專利名稱：一種葡萄試管苗繁殖方法及所使用的培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用組織培養(yǎng)繁殖葡萄試管苗的方法以及所使用的培養(yǎng)基。
葡萄是世界上栽培面積和總產量都占第一位的果樹。除用常規(guī)方法進行繁殖、育種和脫毒外，八十年代以來許多研究者開展了生物工程技術的研究，以加快葡萄育種和繁殖。
M.Barlass等(M.Barlass etc.，Ann.Appl.Biol.1982，101291～295)通過葡萄莖尖碎片培養(yǎng)，證明了再生植株脫除了嫁接傳播的卷葉、黃斑和斑點病毒。莖尖培養(yǎng)與熱處理相結合，也可獲得無扇葉病毒的葡萄。
R.Chee和R.M.Pool(R.Chee and R.M.Pool，Scientia Horticulturae，16(1982)17～27)嘗試了通過組織培養(yǎng)快速繁殖葡萄，他們以葡萄品種“羅金安”(Rougeon)莖尖為材料，在含有NAA和BA的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在每日10小時光照下得到具有2～4個葉原基的莖。原始外植體繼代培養(yǎng)可產生莖叢，出現了莖增殖的潛力。切下的莖叢(1.5cm長)繼代培養(yǎng)在含5μM BA和0.5μM NAA的培養(yǎng)基上，45天中在硬的愈傷組織頂部產生10～30個密生的莖叢。
莖尖轉入生根培養(yǎng)基后30～40天，產生的小植株栽入滅過菌的裝有泥炭的花盆中，放在生長箱內保持100％相對濕度。每天光照16小時，暗中溫度27℃，光下31℃。當莖高達到4cm，具有4～6片展開的小葉時，把生長箱內的相對濕度降至60％進行鍛煉。然后栽入大花盆中并移入生長室內?？偣伯a生24個小植株，全部移栽，其中6株死亡，成活率為75％。
上述實驗中雖然可以從一塊愈傷組織產生10～30個莖，但是R.chee等總共只獲得24株再生植株，說明實際成苗率并不高。并且，該實驗在嚴格控制光照、溫度和濕度的情況下試管苗移栽成活率也只有75％，顯然不適合大規(guī)模工廠化生產的需要。
A.Bouquet(A.Bouquet，Colloque multiplication de la vigne.1982.Bordeaux.)在前人工作的基礎上把葡萄離體繁殖技術概括為微型扦插和微型繁殖兩種途徑。
在微型扦插中，外植體在不含任何植物激素的培養(yǎng)基上長成具有根系和莖葉的植株。再把這些小植株每株切成約10段接種在新的培養(yǎng)基上，重新長出完整的植株，如此無限循環(huán)，大約兩個月轉接一次。每個外植體的年增殖率的理論值約為1.0×106。本方法的缺點是兩個月轉接一次，周期太長，繁殖系數偏低。作者沒有提到具體使用哪一種培養(yǎng)基，也沒說明植株移栽成活率有多少，因此無法計算出一年內可獲得多少移栽成活的植株。
在微型繁殖中，培養(yǎng)基加入細胞激動素，一般用量為2mg/L。將外植體接種在培養(yǎng)基后，腋芽萌發(fā)，葉片生長，很快就形成一堆叢生芽。切取帶葉的小芽接種在相同的培養(yǎng)基上，就可以無限循環(huán)地繁殖。每2～3周轉接一次。微型繁殖每次移植的增殖率為8～10倍。這一方法的理論效率比微型扦插高。但是存在著某種難以克服的技術困難。因此，A.Bouquet斷言“盡管葡萄微型繁殖有一個可觀的繁殖系數，但在短期和較長時間內似乎還不可能成功地應用于商品化生產”。正如A.Bouquet所預言的那樣，由于莖叢形成的再生植株較弱，移栽成活率低，實際繁殖系數并不高，現在幾乎沒有人用這一方法進行葡萄試管苗快速繁殖。
無論是用于何種目的，葡萄組織培養(yǎng)最終都要獲得再生植株。因此，再生植株的移栽成活率對實驗的成敗起著決定性作用。尤其是對脫病毒試管苗或優(yōu)良品種進行離體快速繁殖更需要有較高的移栽成活率，盡可能提高繁殖系數，降低生產成本。
