專利名稱：合成編碼雪花蓮凝集素的抗同翅目害蟲基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工合成的編碼雪花蓮凝集素的基因，包含所說基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體，被所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以及由所說的細(xì)胞產(chǎn)生的對害蟲，尤其是對同翅目害蟲表現(xiàn)有殺蟲性的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。
近年來在抗蟲植物基因工程研究領(lǐng)域，有關(guān)凝集素的研究逐漸引起了科學(xué)家們的重視。一般說來，凝集素是一類可逆的結(jié)合特異單糖或寡糖的蛋白質(zhì)，部分具有殺蟲作用。凝集素早期的定義“l(fā)ectin”來源于拉丁文“l(fā)egere”，意思是選擇，以強(qiáng)調(diào)其能選擇性地與糖復(fù)合物相結(jié)合的特性。后來由于lectin被廣泛應(yīng)用于表現(xiàn)出更廣泛凝集行為的所有蛋白質(zhì)，故“l(fā)ectin”已失去早期選擇的意思，而另一個名字“agglutinin”作為lectin的同義詞，能更準(zhǔn)確地反映這類蛋白質(zhì)的特性，因為它是指能通過與細(xì)胞表面結(jié)合碳水化合物的特異性結(jié)合而使細(xì)胞凝集的所有蛋白質(zhì)。由于植物凝集素家族成員的增加，對其結(jié)構(gòu)、功能研究的深入以及分子生物學(xué)水平上新的發(fā)現(xiàn)，使得植物凝集素的定義幾經(jīng)修正。最近Peumans和Van Damme(Plant Physiology,109:347～352,1995)認(rèn)為凝集素(lectin)的定義應(yīng)為含有至少一個非催化結(jié)構(gòu)域并能可逆結(jié)合到特異單糖或寡糖上的蛋白質(zhì)總稱。
關(guān)于凝集素的殺蟲機(jī)理，目前一般認(rèn)為外源凝集素進(jìn)入昆蟲消化道后，與腸道圍食膜細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合，降低膜的通透性，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收。此外，這種結(jié)合還可能在昆蟲的消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，引起消化道內(nèi)細(xì)菌和病毒的繁殖等，從而對昆蟲本身造成危害(Eisemann C.H.,et al.Entomologia Experimental etApplicata.72:1～10,1994)。
雪花蓮凝集素(Galanthus Nivalis Agglutinin,以下均簡稱GNA)是石蒜科(Amaryllidaceae)的一種名為雪花蓮的植物體內(nèi)存在的一種植物凝集素。Van Damme等人(Planta Vol 186:35～43,1991；European Journal of Biochemistry Vol 202:23～30,1991)發(fā)現(xiàn)GNA是由多基因家族編碼的。它的殺蟲效果較好，對具有刺吸式口器的害蟲如蚜蟲、稻飛虱、葉蟬等具有較好抗性，對咀嚼式害蟲也具有中等抗性。另外由于GNA只專一識別并結(jié)合α-1,3和α-1,6甘露糖(Van Damme Els J.M.,etc.FEBS Letters.Vol215:140～144,1987)，而人及絕大多數(shù)動物細(xì)胞表面甘露糖殘基很少，所以GNA對人畜幾乎無害。是目前所知的最適于轉(zhuǎn)基因植物研究的植物凝集素之一。
Annick Barre,Van damme等人(Plant Physiology,112:1511～1540,1996)通過SDS-PAGE以及蔗糖密度梯度離心證明GNA分子是每個亞基約為12.5KD的四聚體蛋白，且蛋白質(zhì)分子沒有被糖基化。GNA分子的三維結(jié)構(gòu)相當(dāng)于一個由四條β折疊片(亞結(jié)構(gòu)域)通過Ω環(huán)連成的一個β折疊桶。每個凝集素單體有3個相同的由四個氨基酸殘基組成的甘露糖結(jié)合位點(diǎn)。四個GNA單體構(gòu)成一個具有充分暴露的結(jié)合甘露糖位點(diǎn)的四聚體。
1995年P(guān)owell等人(Entomologia Experimental et Applicata.75:51～59,1995)以GNA和麥胚凝集素(WGA)分別按0.1％(w/v)的濃度加入到人工飼料中飼喂稻褐飛虱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GNA的抗性效果較好，24小時內(nèi)所測試稻褐飛虱蜜汁分泌降低達(dá)96％。1996年Nicolas Sauvion等人(Entomologia Experimental et Applicata.79:285～293,1996)以濃度為30uM的GNA人工飼喂桃蚜，幼蟲死亡率為42％。
1995年Newell等人(Plant Science,107:215～227,1995)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將GNA和另外一種基因同時轉(zhuǎn)入甘薯，但對其抗蟲性未作報告。同年Hilder等人(TransgenicResearch,4:18～25,1995)在CaMV35S啟動子下構(gòu)建GNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因煙草的葉片及整株蟲試都表明轉(zhuǎn)基因植物對桃蚜(Myzus persicae)具有抗性。葉片提取并純化GNA，以0.1％w/v人工飼料飼喂桃蚜，其校正死亡率為33±1％，且蚜蟲平均大小顯著小于對照，桃蚜的發(fā)育、繁殖也大大降低。1996年Gatehouse等人(EntomologiaExperimental et Applicata.79:295～307,1996)將GNA基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯顯著降低了桃蚜繁殖力，每個雌蚜蟲每天產(chǎn)卵數(shù)為4.1-4.2個，而對照為5.4個。每一個轉(zhuǎn)基因植株上的幼蟲數(shù)比對照顯著降低。
但到目前為止，轉(zhuǎn)GNA植物的抗蟲能力并不十分理想。本發(fā)明在前人的一些工作的基礎(chǔ)上，通過現(xiàn)代基因工程技術(shù)，人工改造并合成一種GNA基因，該基因更適合在植物中表達(dá)。進(jìn)一步構(gòu)建了高效植物表達(dá)載體。該表達(dá)載體通過一定的方法轉(zhuǎn)入植物后，可賦予植物對害蟲，尤其是同翅目害蟲的抗蟲性。
本發(fā)明的目的是針對如下兩個事實1．蚜蟲、稻飛虱、葉蟬等同翅目害蟲在世界范圍內(nèi)對植物危害嚴(yán)重。這些害蟲具有刺吸式口器，危害農(nóng)作物、園藝作物及裝飾性植物。其取食不僅引起作物的直接損失，而且口器刺入時產(chǎn)生傷口，通過傷口100多種致病病原菌和植物病毒得以侵染植物，從而導(dǎo)致作物更加嚴(yán)重的損失。
2．廣泛使用化學(xué)殺蟲劑防治害蟲，弊端很大。化學(xué)殺蟲劑作用是非特異性的，在殺死害蟲的同時也會殺死益蟲，破壞生態(tài)平衡并污染環(huán)境，危害人身健康。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將殺蟲基因?qū)胱魑矬w內(nèi)，使其本身具有抗蟲能力，不僅克服了化學(xué)殺蟲劑的缺點(diǎn)，而且更有其獨(dú)特的優(yōu)越性。
雪花蓮是一種不常見的植物，且在我國未有分布。對天然GNA基因的序列分析表明，GNA基因中密碼子的使用與常見植物中的密碼子使用情況差別很大。因而直接將天然GNA基因轉(zhuǎn)入植物后，由于其密碼子與植物體內(nèi)蛋白翻譯體系的不協(xié)調(diào)而使目的蛋白的表達(dá)量較低，影響轉(zhuǎn)基因植物的殺蟲效果。本發(fā)明提供的人工合成的sGNA基因是對天然GNA基因進(jìn)行了改造，選擇普通植物的優(yōu)化密碼子完全人工合成的。該基因適合在一般的植物中高效表達(dá)而使轉(zhuǎn)基因植物對蚜蟲等同翅目害蟲表現(xiàn)有較高抗性。
因此，本發(fā)明提供了對天然GNA基因進(jìn)行改造，使之適合于在普通植物中表達(dá)的一套基因修飾方案。根據(jù)這個方案，在本發(fā)明的一個實施方案的一個方面中，我們設(shè)計并合成了sGNA基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。該核苷酸序列所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。此外，根據(jù)本發(fā)明的天然GNA基因修飾方案，也可以合成一系列SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的功能等同物，且具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的特征。但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，為本發(fā)明的目的，也可以基于天然雪花蓮凝集素基因的野生序列，以核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù)PCR酶促合成等技術(shù)制得本發(fā)明的具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的編碼雪花蓮凝集素的DNA序列或其功能等同物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及為在受體植物中有效地表達(dá)上面所述GNA基因所需之調(diào)節(jié)及控制元件。
