專利名稱：一種核轉(zhuǎn)移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核轉(zhuǎn)移的方法和由此發(fā)育成的胚胎。還包括培養(yǎng)胚胎和重組自本發(fā)明的核轉(zhuǎn)移方法產(chǎn)生的胚胎動物的方法。
背景技術(shù)：
最近許多發(fā)表物闡述了核轉(zhuǎn)移的潛在好處(Galli etal.，1999；Colman，1999；Wells & Powell，2000；Lewis etal.，2001；Trounson，2001)。在過去的二十年里核轉(zhuǎn)移的方法被積極探索和開發(fā)并且在許多參考文獻中有所描述(見，例如，Campbell etal.，Theriogenology，43181(1995)；Collas etal.，Mol.ReportDev.，38264-267(1994)；Keefer etal.，Biol.Reprod.，50935-939(1994)；Simsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，906143-6147(1993)；WO97/07668；WO97/07669；WO94/26884；WO94/24274；和美國專利申請第4,944,384和5,057,420號(描述了牛的核移植)，在此將所有這些以其全部引入作為參考。
簡言之，核轉(zhuǎn)移的方法一般包括以下步驟(1)去除卵母細胞核；(2)分離要與去核的卵母細胞結(jié)合的供體細胞或細胞核；(3)將細胞或細胞核插入去核的卵母細胞中以形成重組細胞；(4)將重組細胞植入動物子宮以形成胚胎；和(5)胚胎發(fā)育。
盡管可以從活體動物的或者輸卵管和/或者卵巢分離卵母細胞，但本發(fā)明卵母細胞一般從死亡動物上獲得。在去核前一般使卵母細胞在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種培養(yǎng)基中成熟。去除卵母細胞核可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的許多方式進行。
通常在融合前經(jīng)供體細胞微注射于透明帶下將供體細胞或細胞核插入去核的卵母細胞中以形成重組細胞。誘導融合可通過使用經(jīng)過接觸/融合平面的直流(DC)電脈沖(電融合)，將細胞暴露于促融合的化學物質(zhì)，如聚乙二醇，或者用滅活的病毒，如仙臺病毒。
一般在將核供體和受體卵母細胞融合之前，融合時，和/或融合之后使用電和/或非電方式將重組細胞激活。激活方法包括電脈沖，化學誘導的休克，精子穿透，增加卵母細胞內(nèi)二價陽離子水平，和降低卵母細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化(如通過激酶抑制劑)。激活的重組細胞，或胚胎一般用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移至動物的子宮。
直至最近，幾乎全部從原始生殖細胞或胚胎細胞常規(guī)分離供體細胞核。真正地，直至20世紀90年代仍廣泛相信在核轉(zhuǎn)移后只有胚胎的或未分化的細胞類型能夠指導任何類型的胚胎發(fā)育。結(jié)果大多數(shù)現(xiàn)在用于核轉(zhuǎn)移操作的技術(shù)是利用胚胎細胞作為供體細胞和去核的卵母細胞作為受體細胞進行的。
盡管，分離和使用胚胎供體細胞需要特殊技術(shù)并且是非常細致的工作。但更重要的是，胚胎供體細胞是用于核轉(zhuǎn)移方法的有限遺傳物質(zhì)資源并且其在體外操作以產(chǎn)生基因組被處理的(例如，轉(zhuǎn)基因的)細胞，胚胎，和動物是不可能的。
1997年報道的用培養(yǎng)的細胞系作為供體(見，例如Wilmut etal.，Nature(London)385，810-183(1997))進行了成功的核轉(zhuǎn)移使這種狀態(tài)改變了。從而隨著體細胞核轉(zhuǎn)移的問世傳統(tǒng)胚胎細胞核轉(zhuǎn)移的一些問題被解決。特別是，克服了遺傳物質(zhì)的有限資源。然而，由于不是胚胎細胞核轉(zhuǎn)移的所有技術(shù)都能適用于體細胞核轉(zhuǎn)移所以一些問題仍然存在。例如，由于體細胞與胚胎細胞相比大小的巨大差異使傳統(tǒng)使用的某些技術(shù)不再適用。
實際上，上面描述方法的體外步驟效率低導致低受孕，低產(chǎn)率，生后死亡和發(fā)育異常。用Wilmut等描述的方法(Wilmut etal.，Nature(London)385，810-183(1997))體細胞核轉(zhuǎn)移的活產(chǎn)率估計大約是三百分之一，即，核轉(zhuǎn)移效率充其量是0.4％(即克隆的小羊數(shù)除以用于生產(chǎn)這些數(shù)目克隆羊的核轉(zhuǎn)移數(shù))。更重要的是，文獻中描述的所有方法需要有高度經(jīng)驗的技術(shù)人員和昂貴的設(shè)備。為使核轉(zhuǎn)移方法廣泛實際應用成為更加商業(yè)化，迫切需要提高克隆效率，降低與方法相關(guān)的費用和克服對高度經(jīng)驗技術(shù)人員的需要。
因此，盡管表面上建立了用于體細胞核轉(zhuǎn)移的許多方法，但是仍然存在某些主要技術(shù)困難妨礙了這些方法的廣泛實際應用。
因企圖改善克隆效率許多研究小組已經(jīng)改良了核轉(zhuǎn)移技術(shù)；但是，這些改良仍需要昂貴的設(shè)備和/或技術(shù)好的工作人員。例如，上面列出的核轉(zhuǎn)移方法中重要的步驟是步驟3將供體細胞或細胞核插入去核的卵母細胞一步。如上面所討論的，這步一般需要兩個過程，首先，將供體細胞微注射于去核的卵母細胞透明帶下和然后，融合。但是，由于需要專業(yè)的技術(shù)和設(shè)備使微注射步驟妨礙了核轉(zhuǎn)移的商業(yè)化希望。
避免使用以前用在卵母細胞和胚胎供體細胞的較傳統(tǒng)方法中的微注射的技術(shù)包括去除透明帶。參見，例如，WO98/29532和Peura et al.(1998)，在此將兩者引入作為參考。不幸的是，通常認為完整的透明帶在體細胞核轉(zhuǎn)移中是重要的，原因包括幾點(1)保持極體與卵母細胞的中期板靠近以顯示合適的去核位點，(2)保持供體細胞與卵母細胞胞質(zhì)體在融合前和融合時靠近，(3)供融合期間配對保護，和(4)支持重組和激活后的胚胎發(fā)育。因此，Peura等出處同上的技術(shù)未能成功用于體細胞。
在核轉(zhuǎn)移期間透明帶的存在意味著需要復雜的微操作工具和高技術(shù)水平。為避開透明帶使用微操作儀來將供體細胞轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞的卵周隙以產(chǎn)生重組細胞。
微操作儀是特殊設(shè)備其需要工具制造裝置包括毛細牽拉器(capillarypullers)，研磨器和顯微拉制儀(microforge)。更重要的是，微操作儀的使用和制造微操作儀裝置需要專業(yè)的技術(shù)人員。這些需要相當大地限制了核轉(zhuǎn)移方法大規(guī)模應用所需的簡單化。
基于前述，可以看到體細胞核轉(zhuǎn)移方法的好處和前景是很可觀的其提供使用保持產(chǎn)生能發(fā)育成活體動物的重組細胞能力的供體細胞并且提供高克隆效率而不需要微操作儀。直接的結(jié)果將包括降低儀器和人員的開支，和將因此導致克隆動物生產(chǎn)的更有效的成本花費。
最后，申請者目前已經(jīng)開發(fā)的體細胞核轉(zhuǎn)移方法其避免微操作儀的使用，因此允許使用標準融合技術(shù)，而維持或提高克隆效率。在一個實施方案中，使用無透明帶，去核的卵母細胞作為受體和體細胞或核作為供體。為避免計劃外的胚胎聚集，或者單獨或者以二或三個重組的核轉(zhuǎn)移胚胎為“聚集體”，將重組的無透明帶胚胎在特殊系統(tǒng)中培養(yǎng)，因為傳統(tǒng)的系統(tǒng)是不合適的該目的的。
發(fā)明概述本發(fā)明最廣義的方面提供生產(chǎn)克隆的哺乳動物細胞的一種新的和改進的方法。
因此，本發(fā)明第一方面提供核轉(zhuǎn)移方法其包括轉(zhuǎn)移體細胞或體細胞核至無透明帶的去核卵母細胞的步驟。
本發(fā)明第二方面提供生產(chǎn)基因工程的或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物的方法，其通過轉(zhuǎn)移體細胞或細胞核至無透明帶的去核卵母細胞前在體細胞或細胞核中將目的基因插入，去除或修飾。
本發(fā)明進一步提供生產(chǎn)基因工程的或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物的方法其包括(i)在體細胞或細胞核內(nèi)插入，去除或修飾一個或多個目的基因；(ii)在適合形成重組細胞的條件下將體細胞或細胞核插入無透明帶的去核卵母細胞中；(iii)激活重組細胞以形成胚胎；(iv)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細胞發(fā)育階段；和(v)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物因此胚胎發(fā)育成轉(zhuǎn)基因胎兒。
第三方面，本發(fā)明提供克隆哺乳動物的方法其包括(i)在適合形成重組細胞的條件下將目的體細胞或細胞核插入無透明帶的去核哺乳動物卵母細胞中；(ii)激活重組細胞以形成胚胎；(iii)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細胞發(fā)育階段；(iv)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物因此胚胎發(fā)育成胎兒。
本發(fā)明也提供按照上述方法獲得的哺乳動物和它們的后代。
可以用已知方法從任何哺乳動物分離卵母細胞。例如，通過本領(lǐng)域熟知的和在此描述的輸卵管回收方法或經(jīng)陰道的卵母細胞回收方法可以從活體動物的或者輸卵管和/或卵巢分離卵母細胞。而且，可以從死亡動物分離卵母細胞。例如，可以從屠宰場獲得卵巢并從這些卵巢中吸出卵母細胞。也可以從剛剛處死的動物卵巢分離卵母細胞或者當卵巢已被冰凍和/或溶解時。優(yōu)選地，從輸卵管新鮮分離卵母細胞。
使用前也可以將卵母細胞或胞質(zhì)體冷藏(cryopreserve)。
盡管這里描述的方法對任何哺乳動物的核轉(zhuǎn)移都是有用的，但是對有蹄動物尤其有用。優(yōu)選地，有蹄動物選自家養(yǎng)的或野生的牛科(bovids)，羊科(ovids)，鹿科，豬科，馬科和駱駝科的代表。這些代表的例子是母?；蚬?，野牛，水牛(buffalo)，綿羊，大角綿羊(big-horn sheep)，馬，小馬，驢，騾，鹿，麋鹿，馴鹿(caribou)，山羊，印度水牛(water buffalo)，駱駝，美洲駝(llama)，羊駝(alpaca)，或豬。在?？茖僦杏绕鋬?yōu)選的是Bos taurus，Bosindicus和Bos水母牛(buffaloes cows)或公牛。