一般都是通過嚴格控制環(huán)境的溫度和濕度來提高葡萄試管苗的移栽成活率，而忽視了試管苗自身的生理狀態(tài)，使移栽成活率低且不穩(wěn)定。如上述R.Chee和R.M.Pool的實驗，即使在嚴格控制光照、溫度和濕度的條件下，移栽成活率也只有75％。在大規(guī)模葡萄試管苗工廠化生產中，濕度和溫度很難控制。而且控制溫度和濕度需要昂貴的設備，這就必然提高試管苗的生產成本。如何在不太嚴格的環(huán)境條件下提高葡萄試管苗的移栽成活率是一個亟待解決的問題。
本發(fā)明的一個目的是針對現有技術的缺點和局限性，提供一種利用組織培養(yǎng)繁殖葡萄試管苗的方法，提高試管苗對移栽后的環(huán)境條件的適應能力，進而提高移栽成活率，降低培養(yǎng)成本。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于繁殖葡萄試管苗的方法的繼代培養(yǎng)基。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種用于繁殖葡萄試管苗的方法的光自養(yǎng)培養(yǎng)基。
除非特別說明，本發(fā)明所用的百分比均為重量百分比。
本發(fā)明采用GS(繼代培養(yǎng)基)和GP(光自養(yǎng)培養(yǎng)基)對培養(yǎng)基的基本無機鹽成分無特殊要求，但培養(yǎng)基的碳源、有機附加物、激素濃度和瓊脂以及pH值都做了相應的調整。MS、B5或懷特等培養(yǎng)基以及在這些培養(yǎng)基的基礎上發(fā)展起來的其它培養(yǎng)基均可用作無機鹽基礎培養(yǎng)基。無機鹽基礎培養(yǎng)基只含有無機鹽，不含有有機附加物的培養(yǎng)基。以1/2B5(B5培養(yǎng)基的大量元素減半)培養(yǎng)基為最佳。
GS培養(yǎng)基是在無機鹽基礎培養(yǎng)基中按常規(guī)量加入有機附加物——肌醇，鹽酸硫胺素，煙酸，鹽酸吡哆醇，瓊脂后再加入0.05～0.1mg/L的植物生長素(也可使用其它生長素類物質，但濃度要作相應的變化)，用于試管苗的增殖。當植物生長素濃度低于0.05mg/L時，莖的形成和生長較慢，高于0.1mg/L時則在外植體的基部形成較多的愈傷組織，均不利于試管苗的快速增殖。此外，GS培養(yǎng)基還必須加入2％～3％的蔗糖。蔗糖含量低于2％時，長期繼代培養(yǎng)會出現較多的玻璃苗，高于3％時不僅外植體生長速度減慢，而且增加了試管苗的生產成本。最好使用2％的蔗糖。pH值為5.6左右GP培養(yǎng)基(光自養(yǎng)培養(yǎng)基)就是使葡萄試管苗在離體培養(yǎng)階段在饑餓脅迫下進行光自養(yǎng)生長的培養(yǎng)基。GP培養(yǎng)基不含碳源。僅加入生長素類物質，如0.05-0.1mg/L的植物生長素，和瓊脂，其它有機附加物基本上完全除去，但保留2mg/L的鹽酸硫胺素效果更好。瓊脂含量提高到0.75％以上，pH值為6.0左右。在試管苗移栽前轉入光自養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過光自養(yǎng)培養(yǎng)，可以改善試管苗的生理狀態(tài)，使之具有較強的適應性。此外，光自養(yǎng)培養(yǎng)基由于缺少微生物生長所必需的碳源和其它有機物，不利于微生物的生長?？梢栽谂囵B(yǎng)基不污染的情況下延長練苗時間，使練苗時間長達7～10天而不污染。其它任何培養(yǎng)基在有菌情況下練苗3～5天培養(yǎng)基就會污染，練苗5天以上培養(yǎng)基嚴重污染，致使試管苗死亡。葡萄試管苗在移栽前必須打開瓶口練苗，否則不能移栽成活。在培養(yǎng)基不污染的情況下，練苗時間越長，試管苗的移栽成活率也就越高。
