一種蓮屬植物的組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蓮屬植物的組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的蓮屬植物繁殖多采用分藕的方式進(jìn)行，此法用種量大，且繁殖系數(shù)低，影響擴(kuò)繁速度。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，組織培養(yǎng)成為蓮屬植物理想的繁殖方法。雖然目前利用頂芽或腋芽直接誘導(dǎo)出不定芽，繁殖出的后代整齊度好，繁殖系數(shù)高，又能保持原品種的優(yōu)良特性，同時(shí)還可避免種藕帶菌；但是，在蓮屬植物芽的離體快繁過程中，污染率極高，容易褐變，且生長緩慢，易產(chǎn)生僵苗，成功率低，很難獲得大量整齊的無菌苗。
[0003]申請(qǐng)?zhí)枮?01310747637.2的中國專利公開了一種蔥蓮胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立和植株再生的方法，該發(fā)明在蔥蓮屬植物上建立了胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立方法，但不能解決蓮屬植物繁殖存在的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決傳統(tǒng)的蓮屬植物繁殖多采用分藕的方式中存在著用種量大、且繁殖系數(shù)低、影響擴(kuò)繁速度的問題，本發(fā)明提供一種蓮屬植物的組織培養(yǎng)方法，可以有效降低降低水生植物組織褐變率，實(shí)現(xiàn)更高的成活率、生長速度和出芽數(shù)，同時(shí)還可以增加組培快繁體系的穩(wěn)定性，節(jié)省人力物力。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種蓮屬植物的組織培養(yǎng)方法為；
[0006](I)雙相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和雙相增殖生根培養(yǎng)基的配制；
[0007]所述的雙相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基包括固相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和液相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，配制方法為以下步驟:
[0008](a)將組分為 MS+ 瓊脂 10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.lmg/L+5 % 蔗糖 + 活性炭200-400mg/L的培養(yǎng)基滅菌，得到固相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，然后將固相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基分瓶，凝固，備用；
[0009](b)將組分為MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.lmg/L+5%蔗糖的培養(yǎng)基滅菌，冷卻后加入過濾滅菌后的200mg/L谷胱甘肽+抗壞血酸150mg/L+梓檬酸500mg/L，得到液相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。
[0010]所述的雙相增殖生根培養(yǎng)基包括固相增殖生根培養(yǎng)基和液相增殖生根培養(yǎng)基，配制方法為以下步驟:
[0011 ] (a)將組份為 MS+ 瓊脂 10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5 % 蔗糖 + 活性炭200-400mg/L的培養(yǎng)基滅菌，得到固相增殖生根培養(yǎng)基，然后將固相增殖生根培養(yǎng)基分瓶，凝固，備用；
[0012](b)將組份為MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5%蔗糖的培養(yǎng)基滅菌；冷卻后加入過濾滅菌后的半胱氨酸200mg/L，得到液相增殖生根培養(yǎng)基。
[0013]本發(fā)明通過固液雙相培養(yǎng)基對(duì)蓮屬植物組織進(jìn)行培養(yǎng)的方法提高了高水生植物組織培養(yǎng)效率。
[0014]作為優(yōu)選，所述的滅菌方法為120°C高壓滅菌。但是200mg/L谷胱甘肽+抗壞血酸150mg/L+梓檬酸500mg/L加入前為過濾滅菌，半胱氨酸200mg/L加入前為過濾滅菌。
[0015]作為優(yōu)選，冷卻后溫度低于30°C。
[0016]MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基。具有較高的無機(jī)鹽濃度，能夠保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)還能加速愈傷組織的生長。
[0017](2)將選用的蓮屬植物藕芽進(jìn)行外植體消毒；
[0018]作為優(yōu)選，選用蓮屬植物藕芽外植體的消毒方法為:清水沖洗后75%酒精表面滅菌60秒、0.10%氯化未滅菌20min。
[0019](3)將步驟(2)外植體消毒后的藕芽接種在步驟(I)配制的雙相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行初代培養(yǎng)20?30天，得到初代培養(yǎng)的叢生芽；