可以用任何已知方法完成透明帶的去除。優(yōu)選地，去除透明帶的步驟選自物理操作，化學處理和酶消化過程。更優(yōu)選地，通過酶消化去除透明帶。優(yōu)選地，用于消化透明帶的酶是蛋白酶，鏈霉蛋白酶或它們的聯(lián)合使用。更優(yōu)選地，酶是鏈霉蛋白酶。
優(yōu)選地，使用的鏈霉蛋白酶濃度在0.1-5％。更優(yōu)選地，濃度在0.25-2％。最優(yōu)選地，鏈霉蛋白酶的濃度大約在0.5％。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應當理解可以使用任何去除卵母細胞核的方法，包括抽吸(aspriation)，物理去除，使用DNA特異的熒光染料，和紫外線照射。優(yōu)選地，使用物理方法去核。更優(yōu)選地，物理方法是二等分(bisection)。
體細胞選自包括上皮細胞，神經(jīng)細胞，表皮細胞，角質(zhì)細胞，造血細胞，黑素細胞，軟骨細胞，淋巴細胞(B和T淋巴細胞)，紅細胞，巨噬細胞，單核細胞(monocytes)，單核的細胞(mononuclear cells)，成纖維細胞，心肌細胞，和其它肌細胞。
這些可從不同器官獲得，例如，皮膚，肺臟，胰腺，肝臟，胃，腸，心臟，生殖器官，膀胱，腎臟，尿道和其它泌尿器官(urinary organ cells)，等等。
優(yōu)選地，體細胞是成纖維細胞或顆粒細胞。最優(yōu)選地，體細胞是體外培養(yǎng)的成纖維細胞或顆粒細胞。
優(yōu)選地，通過融合進行體細胞或體細胞核的轉(zhuǎn)移。更優(yōu)選地，融合的方法選自化學融合，電融合或生物融合。優(yōu)選地，化學融合或生物融合(biofusion)通過將無透明帶，去核的卵母細胞與體細胞一同暴露于融合試劑。優(yōu)選地，融合試劑是當將體細胞供體與無透明帶，去核的卵母細胞受體比鄰放置時能增加不同細胞質(zhì)膜部分融合概率的任何化合物或生物有機物。最優(yōu)選地，融合試劑選自聚乙二醇(PEG)，胰蛋白酶，二甲基亞砜(DMSO)，植物凝集素(lectins)，凝集素(agglutinin)，病毒，或仙臺病毒。
電融合優(yōu)選使用通過接觸/融合平面的電脈沖來誘導。更優(yōu)選地，電融合包括向無透明帶，去核的卵母細胞與體細胞組合發(fā)放一次或多次電脈沖的步驟。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法包括將重組細胞與一個或多個卵母細胞融合以進一步增加重組細胞細胞質(zhì)體積的步驟。
因此，本發(fā)明第四方面提供克隆哺乳動物的方法其包括(i)在適合形成重組細胞的條件下向第一個無透明帶，去核的哺乳動物卵母細胞中插入目的體細胞或細胞核；(ii)將第二個卵母細胞與該重組細胞融合因而增加了細胞質(zhì)體積；(iii)激活重組細胞以形成胚胎；(iv)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細胞發(fā)育階段；和(v)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物因此胚胎發(fā)育成胎兒。
步驟(i)和(ii)可以單獨或同時進行。
或者，在一個優(yōu)選實施方案中，提供培養(yǎng)重組細胞(胚胎)的方法其包括(i)在適合形成重組細胞的條件下向無透明帶，去核的哺乳動物卵母細胞中插入目的體細胞或細胞核；(ii)激活重組細胞；(iii)保溫和培養(yǎng)一個或多個該細胞直至胚胎大于二細胞發(fā)育階段。
優(yōu)選地，將胚胎培養(yǎng)至大于60個細胞。更優(yōu)選地，在60至200個細胞之間。
優(yōu)選地，將二或多個細胞共同培養(yǎng)。更優(yōu)選地，將二或三個細胞共同培養(yǎng)。
在可選的實施方案中，將單個重組細胞培養(yǎng)至產(chǎn)生8至128個細胞的胚胎然后將二或多個胚胎組合并共同培養(yǎng)成聚集體。
以聚集體培養(yǎng)無透明帶的核轉(zhuǎn)移胚胎增加了要轉(zhuǎn)移的最終胚胎細胞數(shù)并增加了受孕率。
本發(fā)明也提供按照上面方法獲得的哺乳動物和這些哺乳動物的后代。
附圖簡述


圖1表示按照本發(fā)明優(yōu)選方法的結(jié)果。提供無透明帶卵母細胞-體細胞轉(zhuǎn)移的方法和結(jié)果。圖A表示二等分前在培養(yǎng)皿里排列的卵母細胞。圖B表示人工二等分卵母細胞以產(chǎn)生去核的卵母細胞(胞質(zhì)體)和核體。圖C表示接觸前的去核卵母細胞和體細胞。圖D表示接觸后，融合前的去核卵母細胞-體細胞。圖E表示去核卵母細胞-體細胞對沿著進行第一次融合的電融合線排列。圖F表示未融合的去核卵母細胞和融合的去核卵母細胞-體細胞對沿著進行第二次融合的電融合線排列。圖G表示融合后在GO系統(tǒng)中發(fā)育7天的胚泡。圖H表示離開GO系統(tǒng)后的同一胚泡。
發(fā)明詳述除非有其它說明，本發(fā)明的實施使用本領(lǐng)域中的傳統(tǒng)分子生物學，細胞生物學，和克隆技術(shù)。這些技術(shù)是技術(shù)人員熟知的，并在文獻中有詳細解釋。見，例如，Sambrook and Russell″Molecular CloningA LaboratoryManual″(2001)；CloningA Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)；″AntibodiesA Laboratory Manual″(Harlow & Lane，eds.，1988)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1986)；″Immobilised Cells andEnzymes″(IRL Press，1986)。
在描述本方法之前，應當明確本發(fā)明不局限于描述的具體材料和方法，因為這些可以改變。也應理解這里使用的命名法僅僅以描述具體實施方案為目的，并未打算限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只由附加的權(quán)利要求書限制。必須指出如這里和附加的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一”和“這”如無上下文明確提示則包括復數(shù)關(guān)聯(lián)。因此，例如，“體細胞”的關(guān)聯(lián)包括這些細胞的復數(shù)形式，“卵母細胞”的關(guān)聯(lián)是指對一個或多個卵母細胞的關(guān)聯(lián)，等等。除了另外定義，這里使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所一般理解的意義相同。盡管任何與這里描述的相似或相當?shù)牟牧虾头椒杀挥糜趯嵺`或試驗本發(fā)明，優(yōu)選的材料和方法是這里所描述的。
為了描述和公開文獻中報道的方法，試劑和載體引用這里提及的所有發(fā)表物，而且這些方法，試劑和載體可能做和本發(fā)明相關(guān)的使用。這里的一切不應被理解為許可由于以前發(fā)明的此前這樣的公開而不命名本發(fā)明。
本發(fā)明提供用核轉(zhuǎn)移或核移植克隆哺乳動物的改良方法。在所屬的申請中，短語“核轉(zhuǎn)移”或者“核移植”替換使用；但是這里使用的這些短語指全部互補的核DNA從一個細胞導入另一個去核的細胞。
在優(yōu)選的方法中第一步包括從合適動物分離受體卵母細胞。在這點上，卵母細胞可以取自任何動物來源和任何成熟階段。
合適的哺乳動物來源包括以下目成員靈長目，嚙齒目，兔形目(Lagomorpha)，鯨目(Cetacea)，食肉目(Camivora)，奇蹄目(Perissodactyla)和偶蹄目(Artiodactyla)。由于它們相似的生物學和經(jīng)濟的重要性尤其優(yōu)選奇蹄動物和偶蹄動物目的成員。
例如，偶蹄動物包括大約150種生物種屬其分為9個家族豬(豬科)，野豬(peccaries)(Tayassuidae)，河馬(河馬科(Hippopotamidae))，駱駝(駱駝科)，麋香鹿(Chevrotains)(鼷鹿科(Tragulidae))，長頸鹿和霍加皮(Okapi)(長頸鹿科)，鹿(鹿科)，叉角羚(Pronghorn)(Antilocapridae)，和家養(yǎng)牲畜，綿羊，山羊和羚羊(牛科)。在許多國家很多這些動物被作為飼養(yǎng)動物。更重要的是，就本發(fā)明而言，許多很經(jīng)濟重要的動物如山羊，綿羊，牛和豬有相似的生物學性質(zhì)并且有高度的基因同源性。
奇蹄目包括馬和驢，其都是很經(jīng)濟重要的動物并且相似。實際上，馬和驢的雜交繁育為人熟知。
在一個實施方案中，可以從有蹄動物獲得卵母細胞，具體地，牛科，羊科，鹿科，豬科，馬科，和駱駝科。這些代表的例子是母牛或公牛，野牛，水牛，綿羊，大角綿羊，馬，小馬，驢，騾，鹿，麋鹿，馴鹿，山羊，水牛，駱駝，美洲駝，羊駝，和豬。在?？茖僦杏绕鋬?yōu)選的是Bos taurus，Bosindicus和Bos水母?；蚬?。
分離卵母細胞的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已熟知。例如，通過本領(lǐng)域熟知的輸卵管回收方法或經(jīng)陰道的卵母細胞回收方法可以從活體動物的或者輸卵管和/或卵巢分離卵母細胞。見，例如，Pieterse etal.，1988，″Aspiration of bovineoocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries，″Theriogenology30751-762。而且，可以從死亡動物的卵巢或輸卵管分離卵母細胞。例如，可以從屠宰場獲得卵巢并從這些卵巢中吸出卵母細胞。也可以從剛剛處死的動物卵巢分離卵母細胞或者當卵巢已被冰凍和/或溶解時分離卵母細胞。
簡言之，在一優(yōu)選實施方案中，用抽吸法從哺乳動物卵巢中收集未成熟(前期I)的卵母細胞。為使諸如基因工程，核轉(zhuǎn)移和克隆等技術(shù)成功應用，一旦這些卵母細胞被收集就必須在其被用作核轉(zhuǎn)移受體細胞之前將其在體外培養(yǎng)成熟。
已經(jīng)有報道在去核和核轉(zhuǎn)移時卵母細胞的成熟階段對核轉(zhuǎn)移方法的成功是非常重要的。(見，例如Prather etal.，Differentiation，48，1-8，1991)。總而言之，成功的哺乳動物胚胎克隆方法使用中期II卵母細胞作為受體卵母細胞，因為認為在此階段卵母細胞可以被或是充分激活以接納導入的細胞核如同接納受精的精子。
卵母細胞的體外成熟通常發(fā)生在成熟培養(yǎng)基中直至卵母細胞已經(jīng)排出第一個極體，或直至卵母細胞已經(jīng)達到中期II。家養(yǎng)動物，尤其是牛，卵母細胞成熟期一般在抽吸后大約16-52小時，優(yōu)選大約28-42小時，更優(yōu)選大約18-24小時。為了本發(fā)明的目的，將此時間段稱作“成熟期”。
