨基酸的置換是由于SEQ ID N0:9的第794位核苷酸處的G到A的突變（G794A)，將起始密 碼子ATG的A計數(shù)為核苷酸位置1。SEQ ID NO: 15描述了所述突變cDNA。
[0065] 本發(fā)明所鑒定的賦予降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或延長的貯藏期的另 一個示例性突變acs2等位基因（突變體8185)包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:8) 中第147位氨基酸處從纈氨酸（Val或V)變?yōu)楣劝彼幔℅lu或E) (V147E)的突變。所述氨 基酸的置換是由于SEQ ID N0:9的第440位核苷酸處的T到A的改變（T440A)，將起始密碼 子ATG的A計數(shù)為核苷酸位置1。SEQ ID NO: 16描述了所述突變cDNA。
[0066] 本文中的"突變等位基因"是指與野生型等位基因相比在編碼序列（mRNA、cDNA或 基因組序列）中含有一個或多個突變的等位基因。這類突變（例如，一個或多個核苷酸的 插入、倒位、缺失和/或置換）可導(dǎo)致所編碼的蛋白具有降低的體外和/或體內(nèi)功能（功能 降低）或沒有體外和/或體內(nèi)功能（功能喪失），例如，由于所述蛋白例如被截短或者具有 其中一個或多個氨基酸被缺失、插入或置換的氨基酸序列。這類改變可導(dǎo)致蛋白質(zhì)具有不 同的3D構(gòu)象、被靶向到不同的亞細(xì)胞區(qū)室、具有經(jīng)修飾的催化結(jié)構(gòu)域、具有經(jīng)修飾的對核 酸或蛋白質(zhì)的結(jié)合活性等。
[0067] 本文中的"野生型植物"和"野生型果實"或"正常成熟"的植物/果實是指含有 編碼完全功能性Acs2蛋白的野生型（WT或Wt)Acs2等位基因（Acs2/Acs2)的兩個拷貝的 番茄植物（例如不同于含有突變acs2等位基因的"突變植物"）。這些植物為例如在表型 測定中的合適的對照。優(yōu)選地，野生型和/或突變植物是"栽培的番茄植物"。例如栽培種 Moneymaker、栽培種Ailsa Craig、栽培種Tapa以及許多其他栽培種都是野生型植物。 [0068] "番茄植物"或"栽培的番茄植物"是這樣的番茄的植物：即人工栽培并具有優(yōu) 良的農(nóng)藝學(xué)特征的番茄種的品種、育種系或栽培種；優(yōu)選地，這類植物不是"野生植物"， 所述野生植物即一般具有比栽培植物差得多的產(chǎn)量和差得多的農(nóng)藝特征以及例如在野生 群中天然生長的植物。"野生植物"包括例如物種的生態(tài)型、PI (植物引種）系、當(dāng)?shù)仄贩N (Iandrace)或野生登記物或野生近緣種。所謂的傳統(tǒng)品種（heirloom variety)或栽培 種一一即，通常在人類歷史的較早時期被種植并通常被改造為適于特定地理區(qū)域的自由授 粉品種或栽培種一一在本文中被作為栽培番茄植物被涵蓋在本發(fā)明的一個方面中。
[0069] 番前的野生近緣種（wild relative)包括：S. arcanum、克梅留斯基