一種木薯脫毒苗快速擴繁方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種木薯脫毒苗快速擴繁方法，屬于植物脫毒培養(yǎng)快繁技術(shù)領域。
【背景技術(shù)】
[0002] 木薯花葉病是木薯最重要病毒之一，往往會導致木薯產(chǎn)量損失50%以上，嚴重的 可超過80%，嚴重威脅木薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。對以木薯為主要食物的熱帶地區(qū)低收入農(nóng)戶來說， 不僅極大的影響了木薯種植的經(jīng)濟效益，更會嚴重威脅種植戶的食物來源，造成極其嚴重 的后果。木薯花葉病由許多不同種的雙生病毒科（Geminiviridae)引起，目前已經(jīng)鑒定的 病毒有7種，包括非洲木薯花葉病毒（Africancassavamosaicvirus，ACMV)、東非木薯花 葉病毒（EastAfricancassavamosaicCameroonvirus)、東非木薯花葉喀麥隆病毒（East AfricancassavamosaicCameroonvirus)、東非木薯花葉肯尼亞病毒（EastAfrican cassavamosaicKenyavirus)、東非木暮花葉馬拉維病毒（EastAfricancassavamosaic Malawivirus)、東非木薯花葉桑給巴爾病毒（EastAfricancassavamosaicZanzibar virus)和南非木薯花葉?。⊿outhAfricancassavamosaicvirus) 〇
[0003] 木薯花葉病毒可通過嫁接、汁液接種、種莖及昆蟲介體傳播，開始是在葉片上顯現(xiàn) 出褪綠的斑點，然后逐步擴大并和周圍的正常綠色組織混成一片，最后形成典型的花葉，嚴 重時可導致木薯整株死亡，造成極大的經(jīng)濟損失。由于長期采用無性繁殖，木薯產(chǎn)量下降、 品質(zhì)下降、種性退化，母株一旦感染木薯花葉病毒，病毒在木薯體內(nèi)傳染，并逐代累積。通過 現(xiàn)有的方法生產(chǎn)出的組培苗仍然攜帶病毒，移栽后極易引起木薯花葉病大面積發(fā)生，造成 難以估量的損失，也嚴重影響了木薯的推廣。
[0004] 目前，脫毒苗的生產(chǎn)一般選用植物的莖尖生長點作為外植體，通過加大培養(yǎng)代數(shù) 獲得脫毒苗。如中國發(fā)明專利CN103202232A，根據(jù)病毒在植株頂端生長點的數(shù)量遠遠少于 植株下部成熟部位的原理，加大取生長點代數(shù)，達到脫毒的目的。但是上述獲得脫毒苗的方 法，需進行多代取生長點進行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)周期長，脫毒苗繁殖效率低，影響了脫毒苗的 大規(guī)模推廣，也極大的阻礙著優(yōu)質(zhì)木薯種質(zhì)資源的引進和交流。尤其是涉及到從木薯花葉 病毒大規(guī)模爆發(fā)的疫區(qū)引進木薯種質(zhì)資源的過程中，快速地培育脫毒種苗成了引種的關鍵 因素之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提出了一種木薯脫毒苗快速擴繁和病毒檢測的方法，方法易行，繁殖速度 快，能夠在短期內(nèi)，更為有效的獲得大量的脫毒苗。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0007] 一種木薯脫毒苗快速擴繁方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] (1)、外植體采集和預處理：用刀片切取2~3cm的木薯嫩芽作為外植體，剪去較大 的嫩葉，沖洗干凈后，除去外植體表面水分；將外植體置于恒溫箱中，熱處理完成外植體脫 毒預處理；
[0009] (2)、外植體表面消毒和莖尖剝?nèi)。涸诔瑑艄ぷ髋_上，將外植體消毒處理后，逐層剝 去嫩芽上覆蓋的幼葉，直至露出頂端分生組織，切取分生組織區(qū)域長度為〇. 3~0. 6_帶 1~2個葉原基的莖尖；
[0010] (3)、莖尖誘導培養(yǎng)：采用濾紙液體培養(yǎng)的方式，接種莖尖至誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲 得無菌小苗；
[0011] (4)、繼代增殖生根培養(yǎng)：將外植體長出的小苗，切取葉片和一部分莖段作為病毒 檢測的樣品；將剩余帶芽莖段和頂芽接種在繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)生根，獲得完整的帶根小 苗；
[0012] (5)、病毒檢測：提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設計引物，以Actin為內(nèi)參，采用 半定量RT-PCR進行檢測；將脫毒不完全的試管苗剔除，無毒的試管苗轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中繼 續(xù)增殖培養(yǎng)，即得木薯脫毒組培苗。
[0013] 進一步，所述的步驟（1)中，除去外植體表面水分采用滅菌紙吸去表面水分或者 自然晾干，恒溫箱50°C~60°C下處理1~3h進行脫毒預處理。
[0014] 進一步，所述步驟（2)中，外植體消毒操作為，用75%體積比的酒精溶液浸泡10~ 15s，無菌水沖洗1~2次，再用0. 1 %重量比升汞溶液消毒3~5min，無菌水沖洗4~5次， 用滅菌紙吸去表面水分。
