專利名稱：：用于細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的靜止細(xì)胞群體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及產(chǎn)生包括(但不限于)進(jìn)行遺傳選擇地和/遺傳修飾的動(dòng)物在內(nèi)的動(dòng)物。通過將供體胚的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至一個(gè)去核卵母細(xì)胞或一個(gè)細(xì)胞合子中重組哺乳動(dòng)物胚，使生產(chǎn)遺傳相同的個(gè)體。這顯然既有利于研究(即作為生物學(xué)控制)，也有利于商業(yè)應(yīng)用(即有遺傳價(jià)值的家畜的繁殖、肉產(chǎn)品的均一性、動(dòng)物管理)。使用早期胚作為細(xì)胞核供體的一個(gè)問題是，可以由單個(gè)胚產(chǎn)生的后代數(shù)受細(xì)胞(32-64細(xì)胞期的胚最廣泛地用于農(nóng)畜物種中)數(shù)和細(xì)胞核轉(zhuǎn)移方案效率這兩者的限制。與采用胚作為細(xì)胞核供體相反，由可以培養(yǎng)維持的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生活后代的能力，是動(dòng)物育種家一段時(shí)間來追求的目標(biāo)。與使用早期胚相比，由培養(yǎng)的細(xì)胞系產(chǎn)生克隆后代的能力能夠提供許多優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括長(zhǎng)期生產(chǎn)大量相同的后代(培養(yǎng)細(xì)胞可以冷凍和貯存)，在胚重組前進(jìn)行遺傳修飾和/選擇具有所需基因型(例如性)的細(xì)胞群體的能力。一種用于這些方法的潛在細(xì)胞類型為胚干(ES)細(xì)胞。已經(jīng)在小鼠中分離出ES細(xì)胞，然而在用于細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后尚未有發(fā)育至足月的報(bào)道。目前在豬中有一個(gè)ES樣細(xì)胞的報(bào)道，該細(xì)胞在注射到體內(nèi)產(chǎn)生的胚囊的囊胚腔后有助于發(fā)育(Wheeler，Reprod.Fertil.Dev.6563-568(1994))，但在其它農(nóng)畜物種中沒有嵌合現(xiàn)象的報(bào)道，在任何哺乳動(dòng)物物種中，也沒有在由建立的細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后發(fā)育至足月的報(bào)道。使用ES細(xì)胞系有幾個(gè)選擇的方法；其中一個(gè)是尋找用于細(xì)胞核轉(zhuǎn)移時(shí)能夠啟動(dòng)發(fā)育的其它細(xì)胞群體。幾個(gè)報(bào)道已經(jīng)表明原生殖細(xì)胞是適宜的候選細(xì)胞；然而尚未報(bào)道發(fā)育至足月。盡管在羊中已經(jīng)報(bào)道由較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的早期傳代細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)移可以引起發(fā)育(Campbell等，Therio43181(1995))，但由早期胚建立的細(xì)胞系已經(jīng)表明，采用常規(guī)細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的方案不能引起發(fā)育(Campbell等，J.AbstractSeries(5)31(1995))。為了在細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后能夠發(fā)育至足月，必須重新設(shè)置轉(zhuǎn)移細(xì)胞核的發(fā)育鐘。為此，必須阻止轉(zhuǎn)錄的發(fā)生，然后以發(fā)育調(diào)節(jié)模式重新開始。現(xiàn)有報(bào)道已經(jīng)表明，在母羊、羊、豬、兔和小鼠中可以由多種細(xì)胞類型達(dá)到發(fā)育至胚囊期。然而，在所有這些報(bào)道中，都沒有報(bào)道發(fā)育至足月。先前已經(jīng)報(bào)道了，由9天大羊胚的胚盤(ED)建立的初級(jí)細(xì)胞系(至多第3代，包括第3代)進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后，分娩了活羔羊(Campbell等，Therio43181(1995))。然而，采用常規(guī)細(xì)胞核轉(zhuǎn)移方案，在隨后的培養(yǎng)中沒有得到發(fā)育至足月(第6代和第11代)(Campbell等，J.ReprodFertil.AbstractSeries(5)31(1995))。這些結(jié)果可以以多種方式解釋；第一，可以假定在早期培養(yǎng)期間獲得的所有得自ED的細(xì)胞都能夠啟動(dòng)發(fā)育。然而，在建立細(xì)胞系的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中，當(dāng)這些細(xì)胞用作細(xì)胞核供體以將細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至上述論文所指的“通用受體”中時(shí)，這些細(xì)胞改變，由此變得不能控制發(fā)育。或者，可以假定在早期培養(yǎng)期間，一個(gè)細(xì)胞亞群體保持啟動(dòng)發(fā)育的能力，這可以解釋在這些早期傳代期間進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生活的后代?，F(xiàn)有研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)供體細(xì)胞核和受體胞質(zhì)細(xì)胞周期的協(xié)調(diào)在通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)移重組的胚發(fā)育中的作用。(Campbell等，Biol.Reprod.49933-942(1993)和Biol.Reprod.501385-1393(1994))。采用現(xiàn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)移方案，用分離的全能細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)移有如下兩種兩個(gè)可能的策略(1)修改現(xiàn)有的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移方法；或(2)在細(xì)胞核轉(zhuǎn)移前修飾供體細(xì)胞的染色質(zhì)。全能細(xì)胞可以指導(dǎo)整個(gè)動(dòng)物的發(fā)育(當(dāng)通過將細(xì)胞核從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至諸如去核卵母細(xì)胞之類的受體細(xì)中重組胚時(shí)，正是供體細(xì)胞的細(xì)胞核是全能的)。這包括指導(dǎo)胚外譜系(即胎盤)的發(fā)育。在該定義中，受精合子和某些物種中的個(gè)別分裂球也是全能的。相反，多能細(xì)胞(即胚干細(xì)胞)類型已經(jīng)定義為在注射到囊胚腔后，在胎體/后代中可以形成所有組織的細(xì)胞類型。