可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的多種方法和多種培養(yǎng)基使卵母細胞成熟。見，例如，對牛類見U.S.Pat.No.5,057,420；Saito et al.，1992，Roux′sArch.Dev.Biol，201134-141；和對羊類見Wells et al.1997，Biol.Repr.，57385-393和WO97/07668，題為″Unactivated Oocytes as CytoplastRecipients for Nuclear Transfer，″，將所有這些以其全文引入以作參考，包括所有數(shù)字，表格和圖。
用作卵母細胞收集和成熟的最普通培養(yǎng)基之一是組織培養(yǎng)基-199(TCM-199)，并添加1-20％血清包括胎牛血清(FCS)，新生血清，動情期或非動情期母牛血清，小羊血清或食用牛血清。
本申請的實施例1顯示了優(yōu)選的維持培養(yǎng)基的一個例子有Earl鹽的TCM-199添加15％母牛血清并且包括10IU/ml的孕馬(Mare)血清促性腺激素和5IU/ml人絨毛膜促性腺激素(SuigonanRVet，Intervet，Australia)。在5％CO2，39℃環(huán)境中用此類培養(yǎng)基可以成功地使卵母細胞成熟。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應該理解新鮮分離的和成熟的卵母細胞是優(yōu)選的，也應理解在將卵母細胞收集或成熟后冷藏是可能的。因此，這里使用的短語“冷藏”指將本發(fā)明的卵母細胞，胞質(zhì)體，細胞，胚胎，或動物冷凍。本發(fā)明的卵母細胞，胞質(zhì)體，細胞，胚胎，或動物的某些部分冷凍于優(yōu)選低于0℃，更優(yōu)選低于-80℃，和最優(yōu)選低于-196℃。可以將本發(fā)明的卵母細胞，細胞，胚胎冷藏保存無限長時間。眾所周知生物物質(zhì)可以冷藏50年以上。例如，可以將冷藏50年以上的精液用于母牛的人工授精。冷藏的方法和工具是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。見，例如，U.S.Pat.No.5,160,312，題為“Cryopreservation Process for Direct Transfer of Embryos.”。
如果使用冷藏的卵母細胞，那么必須在將卵母細胞放入成熟培養(yǎng)基中之前將其初步溶解。溶解冷藏物質(zhì)以使其在溶解過程后激活的方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的。
在更進一步的優(yōu)選實施方案中，在這里公開的核轉(zhuǎn)移方法中收集并使用已經(jīng)在體內(nèi)成熟的成熟(中期II)卵母細胞。基本上，在進入動情期或者注射人絨毛膜促性腺激素(hcG)或相似激素后35-48小時從未排卵或排卵的哺乳動物手術(shù)收集成熟的中期II卵母細胞。
可以在體外培養(yǎng)卵母細胞處將可能已經(jīng)積聚的卵丘細胞去除以提供對去核而言成熟階段更合適的卵母細胞。例如，可以在存在0.5％透明質(zhì)酸酶的情況下，通過吸管吸取或渦旋將卵丘細胞去除。
在如上描述的成熟階段之后可以將透明帶從卵母細胞上去除；但是，在一個具體的優(yōu)選實施方案中，去除透明帶之前，將卵母細胞放于含200μg/ml植物凝血素(PHA)的磷酸鹽緩沖液中使極體(PB)附著于卵母細胞。已有報道顯示90％以上的情況是含有中期板的染色體鄰近PB(Peura et al，1998)。在透明帶去除和卵母細胞二等分之后，可以容易地鑒別出并棄去核體(karyplast)(含有細胞核的半個卵母細胞)。
去除透明帶的優(yōu)點包括提供更簡單，更快和更廉價的核轉(zhuǎn)移方法。此外，透明帶的去除允許核轉(zhuǎn)移胚胎的大規(guī)模生產(chǎn)。從卵母細胞上去除透明帶可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法完成，包括物理操作(機械打開)，化學處理或酶消化(Wells andPowell，2000)。物理操作可包括使用超微吸管或顯微外科刀片。優(yōu)選地，使用酶消化。
在一個具體優(yōu)選的實施方案中，透明帶在存在蛋白酶或鏈霉蛋白酶的情況下被去除。簡言之，將成熟的卵母細胞放于含有蛋白酶，鏈霉蛋白酶或兩者都有的溶液中，每種酶終濃度為0.1％-0.5％，更優(yōu)選0.25％-2％且最優(yōu)選約0.5％。然后允許將成熟的卵母細胞在30℃至約45℃，優(yōu)選大約39℃保溫1到30分鐘。優(yōu)選地將卵母細胞暴露于酶約5分鐘。盡管鏈霉蛋白酶對卵母細胞膜可能有害，但是這種作用可通過加入血清如FCS或母牛血清而降至最低。用鏈霉蛋白酶去除透明帶的唯一優(yōu)點是不需單個處理，可以將成百的卵母細胞一同進行此步驟。一旦透明帶被去除可以將無透明帶的成熟卵母細胞在4ml Hepes緩沖的添加了20％FCS和10μg/ml細胞松弛素B的TCM-199培養(yǎng)基中洗滌，然后去核。
在這里將短語“去核”，“去核的”和“去核的卵母細胞”替換使用，并且是指已有部分內(nèi)含物被去掉的卵母細胞。
可以通過實際去除細胞核，前核或中期板(根據(jù)卵母細胞情況)物理性地完成卵母細胞的去核，或者功能性地去核，例如通過使用紫外線或其它去核因素。所有這些方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的。例如，物理方法包括抽吸(Smith & Wilmut，Biol.Reprod.，401027-1035(1989))，功能性方法包括使用DNA-特異的熒光染料(見，例如Tusnoda etal.，J.Reprod.Fertil.82173(1988))，和紫外線照射(見，例如Gurdon，Q.J.Microsc.Soc.，101299-311(1960))。也可以用其它本領(lǐng)域已知的方法去核。見，例如U.S.Pat.No.4,994,384；U.S.Pat.No.5,057,420；and Willadsen，1986，Nature 32063-65，這里將所有這些引入以作參考。
優(yōu)選地，通過人工二等分將卵母細胞去核。可以用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法完成卵母細胞二等分。在一個優(yōu)選的實施方案中，如WO98/29532描述的使用顯微外科刀片完成二等分，在此將其引入作為參考。簡言之，用非常鋒利的splitting刀片(AB Technology，Pullman，WA，USA)將卵母細胞不對稱分成大約30％和70％總卵母細胞體積的部分。然后可以將卵母細胞篩查以鑒定出成功去核者。篩查可以通過選擇那些被分成半個并附著有極體者或者用1μg/μl溶解于添加20％FCS的TCM-199中的Hoechst熒光染料33342將卵母細胞染色，然后在倒置顯微鏡下于紫外光下觀察，此觀察要短于10秒。然后將成功去核的卵母細胞(半(demi)-卵母細胞)放于合適的培養(yǎng)基中，例如，添加了20％FCS的TCM-199。
在本發(fā)明中，優(yōu)選將受體卵母細胞從體外成熟后10小時到約40小時的時間范圍內(nèi)去核，更優(yōu)選從體外成熟后16小時到約24小時，且最優(yōu)選體外成熟后約16-20小時。
這里描述的二等分技術(shù)比其它去核方法需要更少的時間和技術(shù)并且隨后用染色篩選有高度精確性。因而，為克隆技術(shù)的大規(guī)模應用，本二等分技術(shù)比其它技術(shù)更有效。
然后可以通過融合將源自與去核卵母細胞相同種屬的單個哺乳動物體細胞轉(zhuǎn)移入去核的卵母細胞以產(chǎn)生重組細胞。
這里使用的短語“體細胞”意思是除了胚胎細胞或生殖細胞以外，任何發(fā)育階段動物的任何細胞。
按照本發(fā)明，將源于已分化的胎兒或成年體細胞的細胞核轉(zhuǎn)移入與核供體相同種屬的無透明帶，去核的卵母細胞。分化的體細胞是早期胚胎階段之后的細胞。更具體地，分化的細胞是至少過了胚盤階段(牛胚胎發(fā)育10天)的細胞。分化的細胞可以來源于外胚層，中胚層和內(nèi)胚層。
可以用熟知的方法獲得哺乳動物體細胞。見，例如，講述了從分化的供體體細胞向去核卵母細胞的核轉(zhuǎn)移的U.S.Pat.No.5,945,577，和講述了在核轉(zhuǎn)移過程中使用源于成年耳道的培養(yǎng)的成纖維細胞作為核供體的U.S.Pat.No.6,022,197，在此將這兩篇文獻引入以作參考。
優(yōu)選在融合于無透明帶去核的受體卵母細胞之前將本發(fā)明的供體體細胞誘導至休眠。按照轉(zhuǎn)讓給Roslin Institute(Edinburgh)的PCT/GB96/02099和WO97/07668所述，優(yōu)選在轉(zhuǎn)移時供體細胞核處于細胞周期的或者G0期或者G1期。為了維持重組細胞的正確倍體數(shù)在轉(zhuǎn)移時供體必須是二倍體。
在本發(fā)明中有用的哺乳動物體細胞包括，例如，上皮細胞，神經(jīng)細胞，表皮細胞，角質(zhì)細胞，造血細胞，黑素細胞，軟骨細胞，淋巴細胞(B和T淋巴細胞)，紅細胞，巨噬細胞，單核細胞，單核的細胞，成纖維細胞，心肌細胞，和其它肌細胞，等等。
而且，用于核轉(zhuǎn)移的哺乳動物細胞可從不同器官獲得，例如，皮膚，肺臟，胰腺，肝臟，胃，腸，心臟，生殖器官，膀胱，腎臟，尿道和其它泌尿器官，等等。這些僅僅是合適的供體細胞的例子。合適的供體細胞，即，在本發(fā)明中有用的細胞可以從身體的任何細胞或器官獲得。
一個具體的優(yōu)選供體細胞是成纖維細胞或成纖維樣細胞。成纖維細胞是理想的細胞類型因為其可從發(fā)育中的胎兒和成年動物大量獲得。
重要的是，這些細胞有快的倍增時間在體外容易繁殖，并且用在基因靶向方法時可以克隆繁殖。
可以從耳部皮膚標本收集成纖維細胞，并剪成小塊(3mm2)培養(yǎng)。本領(lǐng)域有許多方法培養(yǎng)細胞。見，例如Culture of Animal Cells；A manual of BasicTechnique(2nd.edition)，F(xiàn)reshney，copyright 1987，Alan R.Liss，Inc.，New York.在一具體的優(yōu)選實施方案中將從皮膚標本移植出的細胞培養(yǎng)在添加了20％FCS和抗生素的TCM-199培養(yǎng)基中，保持37℃，5％CO2和95％空氣的濕潤氣體。培養(yǎng)一周后，在組織移植物周圍形成成纖維細胞單層。然后去除移植物開始重新培養(yǎng)并用0.05％胰蛋白酶保溫5分鐘收獲成纖維細胞。然后加入800μl的TCM199培養(yǎng)基和20％FCS滅活胰蛋白酶。為長期貯存，可以將培養(yǎng)的細胞在胰蛋白酶處理后收集，凍于10％二甲基亞砜并貯存于液氮中。用作核轉(zhuǎn)移時，將細胞融化并培養(yǎng)至匯合時傳代。每代細胞(估計每代2次細胞倍增)培養(yǎng)至匯合，用0.1％(w/v)胰蛋白酶和EDTA溶液在37℃保溫1分鐘使之解聚，并分至三個新培養(yǎng)瓶作進一步傳代。一般每代持續(xù)約6天。