來自光自養(yǎng)培養(yǎng)基的葡萄試管苗本身的適應能力比較強，再經過7～10天練苗，大批量繁殖的移栽成活率穩(wěn)定在90％以上。
GP培養(yǎng)基不適于長期繼代培養(yǎng)。在GP培養(yǎng)基上形成的再生植株必須移栽或重新轉入GS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。
本發(fā)明提供一種利用光自養(yǎng)培養(yǎng)快速繁殖葡萄試管苗的方法，包括以下步驟a.將試管苗在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，擴大繁殖；b.當試管苗長出3～5個葉片時，把莖切成小段，每節(jié)一段，帶一個葉片，轉到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每天光照10～16小時，溫度20～28℃；c.當試管苗繁殖到一定數目時轉到光自養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，方法同步驟2，每天光照14小時以上，光照度最好為1200～2000lux，試管苗長出3～5片葉和健壯的根后，打開瓶口在室內自然光照下練苗6天以上，最好7～10天；d.取出練苗后的試管苗進行移栽，在濕潤條件下生長3～5天，之后在自然條件下生長。本步驟中的移植最好是將試管苗移植在砂子，蛭石，草炭土或其它透氣性良好的材料中。濕潤條件可以是通過覆蓋塑料薄膜來實現。
本方法的成苗率和植株移栽成活率均可達90％以上。如以每個試管苗平均切成3.5個莖段外植體，每月繼代一次計算，一年內從1個原始的試管苗可以繁殖出3.512×90％＝3.04×106株葡萄試管苗。以90％的成活率計算，一年內可獲得3.04×106×90％＝2.73×106棵成活植株。這樣的繁殖系數完全適合大規(guī)模工廠化生產的需要。
本發(fā)明較現有技術有以下優(yōu)點1.試管苗的繼代繁殖周期從A.Bouquet文中微型扦插的2個月縮短為4個星期，提高了繁殖系數。
2.突破了現有技術只通過控制環(huán)境的溫度和濕度來提高試管苗移栽成活率的局限性。使用了光自養(yǎng)培養(yǎng)法和與之相適應的培養(yǎng)基。通過改變培養(yǎng)基的成分來提高試管苗的適應能力，控制練苗時培養(yǎng)基的污染，延長練苗時間，使大批量繁中試管苗的移栽成活率達90％以上。R.Chee等在少量試管苗移栽試驗中，在嚴格控制溫度、濕度和光照的情況下，移栽成活率也只有75％。
實施例一(一)試驗材料先鋒葡萄品種的試管苗。這些試管苗已繼代多次，具有穩(wěn)定的再生能力。
(二)培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基的基本成分(mg/L)大量元素KNO31250，(NH4)SO467，NaH2PO4·H2O75，MgSO4·7H2O125，CaCl2·2H2O75。
微量元素KI0.75，H3BO33.0，MnSO4·H2O10，ZnSO4·7H2O2.0，Na2M0O4·2H2O0.25，CuSO4·5H2O0.025，CoCl2·6H2O0.025，Na2·EDTA37.3，FeSO4·7H2O27.8。
2.繼代培養(yǎng)基(GS)基本培養(yǎng)基附加肌醇25mg/L，鹽酸硫胺素10mg/L，煙酸1.0mg/L，鹽酸吡哆醇1.0mg/L，植物生長素0.05mg/L，蔗糖20000mg/L，瓊脂5000mg/L。pH調至5.6。
3.光自養(yǎng)培養(yǎng)基(GP)基本培養(yǎng)基附加鹽酸硫胺素2.0mg/L，植物生長素0.05mg/L，瓊脂8000mg/L。pH調至6.0。