在上面概述的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移策略(1)和(2)兩者中，都需要一個(gè)方法，以允許對(duì)轉(zhuǎn)移細(xì)胞核的基因表達(dá)進(jìn)行重編程序然后這一方法允許使用分化或部分分化的細(xì)胞作為細(xì)胞核供體，并可以“顯示”它們的內(nèi)在全能性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物胚的重組中，最好可以將靜止細(xì)胞(也就是說不通過細(xì)胞周期活性增殖的細(xì)胞)用作細(xì)胞核供體。然后可以讓這類胚發(fā)育至足月。這些細(xì)胞用作細(xì)胞核供體之前，通過使它們進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，似乎可誘導(dǎo)在胚重組后觀察到的供體核變化，而該變化是有效核轉(zhuǎn)移所需的。在本申請(qǐng)中利用了這一事實(shí)。按照本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一個(gè)重組動(dòng)物胚的方法，該方法包括將靜止供體細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至適宜的受體細(xì)胞中。原則上，本發(fā)明可應(yīng)用于所有動(dòng)物，包括諸如家禽之類的鳥類、兩棲類物種和魚物種。然而實(shí)際上，對(duì)于非人類動(dòng)物，尤其是(非人類)哺乳動(dòng)物，特別是有胎盤哺乳動(dòng)物而言，它是目前想象的最具有商業(yè)用途的應(yīng)用。對(duì)于有蹄類動(dòng)物，特別是經(jīng)濟(jì)上重要的有蹄類動(dòng)物，諸如牛、羊、山羊、水牛、駱駝和豬等，本發(fā)明作為克隆動(dòng)物的方法和作為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或遺傳修飾動(dòng)物的方法，都可能是最有用的。大家也應(yīng)該注意到，本發(fā)明也可以應(yīng)用于其它經(jīng)濟(jì)上重要的動(dòng)物物種，諸如馬、駝羊或嚙齒動(dòng)物，例如大鼠和小鼠或兔。本發(fā)明同樣可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因以及非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)中。可以由遺傳改變的供體細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。與常規(guī)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因(即遺傳修飾的)動(dòng)物的方法相比，整個(gè)方法有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，可以總結(jié)如下(1)需要較少的受體；(2)可以采用克隆供體細(xì)胞產(chǎn)生多個(gè)同系基因建立者；(3)允許通過基因靶進(jìn)行精細(xì)的遺傳改變；(4)由于每個(gè)動(dòng)物都得自單個(gè)細(xì)胞核，因此由通過本發(fā)明制備的胚生產(chǎn)的所有動(dòng)物都應(yīng)該通過種系傳遞相關(guān)的遺傳修飾；相反，在通過胚囊注射或其它方法包含修飾的干細(xì)胞種群后，通過原核注射或嵌合現(xiàn)象進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)，產(chǎn)生一部分嵌合動(dòng)物，在后者中，不是所有的細(xì)胞都含有該修飾，產(chǎn)生的動(dòng)物可能不通過種系傳遞該修飾；(5)在產(chǎn)生整個(gè)動(dòng)物之前，可以選擇具有遺傳修飾(例如整合)位點(diǎn)的細(xì)胞。大家應(yīng)該注意，與動(dòng)物有關(guān)的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不應(yīng)該有限地用來指種系中含有一個(gè)或多個(gè)另一物種基因的動(dòng)物，盡管許多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物含有這樣的一個(gè)或多個(gè)基因。相反地，更廣義地講，該術(shù)語是指其種系為重組DNA技術(shù)進(jìn)行技術(shù)介入的對(duì)象的任何動(dòng)物。因此，本發(fā)明目的的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物既是例如種系中缺失、復(fù)制、激活或修飾一個(gè)內(nèi)源基因的動(dòng)物，也是種系中加入外源DNA序列的動(dòng)物。在該動(dòng)物為轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明實(shí)施方案中，對(duì)供體細(xì)胞核進(jìn)行遺傳修飾。供體細(xì)胞核可以含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因，可以在細(xì)胞核轉(zhuǎn)移和胚重組之前進(jìn)行遺傳修飾。盡管與注射到合子的雄性原核或雌性原核類似的微注射可以用作遺傳修飾的方法，但本發(fā)明不限于該方法也可以使用物質(zhì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，例如電穿孔、病毒轉(zhuǎn)染或脂染(lipofection)。在上述本發(fā)明方法中，將細(xì)胞核從靜止供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞中。該方法的使用不限于特殊的供體細(xì)胞類型。采用該技術(shù)，可以證明可以誘導(dǎo)進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)或體內(nèi)存在于靜止?fàn)顟B(tài)的所有核型正常的細(xì)胞(包括胚體細(xì)胞、胎兒體細(xì)胞和成體體細(xì)胞)都是全能的。因此，本發(fā)明打算使用至少部分分化的細(xì)胞，包括全分化細(xì)胞。供體細(xì)胞可以(但不必)處于培養(yǎng)中。下面例舉培養(yǎng)的牛初級(jí)成纖維細(xì)胞、得自胚的羊細(xì)胞系(TNT4)、得自6歲成年羊羊乳房上皮細(xì)胞的細(xì)胞系(OME)、得自胎羊組織的成纖維細(xì)胞細(xì)胞系(BLWF1)和得自9天大羊胚的上皮樣細(xì)胞系(SEC1)。包括TNT4細(xì)胞系在內(nèi)的可用于本發(fā)明的一類得自胚的細(xì)胞系也是共同未決的PCT專利申請(qǐng)PCT/GB95/02095(以WO96/07732公布)的對(duì)象。為了用于本發(fā)明，供體細(xì)胞是靜止的，也就是說它們不通過有絲分裂細(xì)胞周期進(jìn)行活性增殖。有絲分裂細(xì)胞周期有四個(gè)不同的時(shí)期，為G、S、G2和M期。在細(xì)胞周期中稱為起始(start)的開始現(xiàn)象發(fā)生在G1期，具有獨(dú)特的功能。在起始時(shí)作出進(jìn)行另一細(xì)胞周期的決定或保證。一旦細(xì)胞通過起始，則細(xì)胞通過余下的G1期，這是前DNA合成期。DNA合成時(shí)，為第二階段S期。隨后為G2期，為DNA合成與有絲分裂之間的時(shí)期。有絲分裂本身發(fā)生在M期。一般認(rèn)為靜止細(xì)胞(包括已經(jīng)誘導(dǎo)靜止的細(xì)胞以及天然靜止的細(xì)胞，諸如某些完全分化的細(xì)胞)不處于該周期四個(gè)時(shí)期中的任一期內(nèi)；通常描述它們處于G0狀態(tài)，以便表示它們不能正常地通過該周期進(jìn)行。