[0015] 進一步，所述步驟（3)中所用的誘導培養(yǎng)基組分為：MS+NAA0. 01~0. 03mg/ L(1-Naphthaleneaceticacid,NAA)+6-BAO.01 ~0. 04mg/L(6-Benzylaminopurine, 6-BA)+GA30. 2 ~2.Omg/L(GibberellinA3，GA3) +病毒抑制劑 5 ~10mg/L+蔗糖 20 ~30g/ L+pH5. 8~6. 0,溫度為24~26°C，光照強度1500~20001x，光周期8~10h/24h，培養(yǎng)周 期為25-30天。
[0016] 進一步，所述的病毒抑制劑為病毒唑、病毒靈、鹽酸金剛烷胺或阿昔洛韋。
[0017] 進一步，所述步驟（4)中，繼代培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)的方式，培養(yǎng)基組分為：MS+NAA 0? 01 ~0? 03mg/L+6-BA0 ~0? 02mg/L+GA30 ~0? 05mg/L+ 白糖 20 ~30g/L+ 卡拉膠 6. 5 ~ 7. 0g/L+pH5. 8~6. 0,溫度為26~28°C，光照強度2000~30001x，光周期12h/24h，培養(yǎng)周 期為35-45天。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] (1)本發(fā)明提出的一種木薯脫毒苗快速擴繁方法，以植株嫩芽為外植體，經(jīng)脫毒預 處理后剝?nèi)∑淝o尖，即使染病植株仍可以通過莖尖誘導培養(yǎng)一步成苗，無需經(jīng)過多代生長 點取樣，即可直接獲得脫毒苗，縮短了木薯脫毒苗的培養(yǎng)周期，脫毒效果顯著，成活率高，操 作具有較高的可重復性。
[0020] (2)本發(fā)明莖尖小苗其繼代增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)在一種培養(yǎng)基中完成，簡化了不 同培養(yǎng)基配置和生根培養(yǎng)轉(zhuǎn)接的操作，并且在繼代培養(yǎng)基的配制中，用白糖代替蔗糖，有效 降低生產(chǎn)成本。
[0021] (3)本發(fā)明所述的半定量RT-PCR檢測方法具有良好的特異性，靈敏度高。在不影 響繼代培養(yǎng)情況下，利用切下的葉片和莖段作為病毒檢測的材料，結(jié)合半定量RT-PCR法檢 測脫毒效果，在第1次繼代的同時能夠快速、高效的剔除脫毒不凈的試管苗，一定程度上節(jié) 省了人力物力，減少了育苗成本。
[0022] (4)采用本發(fā)明所述的木薯脫毒苗快速擴繁方法，35~45d，增值率為5~7, 一株 脫毒苗1年可繁殖7千株以上木薯脫毒苗，培育周期大大縮短，達到規(guī)模化生產(chǎn)的要求。 [0023] 本發(fā)明提出的木薯脫毒苗快速擴繁方法，實現(xiàn)了木薯苗的健康栽培和提純復壯， 其擴繁占用空間小，繁殖速度快，移栽成活率高，有效解決木薯健康種苗供應和不同國家地 區(qū)間種質(zhì)安全交流，減少病害發(fā)生和蔓延，為木薯可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)保障。
【具體實施方式】
[0024] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然， 所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施 例，本領域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于 本發(fā)明保護的范圍。
[0025] 實施例1
[0026] -種木薯脫毒苗快速擴繁方法，其步驟是：
[0027] 1、外植體采集和預處理：用刀片切取2~3cm的木薯嫩芽作為外植體，剪去較大的 嫩葉，經(jīng)自來水沖洗數(shù)分鐘，沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水分或自然晾干；將嫩芽外植體 置于恒溫箱中，在50°C下處理Ih完成外植體脫毒預處理；
[0028] 2、外植體表面消毒和莖尖剝?nèi)。涸诔瑑艄ぷ髋_上用75%體積比的酒精溶液浸泡 10s，無菌水沖洗1次，再用0. 1 %重量比升采溶液消毒3min，無菌水沖洗4次，用滅菌紙 吸去表面水分；在無菌條件下，將經(jīng)表面消毒的材料在雙筒解剖顯微鏡下由外向內(nèi)逐層剝 去嫩芽上覆蓋的幼葉，直至露出半圓球形的頂端分生組織，切取分生組織區(qū)域長度〇. 3~ 0? 6mm帶1~2個葉原基的莖尖；
[0029] 3、莖尖誘導培養(yǎng)：采用濾紙液體培養(yǎng)的方式，接種莖尖誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組分 為：MS+NAAO. 01mg/L+6-BA0. 01mg/L+GA30. 2mg/L+ 病毒唑 5mg/L+ 蔗糖 20g/L+pH5. 8 ~6. 0， 培養(yǎng)溫度為24~26°C，光照強度15001x，光周期8h/24h，培養(yǎng)25d后獲得無菌小苗；
[0030] 4、繼代增殖生根培養(yǎng)：將外植體長出的小苗，切取葉片和一部分莖段裝入I. 5mL 離心管作為病毒檢測的樣品；將剩余帶芽莖段和頂芽接種在繼代培養(yǎng)基中；采用固體培養(yǎng) 的方式，培養(yǎng)基組分為：MS+NAA0? 01mg/