(三)方法與結果1. 試管苗的繼代培養(yǎng)與增殖每個100ml的三角瓶裝GS培養(yǎng)基30ml。共25瓶培養(yǎng)基用常規(guī)方法高壓滅菌。把長出3～5個葉的試管苗每節(jié)切成一段，每段帶一個葉片。把莖段外植體的形態(tài)學下端插入GS培養(yǎng)基，每瓶接種3個外植體。每天光照10～16小時。培養(yǎng)室的溫度為20～28℃。培養(yǎng)4個星期在GS培養(yǎng)基上的外植體長成具有3～5個葉片和根的新的植株。
這些再生植株又可切成莖段進行下一次培養(yǎng)。每4個星期繼代一次。培養(yǎng)4個星期統(tǒng)計結果如下在GS培養(yǎng)基上的75個外植體共形成72個完整的植株，成株率為96％。
2.光自養(yǎng)培養(yǎng)與試管苗移栽(1)取100個先鋒葡萄試管苗莖段外植體接種在光自養(yǎng)培養(yǎng)基(GP)上，另取100個外植體接種在繼代培養(yǎng)基(GS)作為對照。每瓶接2個外植體。操作方法同步驟1。每天光照16個小時，光照度為1200～2000lux。
(2)培養(yǎng)4個星期，兩種培養(yǎng)基上的外植體均長出帶有3～5片葉片的新莖和健壯的根。形成再生植株。光自養(yǎng)培養(yǎng)基無污染，100個外植體共形成92個完整的植株。成株率為92％。對照繼代培養(yǎng)基污染4瓶，剩下92個外植體，其中86個外植體形成完整的植株，成株率為93.48％。兩種培養(yǎng)基的成株率無顯著差異。但是對照污染較多，實際獲得的再生植株數少于光自養(yǎng)培養(yǎng)的材料。
(3)打開瓶口，兩種培養(yǎng)基上的再生植株均在室內散射光下練苗7天。然后用自來水洗去根上的培養(yǎng)基，栽入盛有純沙的花盆內置于室內。花盆澆透水，上面蓋上塑料薄膜保濕。5天后去掉塑料膜。
(4)移栽20天后統(tǒng)計成活率和植株的生長情況。來自光自養(yǎng)培養(yǎng)基的92個植株成活87株，成活率為94.57％。來自對照的86個植株成活31株，成活率為36.05％。移栽前來自兩種培養(yǎng)基的小植株平均株高均為4.2cm。移栽20天后來自光自養(yǎng)培養(yǎng)基的小植株平均株高達10.45cm，增高6.25cm；而來自對照的小植株平均株高只有5.71cm，僅增高1.51cm。實施例二(一)試驗材料先鋒葡萄試管苗。
(二)培養(yǎng)基GS培養(yǎng)基植物生長素含量為0.1mg/L，蔗糖30000mg/L；GP培養(yǎng)基的植物生長素含量為0.1mg/L，瓊脂為12g/L。培養(yǎng)基的其它成分同實施例一。
(三)方法與結果1.繼代培養(yǎng)與增殖按照實施例一的方法，每瓶GS培養(yǎng)基接種3個外植體，25瓶共接種75個外植體。培養(yǎng)4周后共形成70個完整的植株，成株率為93.3％。
2.光自養(yǎng)培養(yǎng)與試管苗移栽按照實施例一的方法把100個莖段外植體接種在GP培養(yǎng)基上，未設GS對照。四個星期后共形成93個完整植株，成株率為93％。經練苗把這些植株全部移栽。20天后共成活86株，成活率為92.47％。實施例三(一)試驗材料先鋒、巨峰和黑奧林三個葡萄品種的試管苗，其中黑奧林為脫病毒試管苗。
(二)培養(yǎng)基GS培養(yǎng)基含植物生長素0.1mg/L，蔗糖20000mg/L。GP培養(yǎng)基植物生長素0.1mg/L，瓊脂8000mg/L。其它成分同實施例一。
(三)方法與結果在GS培養(yǎng)基上大量繁殖三個葡萄品種的試管苗，方法同實施例一。然后，把來自GS培養(yǎng)基的上述3個品種的外植體共2537個全部接種在GP培養(yǎng)基上進行光自養(yǎng)培養(yǎng)，一個月后共獲得再生植株2312個(其中先鋒1251株，巨峰579株，黑奧林482株)，成株率為91.13％。經練苗7天后把這些植株全部栽入盛有純沙的沙床。澆水至飽和狀態(tài)，上罩塑料薄膜保濕。5天后去掉塑料膜。20天后統(tǒng)計成活率。共成活2083株，其中先鋒為1126株，巨峰523株，黑奧林434株。成活率為90.1％。上述植株在沙床上培養(yǎng)1個月后全部栽入苗圃。