靜止G0細(xì)胞的細(xì)胞核具有二倍體DNA含量?？梢酝ㄟ^各種方法，包括化學(xué)處理、營養(yǎng)物缺乏、生長(zhǎng)抑制或基因表達(dá)的操作，誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)。目前，降低培養(yǎng)基中的血清濃度已經(jīng)成功地在羊和牛細(xì)胞系中用來誘導(dǎo)靜止。如上面所解釋的，在這種情況下細(xì)胞在G1期期間退出生長(zhǎng)周期，并停頓于所謂的G0期。這類細(xì)胞可以保持處于該狀態(tài)幾天(可能更長(zhǎng)時(shí)間，取決于該細(xì)胞)，直至當(dāng)它們重新進(jìn)入生長(zhǎng)周期時(shí)受到重新刺激。停頓于G0狀態(tài)的靜止細(xì)胞為二倍體。G0狀態(tài)為細(xì)胞周期中細(xì)胞能夠由此進(jìn)行分化的點(diǎn)。已經(jīng)報(bào)道了靜止時(shí)的大量新陳代謝變化，這些變化包括組蛋白單磷酸化、中心粒纖毛化、所有蛋白質(zhì)合成減少或完全停止、蛋白酶解增加、轉(zhuǎn)錄減少和RNA更新增加導(dǎo)致總細(xì)胞RNA減少、多核糖體解聚、失活80S核糖體累積和染色質(zhì)濃縮(Whitfield等的綜述，ControlofAnimalCellProliferation，1331-365(1985))。這些特征中的許多特征是將細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至去核卵母細(xì)胞后需要產(chǎn)生的特征。G0狀態(tài)與細(xì)胞分化有關(guān)的事實(shí)表明，可以提供的核/染色質(zhì)結(jié)構(gòu)更有利于由受體細(xì)胞胞質(zhì)重定模式和/或者重編程序。這樣，借助于處于靜止?fàn)顟B(tài)的供體細(xì)胞核，供體細(xì)胞核的染色質(zhì)可以在胚重組或重建前進(jìn)行修飾，使得該細(xì)胞核能夠指導(dǎo)發(fā)育。這與所有先前報(bào)道的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移方法的不同處在于，在使用細(xì)胞作為細(xì)胞核供體之前修飾供體細(xì)胞的細(xì)胞核。由供體轉(zhuǎn)移細(xì)胞核的受體細(xì)胞可以為卵母細(xì)胞或另一種合適的細(xì)胞?？梢允褂貌煌l(fā)育時(shí)期的受體細(xì)胞，即從中期I通過中期II的卵母細(xì)胞至合子和雙細(xì)胞胚。每種受體都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。使用受精卵確保有效的激活，而單性生殖激活需要用卵母細(xì)胞(參見下面)。在某些物種中可能適于使用卵裂期胚的另一機(jī)制是需要基因表達(dá)重編程序的程度。在小鼠的第二細(xì)胞周期期間開始轉(zhuǎn)錄，直至胚囊期的雙向電泳揭示，合成的蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒有主要變化(Howlett和Bolton，J.Embryol.Exp.Morphol.87175-206(1985))。但是在大多數(shù)情況下，受體細(xì)胞為卵母細(xì)胞。受體最好去核。盡管一般假定在細(xì)胞核轉(zhuǎn)移方法中受體卵母細(xì)胞的去核是必需的，但該判斷沒有公開的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。最初描述用于有蹄類動(dòng)物的方法涉及將該細(xì)胞分裂為兩半，其中一半可以去核(WilladsenNature320(6)63-65(1986))。該方法的缺點(diǎn)是，未知的另一半仍具有中期器，并且胞質(zhì)體積減小相信促進(jìn)新胚的分化模式(Eviskov等，Development109322-328(1990))。新近，已經(jīng)使用不同的方法試圖除去染色質(zhì)，同時(shí)除去最小量的胞質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)吸出第一極體和周圍的胞質(zhì)除去67％羊卵母細(xì)胞中的中期II器(Smith&amp;WilmutBiol.Reprod.401027-1035(1989))。只有使用DNA特異性熒光染料(Hoechst33342)提供的一個(gè)方法去核，才可以保證最小限度地減少胞質(zhì)體積(Tsunoda等，J.Rprod.Fertil.82173(1988))。在家畜物種中，這可能是一個(gè)目前常規(guī)使用的方法(Prather&amp;FirstJ.Rprod.Fertil.Suppl.41125(1990))；Westhusin等，Biol.Reprod.(Suppl.)42176(1990))。在哺乳動(dòng)物中有非常少的非侵入性去核方法的報(bào)道，而在兩棲類動(dòng)物中，將用紫外光輻射用作常規(guī)方法(GurdonQ.J.Microsc.Soc.101299-311(1960))。盡管在使用DNA特異性熒光染料期間，注意到小鼠卵母細(xì)胞暴露于紫外光超過30秒，將減小該細(xì)胞發(fā)育的潛力(Tsunoda等，J.Rprod.Fertil.82173(1988))，但在哺乳動(dòng)物中沒有使用該方法的詳細(xì)報(bào)道。供體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至的受體宿主細(xì)胞最好為去核中期II卵母細(xì)胞、去核未激活卵母細(xì)胞或去核預(yù)激活卵母細(xì)胞。至少當(dāng)受體為去核中期II卵母細(xì)胞時(shí)，可以在轉(zhuǎn)移時(shí)進(jìn)行激活?；蛘撸辽佼?dāng)受體為去核未激活中期II卵母細(xì)胞時(shí)，可以同時(shí)進(jìn)行激活。如上所述，可以通過實(shí)際除去核、原核或中期板(取決于受體細(xì)胞)進(jìn)行物理性去核，或者諸如通過應(yīng)用紫外光輻射或另一種去核影響，進(jìn)行功能性去核。三種適當(dāng)?shù)陌|(zhì)體(去核卵母細(xì)胞)受體為1.在我們今天申請(qǐng)的共同未決的PCT專利申請(qǐng)PCT/GB96/02098(由GB9517779.6要求優(yōu)先權(quán))中描述的“MAGIC受體”(中期停頓的G1/G0接納胞質(zhì)體MetaphaseArrestedG1/G0AcceptIngCytoplast)。2.“GOAT”(G0/G1ActivationandTransfer)-激活時(shí)為MII(中期II)的卵母細(xì)胞(Campbell等，Biol.Rprod.49933-942(1993))。3.“通用受體”(Campbell等，(Campbell等，Biol.Rprod.49933-942(1993)；Biol.Rprod.501385-1393(1994))。當(dāng)在重組胚中使用處于G0的供體細(xì)胞核時(shí)，所有這三種受體都產(chǎn)生常規(guī)倍性。然而，最近的報(bào)道表明，一部分來自靜止細(xì)胞的細(xì)胞核當(dāng)置于S期胞質(zhì)而不經(jīng)歷核膜分解時(shí)，不能進(jìn)入DNA合成期(Leno和Munshi，J.CellBiol.127(1)5-14(1994))。因此，盡管使用“通用受體”時(shí)一部分胚發(fā)育，但假設(shè)使用含有高濃度MPF(M期啟動(dòng)因子或成熟啟動(dòng)因子)的MII卵母細(xì)胞作為胞質(zhì)體受體，通過方法1或者方法2將導(dǎo)致較高頻率的發(fā)育。