為了使外源基因在植物細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上獲得有效表達(dá)，在包含編碼區(qū)的外源DNA序列側(cè)翼必須連接有適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)節(jié)和控制元件。這些控制元件包括啟動子、增強(qiáng)子、終止子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的未翻譯部分和多聚腺苷酸化序列、以及便于在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中篩選被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因等。常用的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子和根瘤農(nóng)桿菌T-DNA的胭脂氨酸合酶啟動子等。這些啟動子在大多數(shù)植物細(xì)胞中都是有效的，但其插入位點(diǎn)和插入的拷貝數(shù)目不同，將對其下游的蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性產(chǎn)生很大影響。
因而，本發(fā)明涉及翻譯增強(qiáng)序列；在任何讀碼情況下均能正確終止的多聯(lián)終止子序列；對轉(zhuǎn)錄過程得到的mRNA進(jìn)行正確切割的加工序列；以及促使加入多聚腺苷酸化序列的多聚腺苷酸化信號序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，在本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)載體中，所說的5′端非編碼區(qū)由兩個增強(qiáng)子序列，一個啟動子序列，一個衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因的翻譯增強(qiáng)序列，和一個外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)翻譯過程中起促進(jìn)作用的短核苷酸序列組成。
在本發(fā)明的融合基因表達(dá)載體中，除了上述本發(fā)明的GNA基因序列外，其他位于所說編碼序列兩側(cè)翼(即5′和3′端邊界區(qū)域)的用于調(diào)節(jié)和控制該編碼序列在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列都是本領(lǐng)域已知的和容易得到的。例如，本發(fā)明使用的所說的衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因編碼區(qū)的翻譯增強(qiáng)序列是Ω序列。根據(jù)已知的Ω序列核苷酸順序，我們合成了兩段核苷酸片段SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11，通過酶促反應(yīng)合成了由68bp組成的Ω序列。該序列富集AAC序列，在蛋白質(zhì)合成的翻譯過程中構(gòu)成核糖體和rRNA結(jié)合位點(diǎn)(Richardset al.,Eur.J.Biochem.84:513-519,1987)。其中本發(fā)明使用的促進(jìn)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)翻譯過程的短核苷酸序列是Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak etal.,Nucleic Acids Research 12:857-872,1984；Cell,44:283-292,1986)。我們所合成的Ω序列和Kozak序列如SEQ ID NO:12所示。
適于與本發(fā)明GNA基因連接，并在植物細(xì)胞中啟動該編碼DNA序列轉(zhuǎn)錄開始的啟動子包括組成型、誘導(dǎo)型、組織或器官特異性或發(fā)育階段特異性啟動子。例如，它們包括但不只限于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S或19S啟動子，mannopine合成酶(MAS)啟動子，胭脂氨酸合成酶和章魚堿合成酶啟動子，玉米乙醇脫氫酶啟動子，以及二磷酸核酮糖羧化酶，氧化酶小亞基啟動子等。其中，本發(fā)明優(yōu)選的是帶有加倍增強(qiáng)子元件的CaMV 35S啟動子。該啟動子全序列如SEQ ID NO:13所示。此外，由于具有刺吸式口器的同翅目害蟲主要在植物的韌皮部吸取汁液，故尤其適合啟動本發(fā)明GNA基因的啟動子是韌皮部特異性啟動子，如蔗糖合成酶啟動子(SSR Promoter)，一種叫做杜松烯合成酶的啟動子(CAD1-B)等。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，在本發(fā)明所構(gòu)建的高效植物表達(dá)載體中，所說的3′端非編碼區(qū)包括一個多聯(lián)終止密碼子序列，一個mRNA切割序列和一個mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。這些調(diào)節(jié)和控制序列可以是載體質(zhì)粒載體中天然固有的，或在dNTP及適當(dāng)?shù)腄NA合成酶和DNA連接酶的存在與作用下，利用各種已知的技術(shù)合成并通過分子克隆技術(shù)加入的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的編碼序列及其5′和3′端側(cè)翼序列是以化學(xué)方法合成的。
然而，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，上述這些3′端調(diào)控序列，基本上都是根據(jù)我們的預(yù)先設(shè)計而人為合成的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，建立在大量理論研究工作基礎(chǔ)上的本發(fā)明的這一實施方案，必將更有利于提高我們所制備的GNA基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)效率及其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。例如，在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，我們設(shè)計并合成了直接連接于GNA結(jié)構(gòu)基因3’端的多聯(lián)終止子序列(SEQ ID NO:14)，在該核苷酸的短序列中，包括有三個分別位于不同讀碼框中的終止密碼子。從而即使在對其左翼的結(jié)構(gòu)基因序列的翻譯過程出現(xiàn)錯讀，也將得以正確終止。再如，本方面所設(shè)計的3’端正確切割和加工序列進(jìn)一步保證了蛋白質(zhì)翻譯的正確終止(SEQ ID NO:15)。
另外，適用于本發(fā)明的GNA高效植物表達(dá)載體還可以包括衍生于花椰菜花葉病毒，Nopaline(Nos)基因及其類似物的終止子。在本發(fā)明的一個實施方案中，我們使用了Nos基因的終止子。
為了提高本發(fā)明的GNA基因在單子葉禾木科植物中的表達(dá)效率，可在結(jié)構(gòu)基因與啟動子序列之間加入適當(dāng)大小的內(nèi)含子序列，例如，玉米醇脫氫酶基因的第一內(nèi)含子(Gene and Development 1:1183-1200,1987)、衍生于蓖麻油植物的過氧化氫酶基因的第一內(nèi)含子(Tanaka et al.,NucleicAcids Research 18:6767-6770,1990)等。
可使用本領(lǐng)域中已知的方法將本發(fā)明的適于在植物細(xì)胞中表達(dá)GNA的融合基因構(gòu)建體連接到任何一種可在細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞中自我復(fù)制的載體上。這樣的載體例如包括衍生于大腸桿菌的質(zhì)粒載體pUC18、pUC19(Gene 103:1985)，以及經(jīng)過不同的修飾而造成不同的多克隆酶切位點(diǎn)的一系列統(tǒng)稱為pGEM的質(zhì)粒載體(由Promega公司生產(chǎn))。尤其是植物表達(dá)載體pBI101,pBI121以及pBI131系統(tǒng)(Iefferson,et al.,EMBO J.16:3901,1987)，等等。在本發(fā)明的一系列優(yōu)選實施方案中，攜帶上述本發(fā)明sGNA基因構(gòu)建體的載體是pUC19、pBI121等，后者特別適于作為制備植物表達(dá)載體的工具質(zhì)粒載體。