[0020]具體步驟為:將步驟(2)消毒后的蓮屬植物藕芽接種在固體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，然后將液體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基覆蓋在接種后的固體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上面，培養(yǎng)20?30天，得到初代培養(yǎng)的叢生芽；作為優(yōu)選，液體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的液面高于固相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基表面I?3cm。
[0021](4)將初代培養(yǎng)的叢生芽切成單芽，接種到步驟(I)配制的雙相增殖生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20?35天.增殖生根。
[0022]具體步驟為:將步驟(3)初代培養(yǎng)的叢生芽切成單芽，接種入固相增殖生根培養(yǎng)基中，然后將液相增殖生根培養(yǎng)基覆蓋在接種后的固相增殖生根培養(yǎng)基上面，培養(yǎng)20?35天，作為優(yōu)選，液相增殖生根培養(yǎng)基的液面高于固相增殖生根培養(yǎng)基表面I?3cm。
[0023]作為優(yōu)選，上述的培養(yǎng)方法都在干凈的工作臺(tái)上進(jìn)行。
[0024]將經(jīng)此方法培養(yǎng)得到的帶根小苗出瓶，放置于溫室中生長15天以上，然后可以露地栽培，當(dāng)年可開花。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0026](I)可以有效降低降低水生植物組織褐變率，實(shí)現(xiàn)更高的成活率、生長速度和出芽數(shù)；
[0027](2)可以增加組培快繁體系的穩(wěn)定性，節(jié)省人力物力。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例中所述的培養(yǎng)方法都在干凈的工作臺(tái)上進(jìn)行，MS培養(yǎng)基粉末為市購產(chǎn)品，實(shí)施例中所述的室溫為20?25°C。
[0029]實(shí)施例1
[0030](I)雙相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和雙相增殖生根培養(yǎng)基的配制；
[0031]將組分為MS+ 瓊脂 10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.lmg/L+5 % 蔗糖 + 活性炭 200g/L的培養(yǎng)基在120°C高壓滅菌，得到固相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，然后在超凈工作臺(tái)分瓶，充分凝固，備用;
[0032]將組分為MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.lmg/L+5%蔗糖的培養(yǎng)基120°C高壓滅菌，冷卻到室溫后加入過濾滅菌后的200mg/L谷胱甘肽+抗壞血酸150mg/L+檸檬酸500mg/L，得到液相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；
[0033]將組份為MS+ 瓊脂 10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5 %蔗糖 + 活性炭 200mg/L的培養(yǎng)基120°C高壓滅菌，得到固相增殖生根培養(yǎng)基，然后將固相增殖生根培養(yǎng)基分瓶，凝固，備用；
[0034]將組份為MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5 %蔗糖的培養(yǎng)基120°C高壓滅菌；冷卻到室溫后加入過濾滅菌后的半胱氨酸200mg/L，得到液相增殖生根培養(yǎng)基，備用。
[0035](2)以中國蓮“貴妃醉酒”為例
[0036]將中國蓮“貴妃醉酒”的藕芽進(jìn)行外植體消毒；清水沖洗后75%酒精表面滅菌60秒、0.10%氯化未滅菌20min。
[0037](3)將消毒后的中國蓮“貴妃醉酒”藕芽接種在固體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，然后將液體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基覆蓋在接種后的固體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上面，液體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的液面高于固相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基表面1cm，培養(yǎng)30天，得到初代培養(yǎng)的叢生芽；
[0038](4)將初代培養(yǎng)的叢生芽切成單芽，接種到固相增殖生根培養(yǎng)基中，然后將液相增殖生根培養(yǎng)基覆蓋在接種后的固相增殖生根培養(yǎng)基上面，液相增殖生根培養(yǎng)基的液面高于固相增殖生根培養(yǎng)基表面1cm，培養(yǎng)35天，增殖生根。
[0039]將經(jīng)此方法培養(yǎng)得到的帶根小苗出瓶，放置于溫室中生長15天以上，然后可以露地栽培，當(dāng)年可開花。
[0040]實(shí)施例2
[0041](I)雙相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和雙相增殖生根培養(yǎng)基的配制；
[0042]將組分為MS+ 瓊脂 10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.lmg/L+5 % 蔗糖 + 活性炭 400g/L的培養(yǎng)基在120°C高壓滅菌，得到固相誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，然后在超凈工作臺(tái)分瓶，充分凝固，備用;
[0043]將組分為MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.lmg/L+5