一旦鑒定出合適的供體和受體，則必須將前者的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至后者中。更好是通過融合進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。已經(jīng)建立的三種誘導(dǎo)融合的方法為(1)將細(xì)胞暴露于促進(jìn)融合的化學(xué)藥品，諸如聚乙二醇；(2)使用失活病毒，諸如仙臺(tái)病毒；(3)使用電刺激。將細(xì)胞暴露于促進(jìn)融合的化學(xué)藥品(諸如聚乙二醇或其它二醇)為體細(xì)胞融合的常規(guī)方法，但它尚未廣泛地用于胚。由于聚乙二醇有毒，必需將細(xì)胞進(jìn)行最短時(shí)間的暴露，需要能夠快速除去化學(xué)藥品迫使除去透明帶(Kanka等，Mol.Rprod.Dey.29110-116(1991))。在用小鼠胚的實(shí)驗(yàn)中，失活仙臺(tái)病毒提供一個(gè)融合卵裂期胚的細(xì)胞的有效方法(GrahamWistarInst.Symp.Monogr.919(1969))，其另一實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)是不誘導(dǎo)激活。在有蹄類動(dòng)物中，通常通過用誘導(dǎo)單性生殖激活的相同電刺激達(dá)到融合(WilladsenNature320(6)63-65(1986)；Prather等，Biol.Rprod.37859-866(1987))。在這些物種中，仙臺(tái)病毒在一部分情況下誘導(dǎo)融合，但不能用作常規(guī)應(yīng)用(WilladsenNature320(6)63-65(1986))。盡管細(xì)胞-細(xì)胞融合為進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的推薦方法，但它并不是可以使用的唯一方法。其它適宜的技術(shù)包括微注射(Ritchie和Campbell，J.ReproductionandFertilityAbstractSeriesNo.15，第60頁)。如果該細(xì)胞為卵母細(xì)胞，那么在細(xì)胞核轉(zhuǎn)移前或(最好)在核轉(zhuǎn)移后(或在某些情況下至少與細(xì)胞核轉(zhuǎn)移同時(shí))，一般必須通過單性生殖激活刺激受體細(xì)胞進(jìn)入發(fā)育。最近的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，單性生殖激活的需求比想象的更復(fù)雜。已經(jīng)假定，激活為全或無現(xiàn)象，能夠誘導(dǎo)原核形成的多種處理全都引起“激活”。然而，將兔卵母細(xì)胞暴露于重復(fù)的電脈沖表明，僅選擇適當(dāng)系列的脈沖并控制Ca2+能夠促進(jìn)二倍體化卵母細(xì)胞發(fā)育至妊娠中期(OzilDevelopment109117-127(1990))。在受精期間，胞內(nèi)鈣濃度重復(fù)地瞬時(shí)提高(Cutbertson&amp;CobboldNature316541-542(1985))，相信電脈沖引起類似的鈣濃度的增加。有證據(jù)表明，鈣的瞬變模式隨物種而變化，預(yù)期電脈沖的最佳模式以類似方式變化。在兔中，脈沖之間的間隔大約為4分鐘(OzilDevelopment109117-127(1990))，在小鼠中，為10-20分鐘(Cutbertson&amp;CobboldNature316541-542(1985))，而在母牛中的初步觀察到該間隔大約為20-30分鐘(Robl等，SymposiumonCloningMammalsbyNucleartransplantation(seideled.)，ColoradoStateUniversity，24-27(1992))。在大多數(shù)建立的實(shí)驗(yàn)中，用單個(gè)電脈沖誘導(dǎo)激活，但新的觀察表明，應(yīng)用多個(gè)脈沖，將增加發(fā)育的重組胚比例(Collas&amp;RoblBiol.Reprod.43877-884(1990))。在任一個(gè)別情況下，可以進(jìn)行常規(guī)調(diào)整，以優(yōu)化脈沖數(shù)、場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖持續(xù)時(shí)間以及培養(yǎng)基的鈣濃度。按照本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供用前述方法制備的重組動(dòng)物胚。按照本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供制備動(dòng)物的方法，該方法包括(a)按上述方法重組動(dòng)物胚；(b)使動(dòng)物由胚發(fā)育至足月；(c)可選地由如此形成的動(dòng)物進(jìn)行繁殖。上面已經(jīng)深入地描述了步驟(a)。本發(fā)明該方面方法中的第二步-步驟(b)是使動(dòng)物由胚發(fā)育至足月。這可以直接或間接進(jìn)行。在直接發(fā)育中，簡(jiǎn)單地讓步驟(a)的重組胚進(jìn)行發(fā)育，除允許進(jìn)行發(fā)育可能必需的介入外，不用進(jìn)一步的介入。然而在間接發(fā)育中，該胚在完全發(fā)育前可以進(jìn)一步進(jìn)行操作。例如，為了增加產(chǎn)量，可以使胚分裂，克隆細(xì)胞增加?；蛘呋蛄硗?，借助于本發(fā)明，通過克隆擴(kuò)大培養(yǎng)供體和/或如果采用系列(細(xì)胞核)轉(zhuǎn)移方法，可以增加能活胚的產(chǎn)量。由于大多數(shù)胚不“重編程序”(盡管可接受數(shù)量的胚“重編程序”)，可能引起目前得到的胚囊形成速率的限制。如果是這樣，那么可以如下提高該速率，每個(gè)自身發(fā)育的胚(諸如桑椹期或在32-64細(xì)胞期)可以用作細(xì)胞核供體；另一方法是，可以使用胚囊期的內(nèi)細(xì)胞群細(xì)胞。得自這些隨后轉(zhuǎn)移的胚本身也可以用作潛在的細(xì)胞核供體，以進(jìn)一步提高效率。如果這些胚實(shí)際上確實(shí)反映出已經(jīng)具有重編程序的基因表達(dá)并且那些細(xì)胞核事實(shí)上發(fā)生重編程序(看上去可能是)，這樣每個(gè)發(fā)育中的胚的繁殖可能有賴于細(xì)胞核轉(zhuǎn)移方法的效率。可能達(dá)到的增加程度取決于細(xì)胞類型。在羊中，通過將16細(xì)胞胚的單個(gè)分裂球轉(zhuǎn)移至預(yù)激活的“通用受體”卵母細(xì)胞中，可以容易地獲得55％的胚囊期胚。因此，可以這樣假設(shè)，由單個(gè)細(xì)胞發(fā)育的每個(gè)胚可以產(chǎn)生8個(gè)16細(xì)胞期的胚。盡管這些數(shù)字只是大致的指導(dǎo)，但很明顯，在較遲的發(fā)育階段時(shí)，收益程度取決于該階段時(shí)該方法的效率。我們也預(yù)計(jì)，由按前述形成的胚或產(chǎn)生的胎兒或成體，可以產(chǎn)生作為細(xì)胞核供體細(xì)胞源的新細(xì)胞系。在某些情況下，在重組胚發(fā)育至足月期間可能有一些限制，最好可以產(chǎn)生由得自自然形成的胚和通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)移重組的胚的細(xì)胞形成的嵌合動(dòng)物。采用自然胚的部分細(xì)胞和至胚囊期的任何時(shí)期的重組胚的部分細(xì)胞，通過聚集或注射，可以形成這一嵌合體。細(xì)胞的比例為50∶50，或?yàn)檫_(dá)到形成發(fā)育至足月的胚的另一合適的比例。