可以用直接抗細胞骨架纖維波形蛋白(filaments vimentin)(針對成纖維細胞)或角質(zhì)蛋白(針對上皮細胞)的單克隆抗體進行免疫細胞化學染色確認供體細胞的成纖維細胞表型。在優(yōu)選的確認方案中，細胞生長至匯合。然后將細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并用甲醇4℃固定20分鐘。固定后將細胞用PBS洗滌并用溶解于PBS的3％牛血清白蛋白于37℃封閉15分鐘。棄去封閉液并加入100μl或者1∶40稀釋的抗波形蛋白克隆V9(Sigma，cat#；6630)或者1∶40稀釋的抗pan角質(zhì)蛋白克隆11(Sigma，cat#；2931)。將細胞于37℃保溫1小時，用PBS洗滌并用1∶300稀釋的FITC標記的抗小鼠IgG100μl保溫1小時。將細胞用PBS洗滌，用50％甘油PBS封片并在熒光顯微鏡下觀察。應當包括合適的自發(fā)熒光和二抗對照。
可以用Kubota etal.，PNAS 97990-995(2000)描述的進行細胞周期的分析。簡言之，將不同代數(shù)的細胞培養(yǎng)至匯合。胰蛋白酶消化后，將細胞用加有10％FCS的TCM-199培養(yǎng)基洗滌并在4℃用1ml含有葡萄糖(6.1mM)的PBS重懸成5×105細胞/ml。加入3ml冰冷的甲醇將細胞固定過夜。為細胞核染色，然后將細胞沉淀，用PBS洗滌并重懸于含有30g/ml碘化丙啶和0.3mg/ml RNase A的PBS中。在用30μm濾網(wǎng)過濾前允許細胞室溫下黑暗中保溫1小時。然后分析細胞。
為檢測不同代數(shù)培養(yǎng)的供體體細胞的倍體數(shù)，可以用標準的中期spread制備技術(shù)培養(yǎng)在不同培養(yǎng)代數(shù)時判定染色體數(shù)目(見，例如，Kubota etal.，PNAS 97990-995(2000))。
培養(yǎng)的供體細胞也可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的轉(zhuǎn)基因方法進行遺傳修飾。見，例如，Molecular Cloning a Laboratory Manual，2nd Ed.，1989，Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press；U.S.Pat.No.5,612,205；U.S.Pat.No.5,633,067；EPO 264 166，題為″TransgenicAnimals Secreting Desired Proteins IntoMilk″；WO94/19935，題為″Isolation ofComponents of Interest From Milk″；WO93/22432，題為″Method forIdentifying Transgenic Pre-implantation Embryos″；和WO95/175085，題為″Transgenic Production of Antibodies in Milk，″將所有這些以其全部包括數(shù)字，圖和表在此引入以作參考。任何已知的插入，刪除或修改哺乳動物細胞目的基因的方法可以被用于改變用作核供體的已分化細胞。這些方法可以去除某基因的全部或部分，并且此基因可以是異源的。包括同源重組技術(shù)其允許在細胞基因組的一個或多個特定位點插入，刪除或修飾一個或多個基因。
用刪除，插入，和/或突變修飾靶DNA基因組的例子是逆轉(zhuǎn)錄病毒插入，人工染色體技術(shù)，基因插入，用組織特異啟動子的隨機插入，基因靶向，轉(zhuǎn)座元件和/或任何其它導入外源DNA或產(chǎn)生修飾的DNA/修飾的細胞核DNA的方法。其它修飾技術(shù)包括從基因組刪除DNA序列和/或修飾細胞核DNA序列。例如，可以直接定位突變改變細胞核DNA序列。
因此可以用本發(fā)明提供有目的基因表型的成年哺乳動物。繁殖有證實的基因優(yōu)勢或其它目的特征的成年有蹄動物是非常有用的，包括轉(zhuǎn)基因的或基因工程的動物，和嵌合體動物。而且，核轉(zhuǎn)移胎兒的細胞和組織，包括轉(zhuǎn)基因的和/或嵌合體胎兒，可被用于細胞，組織和器官移植。
生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因細胞的方法一般包括以下步驟(1)制備合適的DNA構(gòu)建體其對將特異的DNA插入細胞核基因組是有用的；(2)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞；(3)允許隨機插入和/或同源重組發(fā)生。此過程導致的修飾可以是合適的DNA構(gòu)建體插入靶基因組；從靶基因組刪除DNA；和/或靶基因組突變。
DNA構(gòu)建體可包括目的基因和許多元件其包括調(diào)節(jié)啟動子，絕緣子(insulator)，增強子，和阻遏物以及使核糖體結(jié)合于從DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA上的元件。
DNA構(gòu)建體也可以編碼核酶和反義DNA和/或RNA。這些例子對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的并且不意味局限于此。
由于可得的有效重組DNA技術(shù)結(jié)合調(diào)控元件DNA序列和容易在堿基數(shù)據(jù)庫中得到的基因以及商業(yè)載體(sector)，用這里描述的材料和方法本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地生產(chǎn)出適于建立轉(zhuǎn)基因細胞的DNA構(gòu)建體。
轉(zhuǎn)染技術(shù)對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是熟知的并且進行DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入細胞的材料和方法可由商業(yè)性獲得。一般用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞使用的材料是親脂性化合物，例如LipofectinTM?？梢哉T導特殊的親脂性化合物形成脂質(zhì)體以介導DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入細胞。
通過合理設(shè)計DNA構(gòu)建體可以將DNA構(gòu)建體上的靶序列插入核基因組的特定區(qū)域。這些設(shè)計技術(shù)和方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。見，例如，U.S.Pat.No.5,633,067；U.S.Pat.No.5,612,205和WO93/22432，將所有這些以其全文引入以作參考。一旦目的DNA序列被插入核基因組，目的DNA序列插入核基因組的插入?yún)^(qū)域位置和頻率用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法鑒定。
一旦將轉(zhuǎn)基因插入供體體細胞的核基因組，象本發(fā)明的其它供體體細胞一樣，該細胞可被用作這里公開的核轉(zhuǎn)移方法的核供體。將體細胞核轉(zhuǎn)移至無透明帶去核的卵母細胞的方法優(yōu)選包括細胞融合形成重組細胞。
一般使用穿過接觸/融合平面的直流(DC)電脈沖誘導融合，但是可以使用額外的交流電流(AC)幫助供體細胞和受體細胞排列成線。電融合產(chǎn)生電脈沖足以使質(zhì)膜短暫破壞并且足夠短以使膜快速再形成。因此，如果兩個比鄰膜被誘導破壞并且相互再形成脂質(zhì)雙層，那么在兩個細胞間會有小通道開放。由于這樣的小開口熱動力學不穩(wěn)定，它將擴大直至兩個細胞成為一個。此方法的進一步討論參考U.S.Pat.No.4,997,384 Prather etal.(在此以其全部引入作為參考)?？梢允褂迷S多電融合介質(zhì)，包括例如，蔗糖，甘露醇，山梨醇和磷酸鹽緩沖液。
也可以用仙臺病毒作為融合劑完成融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。也可以將細胞暴露于促融合化學物質(zhì)如聚乙二醇誘導融合。
優(yōu)選地，將供體體細胞和無透明帶，去核的卵母細胞放于500μm融合室中并用4ml 26℃-27℃的融合介質(zhì)覆蓋(0.3M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.05mM CaCl2)。然后細胞的電融合使用持續(xù)約15μs的70-100V雙DC電脈沖，兩者間隔約1s。融合后，將產(chǎn)生的融合的重組細胞放于合適的培養(yǎng)基中直至激活，例如，TCM-199培養(yǎng)基。
在優(yōu)選的細胞融合方法中首先將供體體細胞附著于無透明帶去核的卵母細胞。例如，挑選化合物能使體細胞附著于無透明帶去核的卵母細胞以使體細胞和無透明帶去核的卵母細胞膜融合。該化合物可以是任何能聚集細胞的化合物?；衔锟梢允悄芙Y(jié)合或聚集碳水化合物的蛋白質(zhì)或糖蛋白。更優(yōu)選地化合物是植物凝集素。植物凝集素可以選自伴刀豆球蛋白A，刀豆球蛋白A，蓖麻蛋白，大豆凝集素，蓮子凝集素和植物凝血素(phytohemaglutinin)(PHA)。優(yōu)選地化合物是PHA。
優(yōu)選地在與體細胞接觸前將無透明帶的去核卵母細胞暴露于PHA。優(yōu)選地將無透明帶的去核卵母細胞暴露于濃度為50-400μg/ml的PHA。最優(yōu)選地濃度是約200μg/ml?？梢詫o透明帶的去核卵母細胞暴露于PHA 1-60s。最優(yōu)選地將去核卵母細胞暴露于PHA 3s。
用PHA處理后，可以將無透明帶的去核卵母細胞與體細胞接觸使該體細胞附著于無透明帶的去核卵母細胞。可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)方法使無透明帶的去核卵母細胞與體細胞接觸。優(yōu)選使用微吸管操作使無透明帶的去核卵母細胞與體細胞接觸。然后可以按照上述方法使無透明帶的去核卵母細胞與附著的體細胞融合。
在一個優(yōu)選實施方案中，上述的電融合方法也包括進一步融合步驟，或者上述融合步驟包括一個供體體細胞和兩或多個無透明帶的去核卵母細胞。雙融合方法的優(yōu)點是增加重組細胞的胞質(zhì)體積。
在細胞核供體與受體卵母細胞融合前，融合時，和/或融合后一般用電的和/或非電方式將重組細胞激活(見，例如，Susko-Parrish etal.，U.S.Pat.No.5,496,720)。激活的方法包括1).電脈沖；2).化學誘導休克；3).精子穿透；4).通過向卵母細胞胞質(zhì)導入二價陽離子增加卵母細胞內(nèi)二價陽離子水平，例如，鎂，鍶，鋇，鈣，例如，以離子載體形式。增加二價陽離子水平的其它方法包括使用電休克，乙醇處理和caged螯合劑處理；和5).用已知方法降低卵母細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化，例如，通過加入激酶抑制劑，如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑例如6-二甲基氨基嘌呤，staurosporine，2-氨基嘌呤，鞘氨醇。或者，抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化可以通過向卵母細胞中導入磷脂酶例如磷脂酶2A和磷脂酶2B。