當(dāng)然，如前所述，為了正確地選擇和鑒定被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，本發(fā)明的上述重組的融合表達(dá)載體還進(jìn)一步含有可選擇標(biāo)記和報告基因。所使用的選擇標(biāo)記和報告基因的兩側(cè)可帶有各自的調(diào)節(jié)序列，以促使它們在植物中的表達(dá)。適用的選擇標(biāo)記和報告基因是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。編碼選擇標(biāo)記的外源基因及其他基因可以包含于同一個表達(dá)載體中，或者包含于轉(zhuǎn)化時同時應(yīng)用的不同的載體中。本發(fā)明優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因，并一同包含于同一個重組表達(dá)載體內(nèi)，從而保證了對被轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株選擇的可靠性。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供適于在植物細(xì)胞中表達(dá)GNA的融合植物表達(dá)載體，其中包含1)．sGNA基因表達(dá)盒；a)．5’端非編碼區(qū)；b)．編碼GNA的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；c)．3’端非編碼區(qū)。
2)．來源于pBI121的載體部分a)．新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NptⅡ)表達(dá)盒；b)．β-葡萄糖苷酸酶基因(Gus)表達(dá)盒；以及c)．起始復(fù)制子及與植物轉(zhuǎn)化相關(guān)的左右邊界序列等功能結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的5’端非編碼區(qū)和3’端非編碼區(qū)分別具有如前所述的構(gòu)成元件及其功能。例如，5’端的帶有加倍的增強(qiáng)子元件的啟動子，Ω序列和Kozak序列；3’端的多聯(lián)終止序列，正確切割和加工序列，多聚腺苷酸信號序列。
根據(jù)本發(fā)明，所說的編碼區(qū)域具有如SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列或包含于SEQ ID NO:3的其功能等同序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所況的編碼基因序列及其5′和3′端側(cè)翼序列是以化學(xué)方法合成的。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，申請人已于1998年10月5日將轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α宿主細(xì)胞中的本發(fā)明構(gòu)建的帶有sGNA基因表達(dá)盒的融合表達(dá)載體pG4AS8保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCC NO.0363。
通過本發(fā)明所提示的天然GNA修飾方案，所得到的符合SEQ ID NO:3的核苷酸序列且具有植物基因特征的改造后GNA基因都可以通過DNA重組技術(shù)，連接到上面所描述的表達(dá)載體中，并使之轉(zhuǎn)入并整合到植物基因組中。而且GNA基因在目標(biāo)植物中的表達(dá)可賦予該植物對害蟲，尤其是針對同翅目害蟲的殺蟲性。
應(yīng)該指出，上面所描述的表達(dá)載體是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，并未限制本發(fā)明。凡是應(yīng)用本發(fā)明所描述的GNA基因所構(gòu)建的任何表達(dá)載體均包括在本發(fā)明之內(nèi)。尤其是該修飾后的GNA基因還可以通過與其它任何殺蟲基因重組或協(xié)同，以獲得殺蟲能力更強(qiáng)、殺蟲范圍更寬或這兩方面都得到加強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。包括如下的實現(xiàn)方式1．與其它一種或幾種殺蟲基因重組，構(gòu)建多種殺蟲基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入植物；2．與其它一種或幾種殺蟲基因融合，構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入植物；3．與其它一種或幾種殺蟲基因相協(xié)同，分別構(gòu)建植物表達(dá)載體，同時或分步導(dǎo)入同一種植物受體。
用相類似的方法，本發(fā)明修飾后的GNA基因還可以與其它目的基因進(jìn)行重組或協(xié)同，以達(dá)到具有除殺蟲性以外的其它優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因植物。也包括利用選擇標(biāo)記基因而獲得利于篩選轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)基因植物等，例如抗除草劑基因。
為了在植物細(xì)胞中，特別是整株植物中表達(dá)外源殺蟲基因，以賦予整株植物及其種子和后代以殺蟲能力，必須使用適當(dāng)?shù)姆椒▽瓷鲜龇椒ㄖ苽涞臄y帶本發(fā)明的GNA基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或植物體內(nèi)。
將攜帶外源基因的重組載體導(dǎo)入宿主植物或其細(xì)胞內(nèi)的許多方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些方法包括但并不僅限于1)使用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)作為植物病原體所介導(dǎo)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(AgrobacteriumMediated transformation)、2)物理法，如基因槍法(Particle Bombardment & particle gun& Gene gun)、電擊融合法(Electroporation)、顯微注射法(Microinjection)、超聲波法(Ultrasonic waves)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纖維介導(dǎo)法(Silicon carbidefiber)、電泳法(Electrophoretic transfection)等。3)化學(xué)法，如PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法等。4)種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法，如花粉介導(dǎo)法、花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等。5)．以花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒載體所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法。
一種特別令人感興趣的在整體植株中導(dǎo)入外源基因的方法是本發(fā)明人使用的所謂種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法中改進(jìn)的子房注射植物受精胚囊法(參見CN95119563.8,1995:Zhou et al.,Enzymol.Method.101:433-481,1983)。
根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案，我們優(yōu)選棉花作為GNA基因轉(zhuǎn)化受體植物。棉花作為一種經(jīng)濟(jì)作物，我們考慮其主要作為紡織工業(yè)原料，安全性好；其次，在世界范圍內(nèi)被廣泛種植的棉花每年因蟲害造成的經(jīng)濟(jì)損失是十分巨大的。
因而，本發(fā)明涉及人工改造的編碼GNA的DNA序列，包含所說的DNA序列的高效植物表達(dá)載體，用所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，組織和整株植物的方法，以及由此產(chǎn)生的對植物害蟲具有控制和殺蟲能力的轉(zhuǎn)基因植物，特別是對同翅目昆蟲例如蚜蟲等具有顯著抗蟲作用的轉(zhuǎn)基因棉花。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了獲得對害蟲有抗蟲性，尤其是對同翅目害蟲有抗蟲性的植物的方法，該方法包括1)．構(gòu)建包含所說GNA基因的植物表達(dá)載體；2)．用任何一種可行方法將步驟1)中得到的植物表達(dá)載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)，并由此獲得對害蟲有抗性或殺傷能力的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括任何部分的植物組織和種子。