在這些情況下，認(rèn)為正常細(xì)胞的存在有助于解救重組胚，并允許成功地發(fā)育至足月并分娩活體。除提高產(chǎn)量的權(quán)宜之計(jì)的問題外，重組胚還可以體內(nèi)或體外培養(yǎng)至胚囊。經(jīng)驗(yàn)表明，通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)移得到的胚與正常胚不同，有時(shí)得益于體內(nèi)培養(yǎng)條件或甚至需要體內(nèi)培養(yǎng)條件，而不是胚通常培養(yǎng)的條件(至少在體內(nèi))。不知道其原因。在牛胚常規(guī)增殖中，已經(jīng)將重組胚(一次多個(gè)胚)在羊輸卵管中培養(yǎng)5-6天(如Willadsen在MammalianEggTransfer(Adams，E.E.，ed.)185CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)lorida(1982)中所述)。但是在本發(fā)明實(shí)施中，為了保護(hù)該胚，在轉(zhuǎn)移前最好應(yīng)該將該胚包埋在保護(hù)性培養(yǎng)基(諸如瓊脂)中，然后在從臨時(shí)受體回收后從瓊脂中解剖出來。保護(hù)性瓊脂或其它培養(yǎng)基的功能有兩個(gè)第一，它起該胚的結(jié)構(gòu)輔助器的作用，使透明帶保持在一起；第二，它對(duì)受體動(dòng)物的免疫系統(tǒng)細(xì)胞起屏障的作用。盡管該方法提高形成胚囊的胚的比例，但其缺點(diǎn)是可能損失大量的胚。如果使用體外培養(yǎng)條件，那么本領(lǐng)域采用的那些常規(guī)條件是相當(dāng)可接受的。在胚囊期，可以篩選該胚發(fā)育至足月的適應(yīng)性。通常，這在該胚為轉(zhuǎn)基因和進(jìn)行篩選，并且已經(jīng)選擇穩(wěn)定的整合體時(shí)進(jìn)行。在該階段也可以篩選非轉(zhuǎn)基因的遺傳標(biāo)記。然而，因?yàn)楸景l(fā)明方法允許早期篩選供體，因此一般最好進(jìn)行篩選。如果進(jìn)行篩選，那么在篩選后，讓胚囊胚發(fā)育至足月。這一般在體內(nèi)進(jìn)行。如果在體外發(fā)育至胚囊，那么在該階段轉(zhuǎn)移到最終受體動(dòng)物中。如果在體內(nèi)進(jìn)行胚囊發(fā)育，那么盡管原則上可以讓胚囊在胚囊前宿主中發(fā)育至足月，但實(shí)際上通常從(臨時(shí))胚囊前受體中取出胚囊，在從保護(hù)性培養(yǎng)基中解剖出來后，將其轉(zhuǎn)移至(永久)胚囊后受體中。在本發(fā)明該方面的可選步驟(c)中，可以由用先前步驟制備的動(dòng)物繁殖動(dòng)物。這樣，可以用一個(gè)動(dòng)物來建立具有所需遺傳特性的一群動(dòng)物。通過轉(zhuǎn)移來自遺傳相同細(xì)胞的細(xì)胞核生產(chǎn)的動(dòng)物共享相同的細(xì)胞核，但嚴(yán)格來講這些動(dòng)物是不相同的，因?yàn)樗鼈兊米圆煌穆涯讣?xì)胞。不清楚這種不同來源的重要性，但它可能影響商業(yè)品質(zhì)。最近在IowaStateUniversityBreedHerd的奶牛中進(jìn)行的線粒體DNA分析表明與牛奶和生殖性能有關(guān)(Freeman和Beitz，SymposiumonCloningMammalsbyNuclearTransplantation(Seidel，G.E.Jr，ed.)17-20，ColoradoStateUniversity，Colorado(1992))。仍有待于證實(shí)在整個(gè)牛群體中存在相似的作用，并且考慮是否可能或必需在特定情況下考慮卵母細(xì)胞的選擇。在牛育種領(lǐng)域中，由高遺傳價(jià)值供體生產(chǎn)大量胚的能力在通過國家牧群傳播遺傳改良方面可能具有相當(dāng)大的潛在價(jià)值。應(yīng)用范圍取決于每個(gè)胚的成本和能夠發(fā)育至足月的轉(zhuǎn)移胚的比例。通過說明和概述，以下流程陳述了可以用來制備轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般方法。該方法包括5個(gè)步驟(1)選擇和分離適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞，可能包括評(píng)價(jià)核型、誘導(dǎo)靜止(停頓于G0)和/或誘導(dǎo)發(fā)育；(2)應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)技術(shù)生產(chǎn)遺傳修飾的細(xì)胞群體。這類技術(shù)可能包括基因加入、基因打出(knock-out)、基因打入(knock-in)和其它基因修飾。也可以可選地通過轉(zhuǎn)染具有或不具有選擇標(biāo)記的適當(dāng)構(gòu)建物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因；(3)可選地篩選和選擇所需基因型/表型的修飾細(xì)胞群體(即穩(wěn)定的整合體)；(4)在修飾細(xì)胞群體中誘導(dǎo)靜止；(5)通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)移進(jìn)行胚重組；(6)體內(nèi)或體外培養(yǎng)至胚囊；(6a)可選地篩選和選擇穩(wěn)定的整合體(如果在(3)進(jìn)行篩選，則省略此步驟)或其它所需的特性；(7)必要時(shí)轉(zhuǎn)移至最終受體中。按照本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供按上述方法制備的動(dòng)物。本發(fā)明每個(gè)方面的推薦特征是對(duì)其它方面而言的，可予以必需的修改?，F(xiàn)在參考所附的實(shí)施例描述本發(fā)明，這些實(shí)施例的提供是為了說明本發(fā)明，不要解釋為限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1在供體細(xì)胞中誘導(dǎo)靜止已經(jīng)表明在培養(yǎng)的細(xì)胞系中誘導(dǎo)靜止的各種方法，包括接觸抑制法或血清饑餓法(Whitfield等的綜述，ContrilofAnimalCellPeoliferation，1331-365(1985))。我們認(rèn)為誘導(dǎo)靜止的方法不重要，重要的步驟是細(xì)胞退出細(xì)胞周期，停頓于G0狀態(tài)，同時(shí)具有二倍體DNA含量并保持有活力。在實(shí)施例3和實(shí)施例4中，采用牛初級(jí)成纖維細(xì)胞的血清饑餓法、由胚囊體內(nèi)產(chǎn)生的7天大的內(nèi)細(xì)胞群團(tuán)塊建立的牛細(xì)胞系誘導(dǎo)靜止，使細(xì)胞停頓于細(xì)胞周期的G0期。同樣地，將血清饑餓法用來誘導(dǎo)實(shí)施例5中描述的供體靜止。實(shí)施例2分離卵母細(xì)胞和細(xì)胞核轉(zhuǎn)移可以通過(i)屠宰場(chǎng)材料的體外成熟，或經(jīng)陰道進(jìn)行濾泡穿刺；(ii)體內(nèi)成熟和手術(shù)回收；或(iii)任何其它適當(dāng)?shù)姆椒ǐ@得卵母細(xì)胞。應(yīng)該通過在含有1.0％胎牛血清(FCS)的無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗輸卵管，收獲所有體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至含有1.0％FCS的無鈣M2(Whittingham和Wales，Aust.J.Biol.Sci.221065-1068(1969))中。