可以用已知方法激活重組細胞。這些方法包括例如，在低于生理溫度培養(yǎng)重組細胞，實質(zhì)上是向重組細胞使用冷刺激或低溫休克。在室溫培養(yǎng)重組細胞可以最方便地實現(xiàn)此方法，室溫相對于胚胎暴露的正常生理溫度狀況是冷的。合適的卵母細胞激活方法是U.S.Pat.No.5,496,720Susko-Parrish etal的主題，這里將其全部引入作為參考。
然后可以將激活的卵母細胞培養(yǎng)于適合的體外培養(yǎng)基直至產(chǎn)生多細胞或細胞集落。適合于胚胎培養(yǎng)和成熟的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域熟知的。可以用于牛胚胎培養(yǎng)和維持的已知培養(yǎng)基的例子包括添加10％FCS的Ham′s F-10，添加10％FCS的TCM-199，泰洛白蛋白-乳酸-丙酮酸鹽(Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate)(TALP)，Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(PBS)，合成的輸卵管液(″SOF″)，B2，CRlaa培養(yǎng)基和高鉀單純(Simplex)培養(yǎng)基(″KSOM″)，Eagle′s和Whitten′s培養(yǎng)基。用于收集和成熟卵母細胞最普通培養(yǎng)基之一的是TCM-199，和1-20％添加血清包括FCS，新生血清，動情期母牛血清，小羊血清或食用牛(Steer)血清。優(yōu)選的維持培養(yǎng)基包括TCM-199其含有Earl鹽，10％FSC，0.2mM丙酮酸鈉和50μg/ml硫酸慶大霉素。上述任何一種也可以用來與多種細胞類型例如顆粒細胞，輸卵管細胞，BRL細胞和子宮細胞及STO細胞共培養(yǎng)。
或者，在一優(yōu)選實施方案中，提供培養(yǎng)重組細胞(胚胎)方法其包括(i)在適合形成重組細胞的條件下向無透明帶，去核的哺乳動物卵母細胞中插入目的體細胞或細胞核；(ii)激活重組細胞；(iii)保溫和培養(yǎng)一個或多個該細胞直至胚胎大于二細胞發(fā)育階段。
優(yōu)選地，將胚胎培養(yǎng)至大于60個細胞。更優(yōu)選地，在60至200個細胞之間。
簡言之，將上述方法描述為Well of Well(WOW)系統(tǒng)。此方法包括在用“織補”型針(例如由BLS Ltd.，Budapest，Hungary制造并提供的“Aggregationneedles”，Catalogue no.DN09)ground尖端壓入培養(yǎng)皿底部形成的小凹中(“V”或“U”型)或者單個或者群體培養(yǎng)重組細胞，一般使用4孔“Nunclone”培養(yǎng)皿(Vajta etal，2000.)。
這些小凹(WOWs)一般深0.5-2mm并且頂端直徑0.5-2mm。激活后將胚胎置于這些WOW小凹(depression)中，或者單個或者2或3個“重組的”核轉(zhuǎn)移胚胎一起放于每個WOW中并且激活(當它們在細胞分裂前仍是單個細胞時)后以聚集體培養(yǎng)?；蛘邔⒅亟M的單個細胞核轉(zhuǎn)移胚胎在WOWs中單個培養(yǎng)3-4天(一般在8-128細胞之間)，然后將2-3個這樣的胚胎聯(lián)合置于每個孔中作為“聚集體”繼續(xù)培養(yǎng)。以這種聚集體培養(yǎng)核轉(zhuǎn)移胚胎增加了要轉(zhuǎn)移的最終胚胎細胞數(shù)并增加了受孕率(Peura et al，1998)。
在進一步實施方案中，提供培養(yǎng)重組細胞(胚胎)的方法其包括提供在培養(yǎng)基中按照這里前述方法的重組細胞(胚胎)；獲得至少兩端開放的管子并且其一端能夠接受重組細胞(胚胎)，管子直徑能夠允許吸取并維持管內(nèi)培養(yǎng)基中的重組細胞(胚胎)；將重組細胞(胚胎)吸至管中；和在管中保溫并培養(yǎng)重組細胞(胚胎)。
在管中培養(yǎng)的方法里，優(yōu)選管是對胚胎最低毒性級別的。最優(yōu)選地，它是未包被或處理過的，酸洗滌的硼硅酸鹽實驗室級玻璃。最重要的是，管子必須具有吸納能力因此在管中胚胎周圍的培養(yǎng)基通過毛細作用和表面張力被吸住以維持管中的胚胎。從管的任何一端空氣/培養(yǎng)基交界面處保護(cushion)管中的培養(yǎng)基，偶爾用一個小的油栓。
培養(yǎng)系統(tǒng)的管子可以是任何所提供直徑者其能吸納并維持管內(nèi)培養(yǎng)基中胚胎因此胚胎可以在吸引的培養(yǎng)基中發(fā)育。因此，管子必須能提供對培養(yǎng)基充足的毛細作用和表面張力以維持管子內(nèi)垂直的培養(yǎng)基并且也向管子上方吸引胚胎。優(yōu)選地，管子內(nèi)徑200-250mm。管子可以是毛細管。更窄范圍內(nèi)徑可以按照200mm或胚胎體積為限制因素的更小直徑。更窄范圍如200mm或以下可能對發(fā)育的完全啟動是有益的。
可以在被動毛細作用下或者通過在管上端吸取液體產(chǎn)生主動壓力將胚胎吸入或放入管中?？梢允褂玫诙N方法提供管子足夠的維持和吸住管中培養(yǎng)基和胚胎的能力。
一旦胚胎被吸入管中，優(yōu)選將管子保持垂直而不是水平以至于在空氣/培養(yǎng)基交界面產(chǎn)生保護。盡管垂直方向是最優(yōu)選的，也可以使用水平保溫。
設(shè)計培養(yǎng)管系統(tǒng)以使其含有的胚胎可以向發(fā)育的更高階段發(fā)育，優(yōu)選向成熟的囊胚泡階段。但是，觀察直接在管中的胚胎發(fā)育后可以選擇例如早期卵裂或桑椹胚階段。依據(jù)所需發(fā)育階段胚胎可以在任何時間除去。這有許多優(yōu)點因為一旦在培養(yǎng)系統(tǒng)中胚胎被容納并成熟，能立即在發(fā)育的最適階段用最小限度操作將其植入動物。
之后，優(yōu)選將培養(yǎng)的重組細胞洗滌并且然后置于合適的培養(yǎng)介質(zhì)，例如在孔板中含10％FCS的TCM-199培養(yǎng)基其優(yōu)選含有合適的融合營養(yǎng)層。合適的飼養(yǎng)層包括，例如，成纖維細胞和上皮細胞，例如。源自有蹄動物的成纖維細胞和子宮上皮細胞，小雞成纖維細胞，鼠的(例如小鼠或大鼠)成纖維細胞，STO和SI-m220飼養(yǎng)細胞系，和BRL細胞。
在一實施方案中，飼養(yǎng)細胞包括小鼠胚胎成纖維細胞。制備合適的成纖維細胞飼養(yǎng)層是本領(lǐng)域熟知的。
將重組細胞培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上直至重組細胞達到適合轉(zhuǎn)移給雌性受體的大小時，或適合獲取細胞其可用于生產(chǎn)細胞或細胞克隆時。優(yōu)選地，將這些重組細胞培養(yǎng)至至少約50個細胞。在合適條件下培養(yǎng)將是有效的，即，約39℃，和5％CO2，為了最佳生長一般約每隔2-5天更換培養(yǎng)基，優(yōu)選約每隔3天。
在本發(fā)明中胚胎轉(zhuǎn)移和受體動物管理的方法是在胚胎轉(zhuǎn)移工業(yè)上使用的標準程序。同步轉(zhuǎn)移對本發(fā)明成功是重要的，即，核轉(zhuǎn)移胚胎的階段與雌性受體的動情周期同步。其優(yōu)點和如何維持受體參見Siedel，G.E.，Jr.(11Critical review of embryo transfer procedures withcattle″in Fertilization andEmbryonic Development in Vitro(1981)L.Mastroianni，Jr.and J.D.Biggers，ed.，Plenum Press，New York，N.Y.，page 323)，在此將這些內(nèi)容引入作為參考。
簡言之，可以將囊胚泡用非外科或外科的方法轉(zhuǎn)移入同步的受體子宮中。用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)和介質(zhì)也可應用其它培養(yǎng)基。在一方法中，于5％2，5％O2和90％N2，39℃下，將克隆的胚胎用新鮮的KSOM洗滌并培養(yǎng)在含0.1％BSA的KSOM中4天，隨后用1％BSA再培養(yǎng)3天。用本領(lǐng)域已知的標準方法檢測胚胎的發(fā)育并分級。在第2天記錄卵裂率并且將卵裂的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)7天。在第7天，記錄囊胚泡(blastcyst)發(fā)育并且將一或兩個胚胎，在胚胎和/或動物的有效性期(pending availability)內(nèi)，非外科方法轉(zhuǎn)移入每個同步化的寄養(yǎng)母體子宮內(nèi)。
優(yōu)選定期如妊娠40，60，90，和120天用直腸觸診或超聲波檢查寄養(yǎng)母體懷孕狀況。優(yōu)選在妊娠全程仔細觀察并連續(xù)超聲監(jiān)測(每月)以估計在妊娠的許多階段的胚胎流產(chǎn)。如果可能，應該收集任何流產(chǎn)的胎兒，做DNA分型以確定克隆狀態(tài)及常規(guī)病理檢查。
在此方法各步中產(chǎn)生的重組細胞，激活的重組細胞或胚胎，胎兒和動物，和從其收獲的細胞，細胞核，和其它細胞成分也按本發(fā)明實施方案確認。
本發(fā)明也可用于生產(chǎn)胚胎，胎兒或例如，在細胞，組織和器官移植中可被使用的后代。通過從動物上取得胎兒或成年細胞并將其用于克隆方法可以當其經(jīng)歷器官發(fā)育過程時從克隆的胎兒獲得大量細胞，組織和可能的器官。也可以從克隆的后代分離細胞，組織和器官。此方法可提供許多醫(yī)療和獸醫(yī)治療包括細胞和基因治療的“物質(zhì)”資源。如果將這些細胞轉(zhuǎn)移回其來源的動物，那么可避免免疫排斥。而且，因為可以從這些克隆分離出許多細胞類型，可以使用其它方法學例如造血嵌合狀態(tài)來避免在同種動物之間以及種屬之間產(chǎn)生免疫排斥。
本說明書的全部描述和全部權(quán)利要求書中，詞語“包括”和該詞的變體例如″comprising″and comprises″，不打算排除其它添加物，成分，integers或步驟。