這里應(yīng)特別指出的是，雖然在本發(fā)明下述實施例中以轉(zhuǎn)基因棉花的產(chǎn)生舉例進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明，但這絕不意味本發(fā)明的GNA基因及攜帶該DNA序列的重組融合表達(dá)載體只用于轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)具有抗蟲能力的轉(zhuǎn)基因棉花。
因此，使用具有本發(fā)明所描述的特征的GNA基因表達(dá)載體，以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種方法導(dǎo)入任何植物或其組織或細(xì)胞中，以及由此而獲得的具有殺傷或控制植物敏感害蟲之能力的植物，其后代及其種子和植物部分，均包括在本發(fā)明之內(nèi)。


附圖1以人工合成的寡核苷酸片段F1～4(SEQ ID NO:4,5,6,7)及引物P1,P2(SEQ IDNO:8,9)合成sGNA基因過程示意圖；附圖2本發(fā)明所構(gòu)建的攜帶有人工合成的sGNA基因的植物表達(dá)載體pGBIGNA質(zhì)粒圖譜附圖3:sGNA轉(zhuǎn)基因煙草葉片對蚜蟲抑制效應(yīng)曲線圖CK為未轉(zhuǎn)基因煙草，K11,K13,K14均為轉(zhuǎn)基因煙草。試驗時，在瓊脂平板上分別放入待試材料，接入8頭3齡蚜蟲并連續(xù)觀察其生長、繁殖情況一周。從表中曲線可知，轉(zhuǎn)基因煙草明顯的降低了蚜蟲的繁殖率。附圖4:sGNA轉(zhuǎn)基因棉花的PCR和PCR-Southern分子檢測結(jié)果上圖是對轉(zhuǎn)基因棉進(jìn)行PCR分子檢測的結(jié)果下圖是應(yīng)用sGNA基因特異性探針對上圖所示PCR產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交的結(jié)果第一泳道DNA標(biāo)準(zhǔn)梯度第二泳道以未轉(zhuǎn)基因棉花DNA為模板的陰性對照第三泳道以質(zhì)粒pG4AS8為模板的陽性對照第四～九泳道以不同轉(zhuǎn)基因棉花植株DNA為模板的PCR結(jié)果附圖5:sGNA轉(zhuǎn)基因棉花對蚜蟲的抗蟲性上圖為轉(zhuǎn)基因棉接種10頭蚜蟲后在封閉罩內(nèi)10天后狀況下圖為未轉(zhuǎn)基因棉花接種10頭蚜蟲后在封閉罩內(nèi)10天后狀況通過對比可知，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對蚜蟲抗性顯著給出以下實施例的目的是舉例詳細(xì)描述本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明待批權(quán)利范圍的限制。在本發(fā)明技術(shù)特征和待批權(quán)利要求范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作出某些等同的改動和顯而易見的改進(jìn)。
實施例一編碼GNA蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的制備1.1對天然GNA的修飾方案及sGNA基因的設(shè)計天然GNA基因編碼一個由157個氨基酸組成的前體蛋白，翻譯后在N端和C端各有23和29個氨基酸被去除，只剩下105個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)(Hester Gerko,KakuHanae,et al.The Journal of Biological Chemistry,Vol 258:15:9544～9549,1983)。根據(jù)此成熟蛋自氨基酸序列，完全采用普通植物優(yōu)化密碼子，我們?nèi)斯ず铣闪似渚幋a核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，連同5’及3’端克隆所設(shè)計的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以及起始密碼子ATG和終止密碼子TAA共333個堿基對。所設(shè)計基因命名為sGNA，它所編碼的GNA蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO:2所示。
1.2小片段的合成及完整sGNA的組裝為獲得我們所需要的核苷酸序列，我們設(shè)計了四個核苷酸片段F1(SEQ IDNO:4),F2(SEQ ID NO:5),F3(SEQ ID NO:6),F4(SEQ ID NO:7)，以及一對引物P1(SEQ ID NO:8),P2(SEQ ID NO:9)。四條寡核苷酸片段分成兩組分別退火并用DNA聚合酶延伸補(bǔ)齊，再以所獲得的兩種DNA片段為模板，用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到完整的333bp的sGNA基因片段。附圖1是用這幾個核苷酸片段，經(jīng)分子酶促反應(yīng)而得到sGNA片段的過程示意圖。按照設(shè)計，該片段的5’及3’端分別帶有一個PstⅠ和SacⅠ位點(diǎn)。本實施例及以下各實施例所涉及的克隆步驟均按本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行(Sambrook,J.Et al.,Molecular Cloning-ALaboratory Manual,2nd,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork)。載體pUC19和PCR產(chǎn)物經(jīng)PstⅠ、SacⅠ雙酶切后，將333bp片段和載體退火連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過a-互補(bǔ)現(xiàn)象的觀察，得到重組子定名為pGS8。經(jīng)PstⅠ、SacⅠ雙酶切鑒定，證實該重組質(zhì)粒中有300bp左右DNA片段的插入。
1.3對pGS8中所克隆GNA基因的序列分析(1)變性模板的制備用小量提取質(zhì)粒DNA方法，制備待測pGS8質(zhì)粒DNA。取1.5～2μg DNA(約2～5μl)加水至總體積32μl，然后加入8μl 2M NaOH，輕輕混勻，室溫變性10分鐘，然后加入4μl H2O,7μl 3M NaAc(pH4.8),120μl無水乙醇，12000rpm離心8分鐘，用70％乙醇洗2次所得的沉淀，真空抽干，溶于10μl水中，放冰上待用。
(2)退火向變性后的模板DNA中加入2μl退火buffer,2μl測序引物，輕輕混勻，瞬時離心后于65℃溫育退火5分鐘，迅速移至37℃繼續(xù)溫育10分鐘，然后于室溫放置5分鐘以上。
(3)標(biāo)記反應(yīng)先吸2μl酶稀釋buffer，然后向其中加入0.5μl T7測序酶，置于冰上，然后向退火后的模板，引物退火混合物中加入labal Mix 3μl，α～32P dATP 1μl；稀釋后的T7測序酶2μl，在管中輕輕吸打混勻，瞬時離心甩一下，室溫反應(yīng)5分鐘。
(4)鏈延伸終止反應(yīng)在4個離心管上分別標(biāo)上A、C、G、T，并分別加入2.5μl相應(yīng)的鏈終止液(Mix short)在37℃至少保溫1分鐘，從(3)中標(biāo)記反應(yīng)液中分別移取4.5μl反應(yīng)物加入到A、C、G、T，四個管中，混勻后置37℃反應(yīng)5分鐘，各加入5μl終止液，于37℃保溫2分鐘。
(5)測序膠的制備應(yīng)用Bio-rad公司的測序儀器。
量取50ml 6％測序丙烯酰胺凝膠貯備液(6％ Seqencing gel:1.5g甲叉雙丙烯酰胺，28.5g丙烯酰胺，240g尿素，50ml 10×TBE，加水定容至500ml)，加入500μl 10％過硫酸胺，50μl TEMED，混勻，緩慢注入到洗凈的測序板裝置中，插入點(diǎn)樣梳，室溫聚合45分鐘以上。
(6)裝置好電泳裝置，加入1×TBE為電泳緩沖液(10×TBE:108g Tris,9.3gNa2EDTA.2H2O,55g硼酸，用H2O定溶于1000ml(pH8.3))。將樣品80℃變性2分鐘，置于冰上，上樣電泳。如有必要，當(dāng)溴酚蘭到達(dá)板底部時，進(jìn)行二次上樣，繼續(xù)電泳到二次上樣溴酚蘭至板底部。
(7)停止電泳，下膠，壓片，-70℃放射自顯影過夜，沖片閱讀。
結(jié)果證明該質(zhì)粒中帶有與設(shè)計相符的sGNA基因插入片段。
實施例2帶有GNA基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建2.1sGNA基因表達(dá)盒的構(gòu)建如前所述，本實施例所構(gòu)建的sGNA基因表達(dá)盒中包括以下基因表達(dá)調(diào)控元件5’端的35S啟動子、加倍的增強(qiáng)子、Ω序列及Kozak序列，3’端的多聯(lián)終止序列、切割序列、正確加工序列以及NOS終止子。這些表達(dá)調(diào)控元件除35S啟動子和增強(qiáng)子之外都是通過化學(xué)方法人工合成的(詳見中國專利CN95119563.8,1995)。在本實驗室所保存的質(zhì)粒pG4AB中包括有這些元件。此外，該質(zhì)粒還帶有人工合成的蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因表達(dá)盒(GFM CryⅠA基因)。