剝下卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞，按前述方法去核(Campbell等，Biol.Reprod.49933-942(1993)和Biol.Reprod.501385-1393(1994))，只是所有步驟都使用無鈣培養(yǎng)基。融合步驟修改了先前報(bào)道的那些方法(Campbell等，1993，1994loccit)，并且按照下面相關(guān)節(jié)描述的方法；或者可以通過將供體細(xì)胞注射到去核卵母細(xì)胞中導(dǎo)入該細(xì)胞核(Ritchie和Campbell，J.Reprod.Fertil.AbstractSeries(5)60(1995))。這些活性的定時(shí)取決于物種，以下兩個(gè)方案概述了體內(nèi)成熟的羊卵母細(xì)胞和體外成熟的牛卵母細(xì)胞的用法。實(shí)施例3羊的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移3.1.供體母羊的超刺激和卵母細(xì)胞的回收將蘇格蘭黑臉母羊用孕激素(progestagen)海綿同步化14天(VeramixTM，Upjohn，UK)，通過連續(xù)兩天單次注射3.0mg/天(總共6.0mg)的羊促濾泡素(FSH)(OvagenTM，Immuno-chemicalProductsLtd，NewZealand)，誘導(dǎo)超數(shù)排卵。在第二次注射FSH后24小時(shí)，用單次劑量為8mg的促性腺素釋放激素類似物(GnRHReceptalTM，Hoechst，UK)誘導(dǎo)排卵。在GnRH注射后24-29小時(shí)時(shí)，用含有1.0％胎牛血清(FCS)Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(保持37℃直至使用)沖洗輸卵管，回收未受精的中期II卵母細(xì)胞。3.2.卵母細(xì)胞的操作將回收的卵母細(xì)胞保持在37℃下，在含有1.0％FCS的PBS中洗滌，于37℃將其轉(zhuǎn)移至含有10％胎牛血清(FCS)的無鈣M2培養(yǎng)基上。為了除去染色體，于37℃下將(去核)卵母細(xì)胞在含有1.0％FCS、7.5μg.ml細(xì)胞松弛素B(Sigma)和5.0μg/mlHoechst33342(Sigma)的無鈣M2中放置20分鐘。用20μM玻璃吸管，直接從第一極體下面吸出少量胞質(zhì)。將吸出的胞質(zhì)部分置于UV光下并檢查中期板的存在以證實(shí)去核。3.3.胚重組將多組10-20個(gè)卵母細(xì)胞去核，在礦物油(SIGMA)下、于37℃、5％CO2下，將其置于20μl無鈣M2培養(yǎng)基小滴上。將以下三個(gè)方案(a)、(b)和(c)中的每個(gè)方案用于胚重組。(a)“MAGIC”(中期停頓的G1/G0接納胞質(zhì)體MetaphaseArrestedG1/G0AcceptIngCytoplast)用玻璃吸管通過預(yù)先在透明帶中制造的孔轉(zhuǎn)移細(xì)胞，使單個(gè)細(xì)胞與卵母細(xì)胞接觸。然后將胞質(zhì)體/細(xì)胞融合對(duì)轉(zhuǎn)移至融合室中的含0.3M甘露醇的200μl蒸餾水中，將融合對(duì)在電極之間人工排成一排。施加3秒5V的交流脈沖，然后施加3個(gè)80μs1.25kV/cm的直流脈沖。然后融合對(duì)于37℃在含10％FCS的無鈣M2中洗滌，在油下，于37℃5％CO2下在同一培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在激活前30分鐘，將融合對(duì)轉(zhuǎn)移至含有5μMnododazole、10％FCS的無鈣M2培養(yǎng)基中。在注射hCG后32-34小時(shí)時(shí)，按照下述方法誘導(dǎo)激活。激活后，于37℃5％CO2下，重組合子在含10％FCS的TC199培養(yǎng)基(Gibco)中再培養(yǎng)3小時(shí)。然后將其于37℃在無nocodazole的同一培養(yǎng)基中洗滌3次，每次5分鐘，在轉(zhuǎn)移至臨時(shí)受體母羊之前再培養(yǎng)12-15小時(shí)。(b)“GOAT”(G1/G0激活和轉(zhuǎn)移)在hCG注射后32-34小時(shí)，將單個(gè)細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞接觸。在將胞質(zhì)體/細(xì)胞融合對(duì)轉(zhuǎn)移至融合室(參見下面)中的200μl含0.3M甘露醇、0.1mMMgSO4、0.001mMCaCl2的蒸餾水中。通過施加5秒3V的交流脈沖后，施加3個(gè)80μs的1.25kV/cm直流脈沖，誘導(dǎo)融合和激活。然后融合對(duì)在含有10％FCS、7.5μg/ml細(xì)胞松弛素B的TC199中洗滌，并于37℃5％CO2下在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)。然后融合對(duì)在含10％FCS的TC199中洗滌，并于37℃5％CO2下在含10％FCS的TC199中再培養(yǎng)12-15小時(shí)。(c)“通用受體”去核卵母細(xì)胞在hCG注射后32-34小時(shí)激活(按下述方法)，然后于37℃5％CO2下在含10％FCS的TC199中培養(yǎng)4-6小時(shí)。然后將單個(gè)細(xì)胞與該卵母細(xì)胞接觸，按下述方法誘導(dǎo)融合。然后將融合對(duì)在含有10％FCS、7.5μg/ml細(xì)胞松弛素B的TC199中洗滌，并于37℃5％CO2下在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)。然后融合對(duì)在含10％FCS的TC199中洗滌并于37℃5％CO2下再培養(yǎng)8-11小時(shí)。3.4.融合和激活關(guān)于激活，將卵母細(xì)胞置于兩個(gè)平行電極之間的200μl含0.3M甘露醇、0.1mMMgSO4、0.001mMCaCl2的蒸餾水中(Willadsen，Nature32063-65(1986))。通過施加80μs1.25kV/cm的直流脈沖誘導(dǎo)激活。關(guān)于融合，操作的胚以相似的方式進(jìn)行處理，此外將去核卵母細(xì)胞和該細(xì)胞之間的接觸平面與電極平行布置。通過施加5秒3V的交流脈沖，然后施加3個(gè)80μs1.25kV/cm的直流脈沖誘導(dǎo)融合。3.5.胚的培養(yǎng)和評(píng)價(jià)(所有組)在培養(yǎng)后，將融合的融合對(duì)成雙地包埋在1％和1.2％瓊脂(DIFCO)的PBS中，將其轉(zhuǎn)移至未同步化母羊的結(jié)扎輸卵管中。將融合對(duì)包埋在瓊脂中，以防止或減小受體母羊?qū)υ撆叩拿庖吲懦庾饔?，并有助于將融合?duì)保持在一起。6天后，殺死受體母羊，通過用含10％FCS的PBS沖洗輸卵管回收胚。用2個(gè)針頭從瓊脂解剖出胚，通過顯微鏡進(jìn)行發(fā)育評(píng)價(jià)。盡快將已經(jīng)發(fā)育至桑椹期/胚囊期的所有胚轉(zhuǎn)移至同步化最終受體母羊的子宮角中。體外技術(shù)也適于代替臨時(shí)受體母羊，使該胚發(fā)育至胚囊期。實(shí)施例4牛的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移4.1.體外卵母細(xì)胞的成熟由當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)獲得卵巢，在轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室期間將其保持在28-32℃。