僅僅為提供本發(fā)明來龍去脈的目的將對前面背景資料，做法，裝置等等的討論包括在本說明書內(nèi)。這不意味或代表任何或全部這些資料形成前面背景基礎(chǔ)的一部分或者是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域一般常識知識，因為在本申請?zhí)峤蝗罩八言诎拇罄麃喆嬖凇?br> 現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實施例的方式進一步描述本發(fā)明。但是應當理解，下面的實施例僅僅是作為例證的，不應以任何方式當作對上述本發(fā)明總體的限制。例如，盡管大量關(guān)于牛卵母細胞和顆粒細胞(granulosa)的實施例，但是應當理解，如這里公開的本發(fā)明也可應用于其它動物卵母細胞，包括例如，綿羊，山羊和馬。
實施例1用顆粒細胞作為供體的核轉(zhuǎn)移方法除非另有說明所有化學品購自Sigma Chemical Co.(St Louis，MO，USA)。
以最少修改按照以前(Vajta etal.，1996)詳細描述的進行牛卵母細胞(每天共150個)的體外成熟。簡言之，將卵母細胞從屠宰場來源的卵巢中抽吸出來，在4孔培養(yǎng)皿(Nunc，Roskilde，Denmark)中成熟24小時，用添加了15％母牛血清，10IU/ml孕馬血清促性腺激素和5IU/ml人絨毛膜促性腺激素(SuigonanRVet，Intervet，Australia)的碳酸氫鹽緩沖的TCM-199培養(yǎng)基(GibcoBRL，Paisley，UK)并且在39℃，含5％CO2的濕潤空氣中用礦物油保溫。
成熟過程開始后19小時時用渦旋去除卵丘細胞。從此時起(除非額外說明)所有操作在調(diào)至39℃的熱平臺(heat stage)上進行。根據(jù)第一極體的存在挑選成熟的卵母細胞(約110個)，放于0.5％鏈霉蛋白酶(Sigma蛋白酶)溶液中5分鐘從細胞去除透明帶。將無透明帶的卵母細胞(大約50-60個，總數(shù)的一半)排列于35mm培養(yǎng)皿中(Falcon，Becton Dickinson Labware，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)其內(nèi)裝有4ml添加了20％FCS和10μg/ml細胞松弛素B的Hepes緩沖的TCM-199培養(yǎng)基(TCMH)(參見
圖1A)。
在立體顯微鏡控制下用Ultra sharp Splitting Blades(AB Technology，Pullman，WA，USA)人工進行二等分(參見
圖1B)。然后在培養(yǎng)皿中間旋動收集二等分的卵母細胞(半-卵母細胞)，并置于無細胞松弛素的同樣培養(yǎng)基中，將其它卵母細胞重復此步驟。
完成二等分后，將所有的半卵母細胞用溶解于TCMH和30％FCS的熒光染料Hoechst 33342染色，然后置于在60mm Falcon培養(yǎng)皿底部3μl滴同樣的培養(yǎng)基中并用油覆蓋(每滴3個半卵母細胞，共約70滴)。在倒置顯微鏡和紫外照明下檢查后，在描述的用于成熟和保溫至融合的條件下挑選無染色質(zhì)染色(胞質(zhì)體)的半卵母細胞，并在立體顯微鏡下(共約100-120)收集在原始成熟培養(yǎng)皿的一孔中者。
從早于成熟7-10天使用的4孔培養(yǎng)板中形成的顆粒細胞單層制備體細胞。用100μl 0.05％胰蛋白酶保溫5分鐘后，向孔中加入800μl的TCMH和20％FCS，用力吹打(pipetting)分離細胞并用1.5ml Eppendorf管貯存于4℃直至融合。
在成熟開始后21-22小時進行融合。對于第一次融合，將15個去核的卵母細胞轉(zhuǎn)移至含2％FCS的TCMH中。將5μl顆粒細胞懸液沉淀于裝有無血清TCMH的4孔培養(yǎng)皿的底部中間部位。將用細吸口的玻璃吸管吸取的去核卵母細胞單個暴露于200μg/ml PHA(ICN Pharmaceuticals，Australia)3秒，然后迅速滴在沉降在培養(yǎng)皿底部的單個顆粒細胞上(參見
圖1C和1D)。附著后將去核的卵母細胞顆粒細胞對再次拿起，并轉(zhuǎn)移至覆蓋了4ml26-27℃融合培養(yǎng)基(0.3M甘露醇，0.1mM MgS04，，0.05mM CaCl2)的融合槽內(nèi)。融合室內(nèi)裝有直徑1mm間隔0.8mm的平行鉑絲。使用15V交流電流(AC)和700KHz(Genaust Electrofusion Machine，Australia)。將細胞對(pair)附著于一根電線(體細胞遠離電線-參見
圖1E)然后用85V的雙DC脈沖，每次20μs，間隔0.1s融合。然后當評價融合時，將細胞對小心地移出并在含20％FCS的TCM-199中保溫15-30分鐘。全部15個去核卵母細胞與顆粒細胞融合后，更換融合培養(yǎng)基，并且為新一輪第一次融合制備新的去核卵母細胞和顆粒細胞。
對第二次融合，首先將未融合的去核卵母細胞和融合的細胞對(重組細胞)(各5-10個)在融合培養(yǎng)基中保溫1-2分鐘，然后用同樣的AC脈沖成對排列，未融合的去核卵母細胞附著電線(參見
圖1F)。用同樣參數(shù)的雙融合脈沖，但是使用45V DC，然后將兩個去核卵母細胞和顆粒細胞的三體在TCMH和20％FCS中保溫20分鐘。然后將融合的重組細胞(共約40-45個)轉(zhuǎn)移至成熟培養(yǎng)皿的孔中并進一步在上述條件下保溫(Vajta etal.，2002)。
在成熟開始(大約融合后3小時)后24-26小時開始激活。首先將重組細胞在含10μM鈣ionophoreA23187的TCMH于空氣中5分鐘，然后在2mM6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)中于5％CO2的空氣中保溫5小時。其中6-DMAP溶解于碳酸氫鹽緩沖的添加10％FCS的TCM-199中。
然后將胚胎用添加5％母牛血清的SOFaaci培養(yǎng)基(Holm etal.，1999)400μl反復洗滌并用礦物油覆蓋，之后隨機分成三組，每組保持在相同的培養(yǎng)基中。將第一組單個培養(yǎng)在覆蓋有礦物油的1μl滴中。將第二組的胚胎置于wells的孔中(WOWs；Vajta etal.，2000)。將第三組單個裝入2μl Drummond顯微毛細管中(Thouas etal.，2001)。所有培養(yǎng)在39℃，5％CO2和90％N2(濕潤的空氣中)進行。
重組2和7天后，在立體顯微鏡下分別評價每個胚胎的卵裂和囊胚泡率。
圖1(G)顯示融合后在GO系統(tǒng)中發(fā)育7天的囊胚泡。
圖1(H)顯示離開GO系統(tǒng)后的同一囊胚泡。將一些囊胚泡固定用于將來免疫組織化學和超微結(jié)構(gòu)研究；將其它的玻璃化用于將來胚胎轉(zhuǎn)移實驗。
卵裂和囊胚泡率的統(tǒng)計學分析用Pearson Chi-square方法進行，p＞0.05認為是有意義的。
實施例2用顆粒細胞作為供體的核轉(zhuǎn)移的結(jié)果使用了共1016個未成熟卵細胞的7次重復核轉(zhuǎn)移實驗主要步驟的平均效率和大約時間總結(jié)于表1表1無透明帶體細胞核轉(zhuǎn)移步驟的平均效率和大約需要時間方法 單個效率累計效率 需要時間PB率判定 - - 30分鐘透明帶去除99％99％ 10分鐘二等分89％88％ 20分鐘UV觀察91％80％ 30分鐘第一次融合94％75％ 40分鐘第二次融合91％69％ 15分鐘(相關(guān)工作)- - 35分鐘總計180分鐘棄去無明顯可見極體的卵母細胞(占總數(shù)的28％)。但是，此損失不影響核轉(zhuǎn)移方法，因此在計算效率時不包括在內(nèi)。在二等分時的損失是在該步完成后5分鐘觀察到的裂解的結(jié)果。選擇去核卵母細胞的最后準確性近乎100％。但是，9％的誤差多數(shù)由于計算的和獲得的數(shù)目之間發(fā)生技術(shù)失誤。融合中的丟失幾乎全部是裂解的結(jié)果或技術(shù)失誤，將不成功的融合(融合后15-20分鐘細胞對分離)排除并且通常用重復融合步驟來降低。
平均地，每個實驗使用105個成熟的卵母細胞并產(chǎn)生35個去核卵母細胞-去核卵母細胞-體細胞三聚體，而且所需工作時間不超過3小時。
在三個培養(yǎng)系統(tǒng)中完成的胚胎發(fā)育率總結(jié)于表2。除在培養(yǎng)在微滴中相對于WOW系統(tǒng)中的胚胎卵裂率(2細胞或多個)外所有值有顯著性差異。
表2在不同培養(yǎng)組中完成的卵裂和囊胚泡率培養(yǎng)系統(tǒng) 卵裂率囊胚泡率微滴 25/41(61％)a0/41(0％)aWOW系統(tǒng)76/103(74％)a19/103(18％)bGO系統(tǒng) 47/53(89％)b10/53(36％)ca，b，c在同一列內(nèi)帶有不同標記的值意味著顯著差異。
一般地，在微滴中培養(yǎng)的胚胎發(fā)育不超過8-16個細胞階段；致密生長只發(fā)生在WOW或GO系統(tǒng)中。囊胚泡形成通常在重組后6天開始并在第7天完成。
在實施例中描述的雙融合核轉(zhuǎn)移方法的功效是可能的因為被融合的兩個細胞大小相似(在我們的實驗中胞質(zhì)體的體積僅為原始卵母細胞的一半)，并且PHA粘附可以在相當大區(qū)域建立強的膜接觸。與Peura et al.(1998)的一步(去核卵母細胞+去核卵母細胞+裂球)融合方法相比，實施例中描述的雙融合方法(首先去核卵母細胞+體細胞產(chǎn)生重組細胞，然后第二個去核卵母細胞與重組細胞融合)更方便和有效。使用兩個去核卵母細胞來重組也意味著可以完全彌補傳統(tǒng)核轉(zhuǎn)移不可避免的細胞質(zhì)體積的丟失。
實施例中所描述優(yōu)選方法的結(jié)果顯示這些方法對細胞克隆技術(shù)的發(fā)展有重要的潛力，其滿足對使這些技術(shù)在農(nóng)業(yè)上大規(guī)模應用的核轉(zhuǎn)移自動化的需要。特別是，體細胞核轉(zhuǎn)移的簡化方法大大降低了對目前使用的昂貴的和技術(shù)高難的顯微操作方法的依賴。而且，這些改進已經(jīng)明顯縮短了進行成功核轉(zhuǎn)移的全部時間。
實施例3簡化的無帶體細胞克隆技術(shù)除了下面的以外本實施例中使用的方法與實施例1中描述的相同。
將重組的核轉(zhuǎn)移胚胎或者單個，或者2個重組的核轉(zhuǎn)移胚胎作為聚集體培養(yǎng)，并且培養(yǎng)或者在玻璃毛細管中或者在4孔Nunclone培養(yǎng)皿的WOWs中進行。激活后將胚胎吸入玻璃管中或置于WOW小凹中，將或者單獨或者2“重組的”核轉(zhuǎn)移胚胎在每個玻璃毛細管中培養(yǎng)，或在WOW小凹中培養(yǎng)，并且激活后以聚集體培養(yǎng)。
表3，4和5顯示用實施例1描述的技術(shù)生產(chǎn)的核轉(zhuǎn)移胚胎培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移的囊胚泡發(fā)育率和受孕率。將重組核轉(zhuǎn)移胚胎單個(表3)或以兩個重組核轉(zhuǎn)移胚胎為聚集體(表4和5)培養(yǎng)。
表3中報告的所有實驗除最后一個使用胎兒成纖維細胞外均使用一周齡的顆粒細胞進行。囊胚泡率是從單個(即不是聚集體)培養(yǎng)的核轉(zhuǎn)移胚胎發(fā)育來的。