利用質(zhì)粒pG4AB，經(jīng)PstⅠ和SacⅠ雙酶切后，回收3.5kb片段作為載體，將pGS8中的sGNA基因用PstⅠ和SacⅠ切下后連接到所回收的載體上去，得到重組質(zhì)粒pG4AS8。在該質(zhì)粒中則帶有一整套復(fù)雜的sGNA基因表達(dá)盒。
2.2sGNA基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建用HindⅢ切下pG4AS8中的1.5kb殺蟲基因，克隆到植物表達(dá)載體pBI121.1中的HindⅢ位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒pGBIGNA。這就是所構(gòu)建的sGNA植物表達(dá)載體。其質(zhì)粒圖譜如附圖2所示。
實施例3.sGNA植物表達(dá)載體向模式植物煙草中的導(dǎo)入及鑒定3.1 LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取LBA4404單菌落接種于5ml YEB(含鏈霉素100μg/ml)中，28℃,250rpm培養(yǎng)過夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD值約為0.6。將菌液轉(zhuǎn)至無菌離心管中，冰浴30分鐘，5000rpm離心5分鐘，用2ml 20mM的CaCl2重懸菌體，按每管200μl分裝于無菌小離心管中。
3.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LBA4404細(xì)胞在200μl LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中分別加入2μg重組質(zhì)粒pGBIGNA DNA，置冰浴5分鐘，然后轉(zhuǎn)至液氮中冷凍8分鐘，迅速于37℃水浴中溫育5分鐘后，加入800μl YEB培養(yǎng)基，28℃ 250rpm預(yù)表達(dá)培養(yǎng)4～5小時，然后涂鋪含有卡那霉素的YEB固體平板，28℃培養(yǎng)24～48小時。則長出的農(nóng)桿菌菌落帶有相應(yīng)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。
3.3煙草的轉(zhuǎn)化(1)農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備28℃過夜分別培養(yǎng)帶有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌50ml，5000rpm離心5分鐘，收集菌體沉淀，用液體MS培養(yǎng)液洗滌一次，再用MS重懸至OD600=0.2～0.4。
(2)浸染取煙草無菌苗葉片，用刀切成邊長約0.5厘米小方塊，在農(nóng)桿菌懸液中浸泡5～10分鐘，然后用滅菌濾紙吸干。
(3)共培養(yǎng)將葉塊擺放在不加抗生素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中(上面墊二層濾紙)于25％避光共培養(yǎng)3天。
(4)選擇培養(yǎng)將葉片繼代到選擇培養(yǎng)基中在光照培養(yǎng)箱中(光照12小時，黑暗12小時)培養(yǎng)至抗性芽的出現(xiàn)。
(5)抗性小苗的獲得將愈傷移至生根培養(yǎng)基因，每隔二周繼代培養(yǎng)一次，最后種植到小塑料缽中。
3.4轉(zhuǎn)基因煙草的分子生物學(xué)鑒定3.4.1 PCR鑒定取1～3克煙草鮮葉片，加等量Al2O3用液氮研磨，將粉末置于50ml離心管中，加入20ml DNA提取緩沖液(100mM Tris.HCl pH8.0,500mM NaCl,10mM β-巰基乙醇，50mM EDTA pH8.0)，劇烈振蕩1分鐘，加入4ml 10％SDS，輕輕混勻，于65℃加熱10～20分鐘，至顏色翠綠，加入冰冷5M KAC 4ml，冰上放置30分鐘，然后在4℃,12000rpm離心15分鐘，吸上清，用0.6倍異丙醇沉淀后，用RNAase處理，純化備用。
以轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板，用所合成sGNA基因的特異性引物進(jìn)行如下PCR反應(yīng)在0.5ml Eppendorf管中加入H2o30.5μl10×PCR buffer 5μlMgCl2(25mM)3μl4×dNTP(各2.5mM) 5μlPrimerl(20pmol/μl) 2.5μlPrimer2(20pmol/μl) 2.5μl模板質(zhì)粒pGUSO DNA(100ng/μl) 1μlTaq酶(3U/μl)0.5μl50μl石蠟油50μl反應(yīng)程序為94℃ 3分鐘93℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 60秒，35個循環(huán)72℃ 5分鐘所用引物(20pmol/ul)為Primer(上鏈)5’-CCCATGGACTGCAGGCTTTACTCTGG-3’26b(SEQ ID NO:8)Primer(下鏈)5’-GAGCTCTCATTATCCAGTAGCCC-3’ 23b(SEQ ID NO:9)結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別有與預(yù)期大小相符的DNA擴(kuò)增片段。
3.4.2 PCR產(chǎn)物的Southern分析進(jìn)一步進(jìn)行PCR的Southern分析，(1)將植物DNA的PCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并照相。
(2)將膠置于小盤中加入200ml變性液(0.5M NaOH,1.5M NaCl)振蕩45分鐘。
(3)棄去變性液，用蒸餾水漂洗數(shù)次，加入中和液(1M Tris,pH7.4,1.5MNaCl)200ml，振蕩30分鐘，然后更換新的中和液，繼續(xù)中和15分鐘。
(4)剪相應(yīng)大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，于蒸餾水中均勻濕透后，將NC膜浸于10×SSC(20×SSC每1000ml含NaCl 175.3g，檸檬酸鈉88.2g pH7.0)中，放置20分鐘。
(5)使用Bio-rad公司的轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜1小時。
(6)去掉膠塊，標(biāo)記好加樣孔位置，用6×SSC洗膜5分鐘，然后紫外照射5分鐘，以固定DNA。2×SSC洗膜，室溫風(fēng)干。
(7)將NC膜卷入雜交瓶中，加入20ml預(yù)雜交液(6×SSC,5×Denhardt,0.5％SDS,200ug/ml魚精DNA)，使膜均勻浸潤無氣泡，然后置于DNA分子雜交儀中68℃預(yù)雜交過夜。
(8)探針的標(biāo)記采用Promega公司隨機(jī)引物試劑盒標(biāo)記。取適量待標(biāo)記DNA片段，95-100℃變性2分鐘迅速置于冰上，在一新的Eppendrof管中，依次加入5×labling buffer 10μldCTP,dGTP,dTTP，混合物 2μl變性模板 25ngBSA2μlα-32P-dATP 5μl酶 1μl加H2O至總體積50μl輕輕混勻，室溫反應(yīng)60分鐘。95％變性2分鐘置于冰上。加入2μl 0.5MEDTA。
(9)向預(yù)雜交完畢的袋中加入變性探針30～50μl，重新封好繼續(xù)于68℃雜交8～10小時。
(10)取出雜交膜用2×SSC,0.5％SDS洗膜30分鐘，用2×SSC,0.1％SDS洗15分鐘，再用0.1×SSC,0.5％SDS于42℃洗膜30分鐘～數(shù)小時，中間更換新的洗膜液。
(11)0.1×SSC洗膜2分鐘，用吸水紙吸去水珠，用保鮮膜包好膜，暗室中壓片。
(12)-70℃放射自顯影3～6小時后洗片。
結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR-Southern的結(jié)果為陽性。
3.5轉(zhuǎn)基因煙草的GUS分析取轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，切幾個小塊(0.5mm2)，放到1.5ml Eppendorf管中并加入15ul GUS底物，于37℃處理過夜。然后用95％乙醇脫色2小時，70％乙醇繼續(xù)脫色數(shù)次，每次1小時以上。觀察是否出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)。結(jié)果證明，大部分轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)明顯的GUS陽性反應(yīng)。
3.6轉(zhuǎn)基因煙草的抗蚜蟲能力測試采用如下方法1)．配制1％的瓊脂糖，融化，倒入平皿中，以稍大于直徑25MM的打孔器打孔。以直徑25MM的打孔器取轉(zhuǎn)基因煙草葉片及非轉(zhuǎn)基因煙草葉片，注意避免大的葉脈處，放入瓊脂內(nèi)孔洞處，葉片下注入少量蒸餾水，保持葉片新鮮。