用皮下注射針(內(nèi)徑為1.2mm)在直徑為3-10mm的濾泡中吸出丘卵卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC’3)，將其置于無菌塑料通用容器中。將通用容器置于溫室(35℃)中，在倒出四分之三上清液之前，讓濾泡物質(zhì)沉淀10-15分鐘。余下的濾泡材料用等體積添加10％牛血清的解剖培養(yǎng)基(具有Earles鹽(Gibco)的TCM199，75.0mg/l卡那霉素、30.0mMHepes，pH7.4、克分子滲透壓濃度為280mOsmols/KgH2O)稀釋，轉(zhuǎn)移至85mm陪替氏培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下尋找COC’s。選擇具有至少2-3個(gè)致密層的卵丘細(xì)胞的復(fù)合體，在解剖培養(yǎng)基中洗滌3次，轉(zhuǎn)移至成熟培養(yǎng)基(具有Earles鹽(Gibco)的TC培養(yǎng)基199，75mg/l卡那霉素、30.0mMHepes、7.69mMNaHCO3，pH7.8、克分子滲透壓濃度為280mOsmols/KgH2O)中，該培養(yǎng)基添加10％牛血清和1×106粒膜細(xì)胞/ml，于39℃在含5％CO2的空氣中培養(yǎng)在rockingtable上。4.2.卵母細(xì)胞的操作在成熟開始后18小時(shí)，剝下卵丘細(xì)胞的成熟卵母細(xì)胞。然后將剝下的卵母細(xì)胞在含有10％胎牛血清(FCS)的無鈣M2培養(yǎng)基中洗滌，并在37℃下將其保持在該培養(yǎng)基中。為了除去染色體(去核)，于37℃下將(去核)卵母細(xì)胞在含有1.0％FCS、7.5μg.ml細(xì)胞松弛素B(Sigma)和5.0μg/mlHoechst33342(Sigma)的無鈣M2中放置20分鐘。用20μM玻璃吸管，直接從第一極體下面吸出少量胞質(zhì)。通過將吸出的胞質(zhì)部分置于UV光下并檢查中期板的存在以證實(shí)去核。4.3.胚重組按照下面詳細(xì)描述的方法，將去核卵母細(xì)胞用于以下三個(gè)重組方法(a)、(b)和(c)中的每個(gè)方法。(a)“MAGIC”(中期停頓的G1/G0接納胞質(zhì)體MetaphaseArrestedG1/G0AcceptIngCytoplast)去核后，將去核卵母細(xì)胞保持在39℃含10％FCS的無鈣M2中，采用玻璃吸管通過預(yù)先在透明帶中制造的孔轉(zhuǎn)移細(xì)胞，將單個(gè)細(xì)胞與卵母細(xì)胞接觸。然后將胞質(zhì)體/細(xì)胞融合對(duì)轉(zhuǎn)移至融合室中的含0.3M甘露醇的200μl蒸餾水中。將融合對(duì)在電極之間人工排成一排。施加5秒3V的交流脈沖，然后施加3次80μs1.25kV/cm的直流脈沖。然后融合對(duì)于37℃在含10％FCS的無鈣M2中洗滌，在油下，于37℃5％CO2下在同一培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在激活前30分鐘，將融合對(duì)轉(zhuǎn)移至含有5μMnododazole、10％FCS的無鈣M2培養(yǎng)基中。在按照下述方法誘導(dǎo)激活，然后于37℃5％CO2下，重組合子在含10％FCS的TC199培養(yǎng)基中再培養(yǎng)3小時(shí)。然后將其于37℃在無nocodazole的同一培養(yǎng)基中洗滌3次，每次5分鐘，在轉(zhuǎn)移至臨時(shí)受體母羊之前(母羊作為重組胚的臨時(shí)受體，為較為便宜的選擇)再培養(yǎng)12-15小時(shí)。(b)“GOAT”(G1/G0激活和轉(zhuǎn)移)將去核卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到成熟培養(yǎng)基上。在成熟開始后30-42小時(shí)，將單個(gè)細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞接觸。將融合對(duì)轉(zhuǎn)移至融合室(參見下面)中的200μl含0.3M甘露醇、0.1mMMgSO4、0.001mMCaCl2的蒸餾水中。通過施加5秒3V的交流脈沖后，施加3次80μs的1.25kV/cm直流脈沖，誘導(dǎo)融合和激活。然后融合對(duì)在含有10％FCS的TC199中洗滌，并于37℃5％CO2下培養(yǎng)15-20小時(shí)(30hpm組)或4-8小時(shí)(42hpm組)[縮寫“hpm”表示“成熟后小時(shí)數(shù)”]。(c)“通用受體”在成熟開始后30或42小時(shí)時(shí)激活去核卵母細(xì)胞(按下述方法)，然后于37℃5％CO2下含10％FCS的TC199中培養(yǎng)8-10小時(shí)(30hpm組)或4-6小時(shí)(42hpm組)。然后將單個(gè)細(xì)胞與該卵母細(xì)胞接觸，按下述方法誘導(dǎo)融合。然后融合對(duì)于37℃5％CO2下在含有10％FCS的TC199中再培養(yǎng)12-16小時(shí)(30hpm組)或4-6小時(shí)(42hpm組)。4.4.融合和激活關(guān)于激活，將卵母細(xì)胞置于兩個(gè)平行電極之間的200μl含0.3M甘露醇、0.1mMMgSO4、0.001mMCaCl2的蒸餾水中(Willadsen，Nature32063-65(1986))。通過施加80μs1.25kV/cm的1次直流脈沖誘導(dǎo)激活。關(guān)于融合，以相似的方式進(jìn)行處理操作的胚，此外將去核卵母細(xì)胞和該細(xì)胞之間的接觸平面與電極平行布置。通過施加5秒3V的交流脈沖，然后施加3次80μs1.25kV/cm的直流脈沖誘導(dǎo)融合。4.5.胚的培養(yǎng)和評(píng)價(jià)(所有組)在培養(yǎng)后，將融合的融合對(duì)成雙地包埋在1％和1.2％瓊脂，轉(zhuǎn)移至未同步化母羊的結(jié)扎輸卵管中(DIFCO)的PBS中(母羊作為重組胚的臨時(shí)受體為較便宜的選擇)。將融合對(duì)包埋在瓊脂中，以防止或減小受體母羊?qū)υ撆叩拿庖吲懦庾饔?，并有助于將融合?duì)保持在一起。6天后，殺死母羊受體，用含10％FCS的PBS沖洗輸卵管回收胚。用2個(gè)針頭從瓊脂塊中解剖出胚，通過顯微鏡進(jìn)行發(fā)育評(píng)價(jià)。體外技術(shù)也可能適于代替臨時(shí)受體，使該胚發(fā)育至胚囊期。實(shí)施例3(羊細(xì)胞)和實(shí)施例4(牛細(xì)胞)的結(jié)果本技術(shù)已經(jīng)用于羊胚和牛胚兩者的重組。目前，在牛中已經(jīng)獲得胚囊期胚；然而，這些胚尚未轉(zhuǎn)移至最終受體中。在羊中，7只受體母羊受孕，導(dǎo)致5只活羔羊出生(其中2只出生后不久死亡)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于表1-3中。表1表明采用靜止TNT4細(xì)胞群體和3種不同的胞質(zhì)體受體重組的羊胚發(fā)育至胚囊期的結(jié)果。重組胚在臨時(shí)受體母羊的結(jié)扎輸卵管中培養(yǎng)至重組后第7天。結(jié)果以相對(duì)于回收胚總數(shù)的桑椹期/胚囊期胚的百分比表示。表1</tables>表2表明將所有桑椹期/胚囊期重組胚轉(zhuǎn)移至同步化最終受體黑臉母羊的子宮角后誘導(dǎo)妊娠的結(jié)果。該表表明每個(gè)轉(zhuǎn)移組的胚總數(shù)和以母羊和胚為單位的妊娠頻率(在大多數(shù)情況下，每只母羊轉(zhuǎn)移2個(gè)胚)采用“MAGIC”胞質(zhì)體建立了單次雙妊娠。表2表3表明桑椹期胚/胚囊期胚轉(zhuǎn)移至最終受體母羊后產(chǎn)生的妊娠結(jié)果。