表4顯示用轉(zhuǎn)基因供體細胞(用牛αS1酪蛋白基因轉(zhuǎn)染)從簡化的，無帶核轉(zhuǎn)移技術(shù)獲得的囊胚泡率。將重組核轉(zhuǎn)移胚胎單個或以2個為聚集體培養(yǎng)?；蛘吲囵B(yǎng)在GO系統(tǒng)或者培養(yǎng)在WOW系統(tǒng)。忽略由于融合和激活引起的損失。在3.5小時(加上激活)內(nèi)可生產(chǎn)20-30囊胚泡。
表5顯示用轉(zhuǎn)基因供體細胞(用牛αS1酪蛋白基因轉(zhuǎn)染的成纖維細胞)從簡化的，無帶核轉(zhuǎn)移技術(shù)得到的聚集核轉(zhuǎn)移胚胎轉(zhuǎn)移后的受孕率。2重組核轉(zhuǎn)移胚胎或者單個培養(yǎng)或者以2個為聚集體培養(yǎng)，并且或者培養(yǎng)在玻璃毛細管(GO)或者培養(yǎng)在4孔Nun培養(yǎng)皿中的WOWs系統(tǒng)中(Lewis etal.，2002)。
表32001/2002獲得的囊胚泡率實驗日期 細胞類型 單個重組NT胚胎培養(yǎng)數(shù)囊胚泡數(shù) ％囊胚泡05.12.01 顆粒細胞 44 2148％12.12.01 顆粒細胞 40 2255％13.12.01 顆粒細胞 59 3864％
14.12.01顆粒細胞 5324 45％15.12.01顆粒細胞 5423 43％25.01.02顆粒細胞 3918 47％26.01.02(IL)顆粒細胞 21943％30.01.02(IL)顆粒細胞 19947％05.02.02胎兒成纖維細胞5625 45％總計 385 189 49％表4單個重組NT胚胎培養(yǎng) 聚集體數(shù) 囊胚泡數(shù)％囊胚泡數(shù)18090 35 每個聚集體39％或每個單個重組NT胚胎19％表5用轉(zhuǎn)基因供體細胞(用牛αS1酪蛋白基因轉(zhuǎn)染)從簡化的，無帶核轉(zhuǎn)移技術(shù)得到的受孕率新鮮的或 接受胚胎的受體數(shù) 在30-40天妊娠 超過7個月玻璃化的 (胚胎數(shù)) 的受體數(shù)(％) 繼續(xù)妊娠數(shù)-新鮮的 6(19) 2(33％)1-玻璃化的5(16) 2(40％)1總計 11(35) 4(36％)2**1個在7.5個月妊娠失敗(胎兒未回收)。
*1個在懷孕8個月零1周時失敗。
難產(chǎn)-獸醫(yī)助產(chǎn)后胎兒死亡。小牛出生體重35kg。Post-mortem at VIAS，Attwood。在P-M未檢測出明顯的大體(gross)異常。組織病理學上，在腦，胸腺，肺，心臟，肝，腎，骨骼肌或胎盤未發(fā)現(xiàn)明顯損害(見VIAS報告01-005483-MW)。
實施例4在核轉(zhuǎn)移胚胎轉(zhuǎn)移入受體母牛后改善的植入除下述外使用的方法如實施例1所描述。
將重組的單個細胞核轉(zhuǎn)移胚胎單獨在WOWs中培養(yǎng)4天(當它們一般在30-60細胞之間時)，然后將2個這樣胚胎在一孔中組合以進一步培養(yǎng)成“聚集體”。以這種聚集體培養(yǎng)核轉(zhuǎn)移胚胎增加了要轉(zhuǎn)移的最終胚胎細胞數(shù)并增加了受孕率(Peura etal，1998)。
將6個7天的囊胚泡轉(zhuǎn)移入6個受體母牛。即，每個受體只轉(zhuǎn)移入一個胚胎。在妊娠30天左右6個受體母牛中5個被診斷為懷孕(通過超聲檢查)。相對照，在實施例3和5中每個受體轉(zhuǎn)移入多個胚胎其增加了受孕率。
實施例5融合參數(shù)和條件的優(yōu)化在本實施例中，進行優(yōu)化融合參數(shù)和條件的研究。
在將體細胞與2或3個胞質(zhì)體融合中間作對比。激活后，將重組的核轉(zhuǎn)移胚胎以單個胚胎，或以2個胚胎的聚集體培養(yǎng)。
本實施例中使用的方法與實施例1中使用的相同，除以下例外1.使用一步融合來融合體細胞和2個胞質(zhì)體，而不是實施例1中為達到此目的使用的2步融合步驟。
將體細胞和胞質(zhì)體(每個體細胞或者2個或者3個胞質(zhì)體)同時融合。
使用成纖維細胞。融合所需參數(shù)按照成纖維細胞大小計算(Teissie et al.，1998)。使用0.5mm間隔的融合室或者在成纖維細胞表面使用2V(112V＝2.22kV)6μsec(Genaust Electrofusion Machine，Australia)或者在成纖維細胞表面使用3V(166.8V＝2.3kV)4μsec(BTX Electro Cell Manipulator 200，USA)。是成纖維細胞中穩(wěn)定狀態(tài)值的誘導電位差是較大胞質(zhì)體上電位的微小一部分因此保存了胞質(zhì)的活力。所有融合使用單一脈沖進行。
用微細吸管操作將一半胞質(zhì)體暴露于PHA并附著于一個成纖維細胞。將成纖維細胞/胞質(zhì)體對與另外一個半胞質(zhì)體一起(當進行三聚體時)在電融合培養(yǎng)基中平衡。
2.將或者2個或者3個胞質(zhì)體與體細胞融合以形成重組的核轉(zhuǎn)移胚胎。
3.激活后，將核轉(zhuǎn)移胚胎或者以單個胚胎或者以2個重組核轉(zhuǎn)移胚胎為聚集體培養(yǎng)。
從共60個胚胎轉(zhuǎn)移入16個接受受體(即平均每個受體轉(zhuǎn)移入3.8個胚胎)得到的7個懷孕者在寫此申請時有3個繼續(xù)妊娠。
表6對比與體細胞融合2或3個胞質(zhì)體。將單個胚胎培養(yǎng)在玻璃毛細管(GO系統(tǒng))中。將聚集的胚胎在4孔Nunc培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(每個WOW中2個重組的核轉(zhuǎn)移胚胎)。
表6
*使用有預設(shè)值(166V，4μSec)的BTX儀器進行融合，而其它的使用GA儀器(112V，6μsec)進行。重組的表7顯示轉(zhuǎn)移胚胎數(shù)和受孕率。
表7轉(zhuǎn)移的胚胎(源自或者單個的或者聚集的重組核轉(zhuǎn)移胚胎)數(shù)
應當指出本方法需要較少時間。特別是，用優(yōu)化的融合參數(shù)和條件使步驟數(shù)(SC-胞質(zhì)體復合物的再檢查和再融合，用另外卵母細胞的二次融合)已經(jīng)被減少但不損失效率，融合過程可以在非常短時間內(nèi)完成，但是去核過程仍需大約此步驟所用時間的60-70％。這將是自動化的主要目標。
預計的電壓和脈沖持續(xù)時間對同時融合是有效的。預計值(依據(jù)9μm成纖維細胞)用進行體細胞+胞質(zhì)體的同時融合的BTX儀器檢測，判定融合和囊胚泡率。
為了加速系統(tǒng)自9月份以來按照PB或形態(tài)學表現(xiàn)選擇不要的卵母細胞。同樣不被選擇的標準應用于轉(zhuǎn)移的胚胎。
將PVA加入融合培養(yǎng)基中防止卵母細胞粘連和膜破壞而裂解。盡管建議應該每隔兩周制備融合培養(yǎng)基，但是將培養(yǎng)基分裝凍存并無不良影響。將Demo-卵母細胞放入融合槽前在含有融合培養(yǎng)基的分別的孔中保溫。
通過引入一步融合已經(jīng)將現(xiàn)存的融合方法簡化和改進。與現(xiàn)存的兩步法對比(體細胞+胞質(zhì)體和然后胞質(zhì)體+胞質(zhì)體)將體細胞和胞質(zhì)體同時融合(同時10-12核轉(zhuǎn)移)?，F(xiàn)有方法所需時間大大縮短。
而且按照現(xiàn)存的公式計算和測試融合參數(shù)(Teissie etal.，1997)。將體細胞和無透明帶，去核的卵母細胞同時融合(同時10-12個核轉(zhuǎn)移)。用新參數(shù)(在細胞表面使用3V，4μsec)，誘導電位差是成纖維細胞中穩(wěn)定狀態(tài)值但它是較大胞質(zhì)體上電位微小的一部分因此保存了較大胞質(zhì)體的活力。
實施例6與牛卵母細胞對比使用鼠和綿羊卵母細胞的核轉(zhuǎn)移用綿羊和鼠的卵母細胞在實驗中使用實施例1中描述的方法。例如，參考實施例1中的以相似于牛卵母細胞的方式將綿羊和鼠的卵母細胞收集，處理去除透明帶和去核。體細胞使用成纖維細胞。
表8顯示在用55V(1.1Kv)和112V(2.2kV)6μsec同時融合2胞質(zhì)體和體細胞(成纖維細胞)后重組綿羊胚胎中的融合率。
表8重組的無透明帶綿羊胚胎中的融合率
表9顯示在2個重復實驗中于112V(2.2kV)6μSec同時融合2個胞質(zhì)體和綿羊體細胞(成纖維細胞)后重組綿羊胚胎中的融合率。融合后3小時在熒光顯微鏡下檢查每個胚胎的染色質(zhì)數(shù)。
表9重組的無透明帶綿羊胚胎中的染色質(zhì)
表10顯示在2個重復實驗中于112V(2.2kV)6μSec同時融合2個胞質(zhì)體和體細胞(成纖維細胞)后重組綿羊核轉(zhuǎn)移胚胎中的裂解率。
表10重組的無透明帶綿羊核轉(zhuǎn)移胚胎中的裂解率
表11無透明帶鼠卵母細胞二等分后的裂解組別 ％(數(shù)目)無卵母細胞 100％(36預計的半卵母細胞＝72)半-卵母細胞 12.5％(9)分裂后裂解 87.5％(63)表12在用AT V(2.2kV)6μSec同時融合2胞質(zhì)體和體細胞(成纖維細胞)后種屬間的(牛胞質(zhì)體+嚙齒類成纖維細胞)重組的胚胎囊胚泡率新鮮的小鼠成纖維細胞 干的小鼠成纖維細胞重組胚胎數(shù)目19 18卵裂12(63.2％) 8(44.4％)
參考文獻Colman，A(1999).Somatic cell nuclear transfer in mammalsprogress andapplications.Cloning 1185-200.
Galli，C，Duchi，R Moor，RM andLazzari，G.(1999).Mammalian leucocytescontains information necessary for the development of a new individual.Cloning1161-170.
Holm，P，Booth，PJ，Schmidt，MH，Greve，T andCallesen，H.(1999).Highbovine blastocyst development in a static in vitro production system usingSOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with orwithout serum-proteins.Theriogenology52，683-700.
Lewis，IM，Vajta，G，F(xiàn)rench，AJ，Hall，VJ，Korfiatis，NA，Ruddock，NT，Travers，MJ，Travers，RL and Trounson，AO.(2002).Pregnancy rates fromsimplified zona-free somatic cell cloning and traditional zonaenclosed cloning incattle.Theriogenology 57，431.
Lewis，IM，Munsie，MJ，F(xiàn)rench，AJ，Daniels，R and Trounson，AO.(2001).The cloning cyclefrom amphibia to mammals and back.Reproductive MedicineReviews 9，13-33.