2)．將待接蚜蟲機(jī)餓4小時，然后每片葉片接四頭3-4齡蚜蟲，每天觀察、點(diǎn)數(shù)蟲數(shù)。
3)．連續(xù)觀察2-3周，記錄蚜蟲群體生長狀況。
結(jié)果表明，獲得的轉(zhuǎn)基因植株具有程度不同的抑制蚜蟲效果，抑制蚜口密度從30-85％不等。附圖3為表達(dá)雪花蓮凝集素GNA的轉(zhuǎn)基因煙草桃蚜抑制試驗結(jié)果。出圖3可知，轉(zhuǎn)基因植株對蚜蟲抗性明顯。
實施例4制備花粉管通道法轉(zhuǎn)化植物用植物表達(dá)載體pGBIGNA超純度質(zhì)粒DNA4.1大量提取質(zhì)粒pGBIGNA(1)接單菌落于20ml帶有相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃,250rpm條件下振蕩培養(yǎng)過夜。
(2)將菌液轉(zhuǎn)入4000ml液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)8-12小時；(3)用5000rpm離心5分鐘，收集菌體；(4)用STE 100ml懸浮洗滌菌體，合并各管于2個500ml離心管中，重新離心去上清；(5)分別向每管加入80ml SolutionⅠ(50mM蔗糖，10mM EDTA,25mM Tris-HCl pH8.0)，將菌體懸浮后加入160ml新配制的SolutionⅡ(0.2M NaOH,1％SDS)，輕輕混勻數(shù)次，冰上放置10分鐘，再加入120ml預(yù)冷的SolutionⅢ(每100ml含5M KAC 60ml，冰乙酸11.5ml，蒸餾水28.5ml)，輕輕混勻，冰上放置30分鐘；(6)8000rpm離心15分鐘，收集上清，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置10分鐘；(7)8000rpm離心15分鐘，70％乙醇洗滌一次，溶于4ml TE(10mM Tris,1mM EDTA pH8.0)中，加RNAase 8μl(10mg/ml)37℃處理1小時；(8)用酚、氯仿抽提純化一下，乙醇沉淀后溶于3mlTE中。
4.2超速離心進(jìn)一步純化所提取質(zhì)粒DNA(用Beckman公司超速離心機(jī))(1)在一個50ml離心管中加入2.9mlDNA溶液，6.6ml飽和氯化銫溶液，1ml溴化乙錠溶液(EB,10mg/ml)，混勻待用。
(2)上步中如有許多沉淀，則8000rpm離心5分鐘。
(3)將上述混合液轉(zhuǎn)入兩個5.2ml超速離心管中，用Beckman超速離心機(jī)專用設(shè)備熱封管口。
(4)用vTi80轉(zhuǎn)頭室溫真空離心20小時，6,5000rpm。
(5)在暗室中紫外光下，先在離心管上部用針頭穿孔，然后用5ml一次性注射器吸出質(zhì)粒亮帶。
(6)用水飽和正丁醇抽提數(shù)次去EB。
(7)用TE稀釋三倍后用二倍無水乙醇4℃沉淀，離心，溶解后稀釋待用。
實施例5植物受精胚囊注射法轉(zhuǎn)化棉花編碼GNA殺蟲蛋白質(zhì)的基因在植物中的高效表達(dá)，對于產(chǎn)生具有高抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植物是最為關(guān)鍵的，但是外源基因轉(zhuǎn)化植物是否能獲得成功，也是致關(guān)重要的環(huán)節(jié)。在本發(fā)明之前，本領(lǐng)域科技人員熟知的利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG法、電激法等方法轉(zhuǎn)化植物雖然有許多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不僅受到實驗室條件和昂貴的儀器及費(fèi)用極高等的限制，更重要的是上述方法都有一個不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生產(chǎn)上發(fā)揮著重要作用的優(yōu)良植物品種，由于基因型的不同，不能通過愈傷途徑再生成植株；或再生植株極為困難。在這樣的情況下，本申請的發(fā)明人通過植物受精胚囊注射轉(zhuǎn)化的技術(shù)或稱植物受精胚囊注射轉(zhuǎn)化法(CN95119563.8)，成功地獲得了具有高抗蟲能力的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花。雖然本發(fā)明優(yōu)選棉花作為子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊方法的起始植物，但并不限于棉花。子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于1)．適合于所有植物的基因型；2)．方法簡單，有效；3)．不受實驗室條件、儀器的限制，且費(fèi)用低；4)．速度快，一年內(nèi)即可獲得轉(zhuǎn)基因植物種子及后代。
在本實例中，子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊的方法，是在棉花開花授粉后的大約10-24小時之間。如在珠心孔道封閉之前，用微量注射系統(tǒng)將外源基因溶液注射到子房內(nèi)，外要材料即可通過珠孔和珠心孔道，逐漸擴(kuò)散到或在珠心孔道封閉的過程中被擠壓到剛受精后的胚囊內(nèi)。在受精卵分裂的過程中，外源基因被吸收整合到受精卵細(xì)胞的基因組中，從而完成外源基因?qū)牒驼线^程。
棉花是常異花授粉作物，為保持品種(系)的相對純度，在開花的前一天下午，將要在第二天開花的蕾用線扣緊，使花辨不易張開，以使其自花授粉。開花后約10小時左右，即當(dāng)天開花的晚6點(diǎn)鐘左右花粉管進(jìn)入胚囊后，即可進(jìn)行外源基因的注射。注射前將花辨連同雄蕊剝?nèi)ヂ冻鲇租?，抹去幼鈴頂端的花柱，我們設(shè)計的微量注射系統(tǒng)吸取預(yù)冷的外源基因溶液，從抹掉幼鈴的頂端，沿中軸垂直插入幼鈴大小的2/3處，再將微量注射器向上提到1/3的地方，留下約幼鈴1/3的插入空間，緩慢將注射裝置內(nèi)的外源溶液注射到插入空間內(nèi)。此后，外源DNA溶液將沿著珠孔和珠心孔道向受精胚囊內(nèi)擴(kuò)散，或由于珠心孔道在逐漸封閉而被擠壓進(jìn)受精胚囊中而實現(xiàn)其整合。一般注射的外源基因溶液為10μl，總量約為0.25-0.5μg。當(dāng)然，對于不同的作物可根據(jù)其子房內(nèi)胚珠數(shù)目的多少，適當(dāng)?shù)卦黾踊驕p少外源基因的注射量。外源基因注射后，為了防止和減少幼鈴的脫落，提高成鈴率，在幼鈴柄基部用毛筆涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夾在幼鈴柄基部和莖(枝)之間，同時將所說注射外源基因的幼鈴所在的枝條項端摘掉，以保持幼鈴的充分營養(yǎng)，從而將有利于成鈴和鈴內(nèi)種子的發(fā)育。
對注射后棉株所收獲種子的后代進(jìn)行抗蟲及分子檢測，獲得抗蟲棉植株。
實施例6所獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的分子生物學(xué)檢測及抗蟲性測試采用實施例3.4和3.6的方法，對所獲得的轉(zhuǎn)基因棉花植株分別進(jìn)行了PCR、PCR-Southern分析，以及抗蚜蟲試驗。證實了sGNA基因已導(dǎo)入到棉花中并高效表達(dá)。
附圖4提供了對所獲得抗蟲棉植株進(jìn)行PCR和PCR-Southern分子檢測的試驗結(jié)果照片。該試驗結(jié)果證明了sGNA基因已成功轉(zhuǎn)入到棉花基因組中。此外，還進(jìn)行了抗蟲棉的整株蟲試試驗每株棉花(包括抗蟲棉和對照棉)各在頂尖幼芽處接10頭三齡蚜蟲，置于相同條件下用隔離罩扣上，10天后觀察試驗結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗蟲棉對蚜蟲抗性十分明顯，蚜蟲數(shù)目很少，且生長狀態(tài)不佳，每株約為30～80個不等，棉株葉片舒展，生長情況完全正常；對照棉上蚜蟲數(shù)目較多，均在150個以上，且生長健康，棉株葉片萎縮。附圖5提供了所獲得抗蟲棉植株對蚜蟲抗性的一組試驗照片。