權利要求
1.一種用于葡萄試管苗繁殖的繼代培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基是在無機鹽基礎培養(yǎng)基中按常規(guī)量加入有機附加物——肌醇，鹽酸硫胺素，煙酸，鹽酸吡哆醇和瓊脂后再加入生長素類物質和2％～3％的蔗糖，pH值被調整至5.6。
2.按照權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的生長素類物質為0.05～0.1mg/L的植物生長素。
3.按照權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的蔗糖濃度為2％。
4.一種用于葡萄試管苗繁殖的光自養(yǎng)培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基是在無機鹽基礎培養(yǎng)基中僅加入0.05～0.1mg/L的植物生長素和瓊脂，并將瓊脂含量提高到0.75％以上，pH值調整至6.0。
5.按照權利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基中還含有2mg/L的鹽酸硫胺素。
6.一種利用光自養(yǎng)培養(yǎng)快速繁殖葡萄試管苗的方法，包括以下步驟a.將試管苗在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，擴大繁殖；b.當試管苗長出3～5個葉片時，把莖切成小段，每節(jié)一段，帶一個葉片，轉到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每天光照10～16小時，溫度20～28℃；c.當試管苗繁殖到一定數目時轉到光自養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，方法同步驟b，每天光照14小時以上，試管苗長出3～5片葉和健壯的根后，打開瓶口在室內自然光照下練苗6天以上；d.取出練苗后的試管苗進行移栽，在濕潤條件下生長3～5天，之后在自然條件下生長。
7.按照權利要求6所述的方法，其特征在于，在進行步驟c的培養(yǎng)時光照度為1200～2000lux。
8.按照權利要求6所述的方法，其特征在于，在進行步驟c的培養(yǎng)后練苗時間為7～10天。
9.按照權利要求7所述的方法，其特征在于，在進行步驟d中的移植是將試管苗移植進砂子，蛭石，草炭土或其它透氣性良好的材料中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種葡萄試管苗繁殖方法及所使用的繼代培養(yǎng)基和光自養(yǎng)培養(yǎng)基。所述的繼代培養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基中按常規(guī)量加入有機附加物——肌醇,鹽酸硫胺素,煙酸,鹽酸吡哆醇,瓊脂后再加入生長素類物質和2%～3%的蔗糖。所述的光自養(yǎng)培養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基中僅將瓊脂含量提高到0.8%或0.8%以上,pH值調整至6.0。利用本發(fā)明的方法可縮短繁殖周期,提高繁殖率,降低成本。
文檔編號A01H4/00GK1252216SQ9812353
公開日2000年5月10日 申請日期1998年10月23日 優(yōu)先權日1998年10月23日
發(fā)明者朱有光, 林建興, 張性坦, 趙存, 柏惠俠, 李諾 申請人:中國科學院遺傳研究所