Peura，TT，Lane，M，Lewis，IM andTrounson，AO.(1998).The effect ofrecipient oocyte volume on nuclear transfer in cattle.Mol.Reprod.Dev.50，185-191.
Teissie，J andRamos，C.(1998).Correlation between electric field pulseinduced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.Biophys.J.741889-98.
Thouas，GA，Jones，GM andTrounson，AO.(2001).A novel method ofmicro-culture of mouse zygotes to the blastocyst stage-the″GO″culture system.Human Reproduction 16，168.
Trounson，A.(2001).Nuclear transfer in human medicine and animalbreeding.Reprod.Fertil.Dev.1331-9.
Vajta G.，Lewis IM，Korfiatis NA，Travers RL，Trounson AO.(2002).Bovine somatic cell cloning without micromanipulatorsoptimization of certainparameters.Theriogenology 57，453.
Vajta，G，Holm，P，Greve，T.and Callesen，H.(1996).Factors affectingsurvival rates of in vitro produced bovine embryos after vitrification and directinstraw rehydration.Theriogenology，45191-200.
Vajta，G，Peura，TT，Holm，P，Paldi，A，Greve，T and Trounson，AOandCallesen，H.(2000).New method for culture of zona-included or zona-freeembryosthe Well of the Well(WOW)system.Mol.Reprod.Dev.55256-254.
Wells，KD and Powell，AM.(2000).Blastomeres from somatic cell nucleartransfer embryos are not allocated randomly in chimeric blastocysts.Cloning，29-22.
權(quán)利要求
1.一種核轉(zhuǎn)移的方法，其包括將體細胞或體細胞核轉(zhuǎn)移入無透明帶，去核的卵母細胞步驟。
2.一種生產(chǎn)遺傳工程改造的或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物的方法，其包括(i)在體細胞或細胞核內(nèi)插入，去除或修飾一個目的基因或多個基因；(ii)在適合形成重組細胞的條件下將體細胞或細胞核插入無透明帶的去核卵母細胞中；(iii)激活重組細胞以形成胚胎；(iv)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細胞發(fā)育階段；和(v)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物以使胚胎發(fā)育成轉(zhuǎn)基因胎兒。
3.一種克隆哺乳動物的方法，其包括(i)在適合形成重組細胞的條件下將目的體細胞或細胞核插入無透明帶的去核卵母細胞中；(ii)激活重組細胞以形成胚胎；(iii)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細胞發(fā)育階段；和(iv)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物以使胚胎發(fā)育成胎兒。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中卵母細胞從哺乳動物的輸卵管和/或卵巢分離。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中卵母細胞用輸卵管回收或經(jīng)陰道回收方法分離。
6.按照權(quán)利要求4或5的方法，其中卵母細胞用抽吸法分離。
7.按照權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中卵母細胞處于前期I或中期II。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中卵母細胞處于前期I。
9.按照權(quán)利要求2-8中任一項的方法，其中卵母細胞在體外培養(yǎng)成熟至中期II。
10.按照權(quán)利要求2-9中任一項的方法，進一步包括冷藏卵母細胞，重組細胞，胚胎或胎兒的步驟。
11.按照權(quán)利要求2-10中任一項的方法，其中哺乳動物是選自牛科，羊科，鹿科，豬科，馬科或駱駝科的家養(yǎng)的或野生的代表性有蹄動物。
12.按照權(quán)利要求2-10中任一項的方法，其中哺乳動物是母?；蚬＃芭?，水牛，綿羊，大角綿羊，馬，小馬，驢，騾，鹿，麋鹿，馴鹿，山羊，印度水牛，駱駝，美洲駝，羊駝，或豬。
13.按照權(quán)利要求6的方法，其中?？品N類是Bos taurus，Bos indicus或Bos水母牛或公牛。
14.按照權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中去除透明帶使用的方法選自物理操作，化學處理或酶消化。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其中透明帶用酶消化去除。
16.按照權(quán)利要求15的方法，其中是用暴露于蛋白酶，鏈霉蛋白酶或它們組合來進行酶消化。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其中酶消化是通過暴露于鏈霉蛋白酶。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其中使用鏈霉蛋白酶濃度在0.1％-5％之間。
19.按照權(quán)利要求17的方法，其中使用鏈霉蛋白酶濃度在0.25％-2％之間。
20.按照權(quán)利要求17的方法，其中使用鏈霉蛋白酶濃度約為0.5％。
21.按照權(quán)利要求1-20中任一項的方法，其中去核步驟使用方法選自抽吸，物理去除，使用DNA特異的熒光染料，或紫外線照射。
22.按照權(quán)利要求21的方法，其中去核通過物理去除。
23.按照權(quán)利要求22的方法，其中物理去除是二等分。
24.按照權(quán)利要求1-23中任一項的方法，其中體細胞選自上皮細胞，神經(jīng)細胞，表皮細胞，角質(zhì)細胞，造血細胞，黑素細胞，軟骨細胞，淋巴細胞(B和T淋巴細胞)，紅細胞，巨噬細胞，單核細胞，單核的細胞，成纖維細胞，心肌細胞，或其它肌細胞。
25.按照權(quán)利要求24的方法，其中體細胞來自皮膚細胞，肺臟細胞，胰腺細胞，肝臟細胞，胃細胞，腸細胞，心臟細胞，生殖器官細胞，膀胱細胞，腎臟細胞，尿道細胞或其它泌尿器官細胞。
26.按照權(quán)利要求24的方法，其中體細胞是成纖維細胞或顆粒細胞。
27.按照權(quán)利要求24的方法，其中體細胞是體外培養(yǎng)的成纖維細胞或顆粒細胞。
28.按照權(quán)利要求24的方法，其中體細胞是轉(zhuǎn)基因細胞。
29.按照權(quán)利要求28的方法，其中轉(zhuǎn)基因細胞已通過一個或多個目的基因插入，刪除或修飾而得以修飾。
30.按照權(quán)利要求1-29中任一項的方法，其中轉(zhuǎn)移體細胞或細胞核的步驟是通過融合。
31.按照權(quán)利要求30的方法，其中融合的方法選自化學融合，電融合或生物融合。
32.按照權(quán)利要求31的方法，其中化學融合或生物融合通過將無透明帶，去核的卵母細胞與體細胞組合暴露于融合試劑。
33.按照權(quán)利要求32的方法，其中融合試劑是當將體細胞供體與無透明帶，去核的卵母細胞受體鄰近放置時能增加不同細胞質(zhì)膜部分融合概率的任何化合物或生物有機物。
34.按照權(quán)利要求33的方法，其中融合試劑選自聚乙二醇(PEG)，胰蛋白酶，二甲基亞砜(DMSO)，植物凝集素，凝集素，病毒，或仙臺病毒。
35.按照權(quán)利要求32的方法，其中使用電脈沖誘導電融合。
36.按照權(quán)利要求32的方法，其中電融合包括向無透明帶，去核的卵母細胞與體細胞組合傳遞一次或多次電脈沖的步驟。
37.按照權(quán)利要求31的方法，進一步包括在融合前將無透明帶，去核的卵母細胞與體細胞附著步驟。
38.按照權(quán)利要求37的方法，其附著步驟通過將無透明帶，去核的卵母細胞暴露于能使細胞聚集的化合物。
39.按照權(quán)利要求38的方法，其中化合物是能結(jié)合或聚集碳水化合物的蛋白質(zhì)或糖蛋白。
40.按照權(quán)利要求39的方法，其中化合物是植物凝集素。
41.按照權(quán)利要求40的方法，其中植物凝集素選自伴刀豆球蛋白A，刀豆球蛋白A，蓖麻蛋白，大豆凝集素，蓮子凝集素和植物凝血素(PHA)。
42.按照權(quán)利要求41的方法，其中化合物是PHA。
43.按照權(quán)利要求42的方法，其在與體細胞接觸前將無透明帶，去核的卵母細胞暴露于PHA。
44.按照權(quán)利要求43的方法，其中將無透明帶的去核卵母細胞暴露于濃度為50-400μg/ml的PHA。
45.按照權(quán)利要求44的方法，其中濃度是約200μg/ml。
46.按照權(quán)利要求42-45中任一項的方法，其中將無透明帶的去核卵母細胞暴露于PHA 1-60s。
47.按照權(quán)利要求46的方法，其中將去核卵母細胞暴露于PHA 3s。
48.按照權(quán)利要求2-48中任一項的方法，進一步包括向重組細胞融合一或多個無透明帶的卵母細胞。
49.按照權(quán)利要求48的方法，其中進一步步驟是按順序或同時進行權(quán)利要求2的步驟(ii)。
50.一種克隆哺乳動物的方法，其包括(i)在適合形成重組細胞的條件下向第一個無透明帶，去核的哺乳動物卵母細胞中插入目的體細胞或細胞核；(ii)將第二個或多個卵母細胞與該重組細胞融合因而增加了細胞質(zhì)體積；(iii)激活重組細胞以形成胚胎；(iv)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細胞發(fā)育階段；和(v)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物以使胚胎發(fā)育成胎兒。
51.按照權(quán)利要求50的方法，其中步驟(i)和(ii)按順序或同時進行。
52.按照權(quán)利要求50的方法，其中步驟(i)和(ii)同時進行。
53.按照權(quán)利要求2-52中任一項的方法，其中激活重組細胞的步驟選自電脈沖，化學誘導休克，精子穿透，增加細胞內(nèi)二價陽離子水平或降低磷酸化。
54.按照權(quán)利要求2-52中任一項的方法，其中胎兒被轉(zhuǎn)移入同步化的受體子宮內(nèi)。
55.按照權(quán)利要求54的方法，其中受體是雌性哺乳動物。
56.一種培養(yǎng)重組細胞(胚胎)的方法，其包括(i)在適合形成重組細胞的條件下向無透明帶，去核的哺乳動物卵母細胞中插入目的體細胞或細胞核；(ii)激活重組細胞；(iii)保溫和培養(yǎng)一個或多個該細胞直至胚胎發(fā)育成8-128個細胞之間。
57.按照權(quán)利要求56的方法，其中將兩或多個細胞共同培養(yǎng)。
58.按照權(quán)利要求56的方法，其中將二或三個細胞共同培養(yǎng)。
59.按照權(quán)利要求56的方法，其中將單個重組細胞培養(yǎng)至產(chǎn)生8至128個細胞的胚胎然后將二或多個胚胎組合并共同培養(yǎng)成聚集體。
60.按照權(quán)利要求1-59任何一項獲得的哺乳動物。
61.按照權(quán)利要求60從哺乳動物獲得的細胞，組織或器官。
全文摘要
本發(fā)明涉及核轉(zhuǎn)移方法和由此發(fā)育成的胚胎。尤其是，本發(fā)明涉及包括將體細胞或體細胞核轉(zhuǎn)移入無透明帶，去核的卵母細胞的核轉(zhuǎn)移的方法。
文檔編號A01K67/027GK1524121SQ02812581
公開日2004年8月25日 申請日期2002年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月20日
發(fā)明者伊恩·劉易斯, 加博爾·瓦杰塔, 泰弗·特西里奧格魯, 瓦杰塔, 伊恩 劉易斯, 特西里奧格魯 申請人:蒙納希大學