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心(B)地址北京海淀區(qū)白石橋路30號(C)國家中國(D)郵編100081(F)電話(010)62184096(G)傳真(010)62184096(ⅱ)發(fā)明名稱合成編碼雪花蓮凝集素抗同翅目害蟲基因及其應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)15(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度333堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息人工合成的GNA基因序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:15′-CCCATGGACT GCAGGCTTTA CTCTGGAGAG ACTCTTTCTA CTGGAGAGTT CCTTAACTAC 60bpGGATCTTTCG TTTTCATCAT GCAAGAGGAT TGCAACCTTG TTCTTTACGA TGTTGATAAG 120bpCCAATTTGGG CTACTAACAC TGGAGGACTT TCTAGATCTT GCTTCCTTTC TATGCAAACT 180bpGATGGAAACC TTGTTGTTTA CAACCCATCT AACAAGCCAA TTTGGGCTTC TAACACTGGA 240bpGGACAAAACG GGAACTACGT TTGCATTCTT CAAAAGGATA GAAACGTTGT TATCTACGGA 300bpACTGATAGAT GGGCTACTGG ATAATGAGAG CTC-3’ 333bp(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度106個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)其它信息雪花蓮凝集素殺蟲蛋白(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:21 5 10 15Met Asp Cys Arg Leu Tyr Ser Gly Glu Thr Leu Ser Thr Gly Glu16 20 25 30Phe Leu Asn Tyr Gly Ser Phe Val Phe Ile Met Gln Glu Asp Cys31 35 40 45Asn Leu Val Leu Tyr Asp Val Asp Lys Pro Ile Trp Ala Thr Asn46 50 55 60Thr Gly Gly Leu Ser Arg Ser Cys Phe Leu Ser Met Gln Thr Asp61 65 70 75Gly Asn Leu Val Val Tyr Asn Pro Ser Asn Lys Pro lle Trp Ala76 80 85 90Ser Asn Thr Gly Gly Gln Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln91 95 100 105Lys Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Thr Asp Arg Trp Ala Thr106Gly(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(E)長度324堿基對(F)類型核苷酸(G)鏈型雙鏈(H)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)假設(shè)序列是(ⅳ)其它信息人工合成GNA基因序列的設(shè)計方案(ⅴ)序列描述SEQ ID NO:3NNN ATG GAY TGY CGN/AGR CTN/TTR TAY TCN/AGY GGN GAR ACN CTN/TTRTCN/AGY ACN GGN GAR TTY CTN/TTR AAY TAY GGN TCN/AGY TTY GTN TTYATY/ATA ATG CAR GAR GAY TGY AAY CTN/TTR GTN CTN/TTR TAY GAY GTNGAY AAR CCN ATY/ATA TGG GCN ACN AAY ACN GGN GGN CTN/TTR TCN/AGYCGN/AGR TCN/AGY TGY TTY CTN/TTR TCN/AGY ATG CAR ACN GAY GGN AAYCTN/TTR GTN GTN TAY AAY CCN TCN/AGY AAY AAR CCN ATY/ATA TGG GCNTCN/AGY AAY ACN GGN GGN CAR AAY GGN AAY TAY GTN TGY ATY/ATACTN/TTR CAR AAR GAY CGN/AGR AAY GTN GTN ATY/ATA TAY GGN ACN GAYCGN/AGR TGG GCN ACN GGN TAR/TGA注N=A、C、G、或T(四種核苷酸中任何一種)Y=T或C(兩種嘧啶堿基中任一種)R-A或G(兩種嘌呤堿基中任一種)(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度109堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息用于sGNA基因合成的寡核苷酸片段片段F-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:45′- CCCATGGACT GCAGGCTTTA CTCTGGAGAG ACTCTTTCTA CTGGAGAGTT CCTTAACTACGGATCTTTCG TTTTCATCAT GCAAGAGGAT TGCAACCTTG TTCTTTACG -3’ 109bp(6)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度108堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息用于sGNA基因合成的寡核苷酸片段片段F-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:55′- CCATCAGTTT GCATAGAAAG GAAGCAAGAT CTAGAAAGTC CTCCAGTGTT AGTAGCCCAAATTGGCTTAT CAACATCGTA AAGAACAAGG TTGCAATCCT CTTGCATG-3’108bp(7)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度106堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息用于sGNA基因合成的寡核苷酸片段片段F-3(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:65′-AGATCTTGCT TCCTTTCTAT GCAAACTGAT GGAAACCTTG TTGTTTACAA CCCATCTAACAAGCCAATTT GGGCTTCTAA CACTGGAGGA CAAAACGGGA ACTACG -3’106bp(8)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度110堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息用于sGNA基因合成的寡核苷酸片段片段F-4(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:75′-GAGCTCTCAT TATCCAGTAG CCCATCTATC AGTTCCGTAG ATAACAACGT TTCTATCCTTTTGAAGAATG CAAACGTAGT TCCCATTTTG GCCTCCAGTG TTGCTTGCCC-3’ 110bp(9)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息sGNA基因的PCR引物-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:85’-CCCATGGACTGCAGGCTTTACTCTGG-3’26b(10)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息sGNA基因的PCR引物-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:95’-GAGCTCTCATTATCCAGTAGCCC-3’23b(11)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度57堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息Ω序列片段引物-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:105’-CCTAGGATCC TATTTTTACA ACAATTACCA ACAACAACAA ACAACAAACA ACATTAC-3’57(12)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度50堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息Ω序列片段引物-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:115’-GTTGTTTGTT GTAATGTTAA TGATAAATGT TATTGTTACC TGACGTCGGG-3’50b(13)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度91堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息合成的Ω序列和Kozack片段(ⅳ)序列拙述SEQ ID NO:125’-CCTAGGATCC TATTTTTACA ACAATTACCA ACAACAACAA ACAACAAACA ACATTACAATTACTATTTAC AATAACAATG GACTGCAGCC