表3實(shí)施例5采用OME、BLWF1和SEC1細(xì)胞進(jìn)行羊的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移和胚重組已經(jīng)采用命名為OME、BLWF1和SEC1的三個(gè)新細(xì)胞類型進(jìn)行了細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。OME(羊乳腺上皮)細(xì)胞為按照Finch等的方法(Biochem.Soc.Trans.24369S(1996)，由成年6歲的Fin-Dorset母羊的乳腺通過活組織檢查建立的上皮細(xì)胞系。BLWF1(黑威爾士成纖維細(xì)胞)細(xì)胞為在黑威爾士母羊與黑威爾士公羊自然交配后獲得的26天大黑成爾士胎兒解剖和培養(yǎng)獲得的成纖維細(xì)胞細(xì)胞系。分離初級(jí)胎兒成纖維細(xì)胞的方法為按照Robertson，E.J.在TeratocarcinomasandembryonicstemcellApracticalapproach，71-112，IRLPressOxford(1987)中描述的方法。SEC1(羊胚性細(xì)胞)為由超數(shù)排卵和與Pol-Dorset公羊交配的Pol-Dorset母羊獲得的9天大的胚得到的上皮樣細(xì)胞系。由于以下原因，SEC1細(xì)胞不同于共同未決的PCT申請(qǐng)PCT/GB95/02095(以WO96/07732公布)中描述的TNT細(xì)胞。第一，兩個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)學(xué)完全不同，第二，用來分離細(xì)胞系的方法不同。SEC1細(xì)胞系由單個(gè)胚建立，而TNT細(xì)胞系得自多組細(xì)胞。所有細(xì)胞系都進(jìn)行核型分析，表明典型的染色體數(shù)為54(2n)。在用作胚重組的細(xì)胞核供體之前，按前述方法監(jiān)測(cè)在將血清水平降至0.5％后靜止的誘導(dǎo)(Campbell等，Nature38064-66(1996))。按先前實(shí)施例中描述的方法制備重組胚。表4表明由不同細(xì)胞類型重組的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移胚發(fā)育的總結(jié)。該表表明三種細(xì)胞類型中的每種發(fā)育至胚囊期的重組胚數(shù)和受孕數(shù)。所有細(xì)胞系在用于胚重組前都進(jìn)行核型分析。這些細(xì)胞系的典型染色體數(shù)為54。每只同步化最終受體母羊轉(zhuǎn)移1-3個(gè)胚囊期胚。將體外培養(yǎng)的重組胚置于含有10％人血清的10μl(4個(gè)胚)的SOFM(合成輸卵管流體培養(yǎng)基)小滴中，于39℃5％O2、5％CO2和90％N2的潮濕氛圍下培養(yǎng)。每2天將培養(yǎng)的胚轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基中。按照Gardner等，BiologyofReproduction50390-400(1994)和Thompson等，BiologyofReproduction531385-1391(1995)的方法制備SOFM培養(yǎng)基。表5表明于1994年6月24日保持受孕的受體母羊的鑒定、用于胚重組的細(xì)胞類型和預(yù)期的小羊出生日期。通過將1-3個(gè)桑椹期/胚囊期胚(重組后第7天)轉(zhuǎn)移至同步化的最終受體母羊中產(chǎn)生妊娠。重組數(shù)的細(xì)節(jié)示于表4中。縮寫為PD＝Pol-Dorset，BW＝黑威爾士，F(xiàn)D＝Fin-DOrset，*＝體外培養(yǎng)至胚囊期的胚。表4</tables>表5</tables>權(quán)利要求1.重組動(dòng)物胚的方法，該方法包括將靜止供體細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。2.權(quán)利要求1要求保護(hù)的方法，其中該動(dòng)物為有蹄類動(dòng)物。3.權(quán)利要求2中要求保護(hù)的方法，其中該動(dòng)物為母?；蚬?、豬、山羊、羊、駱駝或水牛。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中對(duì)供體細(xì)胞的核進(jìn)行遺傳修飾。5.權(quán)利要求4中要求保護(hù)的方法，其中在胚重組前對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。6.權(quán)利要求5中要求保護(hù)的方法，其中該受體細(xì)胞為卵母細(xì)胞。7.權(quán)利要求6中要求保護(hù)的方法，其中將卵母細(xì)胞去核。8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中該供體細(xì)胞為成體體細(xì)胞。9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中該供體細(xì)胞為胚體細(xì)胞。10.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中該供體細(xì)胞為胎兒體細(xì)胞。11.制備動(dòng)物的方法，該方法包括(a)按任一前述權(quán)利要求要求保護(hù)的方法重組動(dòng)物胚；(b)使動(dòng)物由胚發(fā)育至足月；(c)可選地由如此形成的動(dòng)物進(jìn)行育種。12.權(quán)利要求11中要求保護(hù)的方法，其中在該胚完全發(fā)育之前對(duì)該動(dòng)物胚進(jìn)行進(jìn)一步操作。13.權(quán)利要求12中要求保護(hù)的方法，其中由該胚得到1個(gè)以上的動(dòng)物。14.重組動(dòng)物胚，通過將靜止供體細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中制備的。15.權(quán)利要求14中要求保護(hù)的重組胚，其中該供體細(xì)胞為成體體細(xì)胞。16.權(quán)利要求14中要求保護(hù)的重組胚，其中該供體細(xì)胞為胚體細(xì)胞。17.權(quán)利要求14中要求保護(hù)的重組胚，其中該供體細(xì)胞為胎兒體細(xì)胞。18.用權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法制備的動(dòng)物。19.由權(quán)利要求14-17任一項(xiàng)中要求保護(hù)的重組動(dòng)物胚發(fā)育的動(dòng)物。全文摘要重組動(dòng)物胚的方法涉及將靜止的供體細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。該供體細(xì)胞為靜止的,原因在于使其在G1期退出生長(zhǎng)和分裂周期并停頓于G0狀態(tài)。可以通過細(xì)胞融合進(jìn)行核轉(zhuǎn)移。然后該重組胚可以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)動(dòng)物。本發(fā)明可用于具有高遺傳價(jià)值的轉(zhuǎn)基因以及非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)。文檔編號(hào)A01K67/027GK1202084SQ9619789公開日1998年12月16日申請(qǐng)日期1996年8月30日優(yōu)先權(quán)日1995年8月31日發(fā)明者K·H·S·坎貝爾,I·維慕特申請(qǐng)人:羅斯林學(xué)院(愛丁堡),英國農(nóng)漁業(yè)及食品部,生物技術(shù)及生物科學(xué)研究委員會(huì)