C-3’91bp(14)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度802堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息外源基因表達(dá)盒5’端帶有加倍增強(qiáng)子的35S啟動子序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:13CAAGCTTCAT ACAGAGCTCA ATGACAAGAA GAAAATCTTC GTCAACATGG TGGAGCTCTC 60bTTACGAACGA CACGATTGTC TACTCCAAAA ATATCAAAGA TACAGTCTCA GAAGACCAAA120bGGGCAATTGA GACTTTTCAA CAAAGGGTAA TATCCGGAAA CCTCCTCGGA TTCCATTGCC180bCAGCTATCTG TCACTTTATT GTGAAGATAG TGGAAAAGGA AGGTGGCTCC TTACAATGCC240bATCATTGCGA TAAAGGAAAG GCCATCGTTG AAGATGCCTC TGCCGACAGT GGTCCCAAAG300bATGGACCCCC ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA360bAGCAAGTGGA TTGATGTGAT ACTCCAAAAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG420bGGCAATTGAG ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCCGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC480bAGCTATCTGT CACTTTATTG TGAAGATAGT GGAAAAGGAA GGTGGCTCCT TACAATGCCA540bTCATTGCGAT AAAGGAAAGG CCATCGTTGA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA600bTGGACCCCCA CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA660bGCAAGTGGAT TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC720bTTCGCAAGAC CCTTCCTCTA TATAAGGAAG TTCATTTCAT TTGGAGAGGA CACGCTGAAA780bTCACCTCTAG AGGATCCCCG GG 802b(15)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息讀碼框不同的終止子編碼序列(UT)(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:145’-CACTCGAGGC TGAATGAGTA AGTGAGTAGG TTAAC-3’35bp(16)SEQ ID N0:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度95堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)其它信息正確切割和修飾以及植物多腺苷信號肽序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:155’-GGTTAACTTT GAGTATTATG GCATTGGAAA AGCCATTGTT CTGCTTGTAA TTTACTGTGTTTCTTTCAGT TTTTGTTTTC GGAAATAAAG TTAAC-3’ 95bp
權(quán)利要求
1．合成的編碼雪花蓮凝集素殺蟲蛋白質(zhì)或其部分的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列及其功能等同序列。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，特征在于其編碼具有如SEQ ID NO:2所示的雪花蓮凝集素的氨基酸序列或其部分及其功能等同蛋白質(zhì)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，其功能等同序列符合SEQ ID NO:3所示核苷酸序列或其部分。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的核苷酸序列，特征在于其基本上是由適合于在普通植物細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化密碼子組成的。
5．適于在植物細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求1的核苷酸序列的融合植物表達(dá)載體。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的融合植物表達(dá)載體，其中包含的雪花蓮凝集素基因表達(dá)盒包含a)．5′端非編碼區(qū)b)．根據(jù)權(quán)利要求1～4的核苷酸序列c)．3′端非編碼區(qū)
7．根據(jù)權(quán)利要求6的融合植物表達(dá)載體，其中a)所說的5′端非編碼區(qū)由兩個增強(qiáng)子序列，一個啟動子序列，一個衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因的翻譯增強(qiáng)序列，和一個編碼核糖體結(jié)合蛋白的序列組成。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的5′端非編碼區(qū)，其中所說的帶有加倍的增強(qiáng)子元件的CaMV 35S啟動子序列具有如SEQ ID NO:13的核苷酸序列或其功能等同序列。
9．根據(jù)權(quán)利要求7的5′端非編碼區(qū)，其中所說的翻譯增強(qiáng)序列是Ω序列和Kozak序列，具有如SEQ·ID NO:12的核苷酸序列或其功能等同序列。
10．根據(jù)權(quán)利要求6的雪花蓮凝集素基因表達(dá)盒，其中c)中所說的3′端非編碼區(qū)包含一個多聯(lián)終止子序列，具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或其功能等同序列。一個融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切割序列和一個融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工序列，具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序或其功能等同序列。
11．可構(gòu)建在植物表達(dá)載體中并在植物細(xì)胞或整株植物中表達(dá)雪花蓮凝集素的基因表達(dá)盒，其具有保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCC NO.0363的攜帶于大腸桿菌DH5α中的重組載體pG4AS8的特征。
12．產(chǎn)生對同翅目害蟲有殺蟲性的植物的方法，該方法包括1)．構(gòu)建所說的如權(quán)利要求5至10所描述的融合植物表達(dá)載體；2)．用任何一種可行方法將步驟1)中得到的融合植物表達(dá)載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)，并由此獲得對害蟲有抗性或殺傷能力的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括種子和任何部分的植物組織。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說的植物是可表達(dá)權(quán)利要求5的融合植物表達(dá)載體的任何一種植物。
14．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說的植物是棉花。
全文摘要
本發(fā)明提供了人工合成的編碼雪花蓮凝集素的基因。涉及包含所說基因的融合基因構(gòu)建體,攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體。該表達(dá)載體具有在普通植物中高效表達(dá)的特性。還涉及被所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞,以及由所說的轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的對害蟲,尤其是對同翅目害蟲表現(xiàn)有殺蟲性的轉(zhuǎn)基因植物及其后代,包括植物種子及植物組織。本發(fā)明尤其涉及了抗蚜蟲轉(zhuǎn)基因棉花。
文檔編號A01H1/00GK1222578SQ9812023
公開日1999年7月14日 申請日期1998年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月6日
發(fā)明者郭三堆 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心