本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)種莖處理領(lǐng)域，一種木薯細(xì)菌性萎蔫病羅病種莖消毒方法。
背景技術(shù)：
木薯(manhotesculentacrantz)是世界三大薯類(木薯、甘薯、馬鈴薯)之一，它廣泛栽培于熱帶和部分亞熱帶地區(qū)，是許多熱帶地區(qū)居民日常食物中的主要熱量來源。自19世紀(jì)引入我國以來，木薯已在華南地區(qū)廣泛種植，是我國重要的工業(yè)原料作物和糧飼作物。由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種(xanthomonasaxonopodispv.manihotis(bondar)vauterin)侵染引起的細(xì)菌性萎蔫病(cassavabacterialblight，也稱細(xì)菌性枯萎病或細(xì)菌性疫病)是一種世界性病害，廣泛發(fā)生于亞洲、非洲和拉丁美洲的各個木薯產(chǎn)區(qū)，對木薯產(chǎn)業(yè)影響很大，可造成12％以上的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時可造成毀種絕收。1963年該病在中國臺灣首次發(fā)生，80年代在我國的廣東、廣西、海南等地區(qū)發(fā)現(xiàn)有該病為害的報道。病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病在廣東、廣西、海南等主要木薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。近年來該病頻發(fā)流行，在局部地區(qū)為害嚴(yán)重，已成為當(dāng)前我國木薯生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的病害。
在木薯種植中，通常采用成熟的已木質(zhì)化的莖桿作為種植材料。發(fā)病地塊收獲的木薯種莖常攜帶有病原菌，病害可隨著種莖調(diào)運進(jìn)行長距離傳播，因此羅病種莖也是木薯新種植區(qū)的病菌來源。若種莖帶菌，木薯在苗期即可發(fā)病，嚴(yán)重時出現(xiàn)幼苗萎蔫死亡而導(dǎo)致缺苗現(xiàn)象。此外，由于苗期開始發(fā)病，田間菌量多，當(dāng)氣候條件適合細(xì)菌性萎蔫病發(fā)生時，容易出現(xiàn)病害暴發(fā)流行。種植無病種莖，能夠有效減緩或減輕病害的發(fā)生及危害，尤其適用于新開發(fā)的木薯園。因此，采用羅病種莖消毒處理的方法獲得無菌健康種莖，是田間防治該病害的有效方法之一。隨著木薯產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和木薯種質(zhì)資源交流日益頻繁，如何有效快速地進(jìn)行羅病種莖處理以獲得健康無病種莖成為當(dāng)前木薯細(xì)菌性萎蔫病防控中亟待解決的重要技術(shù)之一。因此本發(fā)明提出的通過有效藥劑浸泡以獲得無病種莖在木薯細(xì)菌性萎蔫病防控工作中具有廣泛的應(yīng)用前景。
目前，通過浸泡種子來預(yù)防病蟲害已經(jīng)在許多作物上得到成功應(yīng)用。但是，尚無關(guān)于采用藥劑浸泡種莖處理的方法來防治木薯病害的報道。目前，生產(chǎn)上急需通過木薯種莖藥劑浸泡處理方法和技術(shù)，獲得無病種莖并用于預(yù)防和減輕木薯細(xì)菌性萎蔫病的發(fā)生與為害。本發(fā)明基于以上設(shè)想進(jìn)行了運用有效藥劑浸泡罹病種莖來防治木薯細(xì)菌性萎蔫病的試驗，篩選出適宜浸泡藥劑并形成有效簡易的預(yù)防和防治該病害的浸泡種莖方法，以滿足木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展和木薯生產(chǎn)實際需求。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對木薯細(xì)菌性萎蔫病(地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種，xanthomonasaxonopodispv.manihotis(bondar)vauterin)已成為當(dāng)前為害我國木薯最為嚴(yán)重病害的實際與木薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展需求，目前產(chǎn)業(yè)上缺乏防治木薯細(xì)菌性萎蔫病的十分有效安全的防治技術(shù)，研發(fā)和提供一種簡易、有效的防治細(xì)菌性萎蔫病的浸泡種莖的方法。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種木薯細(xì)菌性萎蔫病(地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種，xanthomonasaxonopodispv.manihotis(bondar)vauterin)羅病種莖消毒方法。
該方法，包括將木薯種莖在質(zhì)量百分濃度為4％以下的甲醛溶液中浸泡20-90分鐘。
所述甲醛溶液的質(zhì)量百分濃度為4％、1％、0.4％的溶液。
所述浸泡液浸泡20-90分鐘。
優(yōu)選地，所述甲醛溶液的質(zhì)量百分濃度為0.4％、1％或4％，所述浸泡時間為20-90分鐘。如浸泡20分鐘或30分鐘。
所述甲醛溶液的質(zhì)量百分濃度為1％以下，優(yōu)選為0.4％以下。
更優(yōu)選地，所述甲醛溶液的質(zhì)量百分濃度為0.4％；所述浸泡時間為40-90分鐘，如浸泡40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘或90分鐘。
最優(yōu)選地，所述浸泡木薯種莖的甲醛溶液的質(zhì)量百分濃度為0.4％，所述浸泡時間是50-70分鐘，更優(yōu)選55-70分鐘，如，50分鐘、55分鐘、60分鐘或70分鐘，特別優(yōu)選為55-60分鐘。
所述方法包括，在使用時，浸泡液的具體的量(體積)應(yīng)不少于待處理的木薯種莖體積的1.5倍，并且能夠使待處理的木薯種莖(段)完全浸泡。木薯種莖可以整根浸泡后晾干再進(jìn)行砍種，也可將已砍好的種莖段裝網(wǎng)袋進(jìn)行浸泡；進(jìn)行木薯砍種時，將種莖砍成長度15-20cm長的種莖段，并保證每一個種莖段含有2至3個有效芽眼，以便進(jìn)行后續(xù)種植。
所述方法還包括使浸泡后的木薯種莖或莖段干燥的步驟。將經(jīng)過藥液浸泡處理后的種莖或種莖段取出，用水沖洗干凈殘留的藥液，自然晾干并放置2-3天，以利于木薯種莖殘留甲醛的揮發(fā)，并減少對操作人員健康的危害。
上述方法還包括對浸泡液無害化處理。種莖浸泡后的甲醛廢棄液可采用二氧化氯氧化法進(jìn)行無害化處理。
本發(fā)明的方法簡單易行，可有效地防止通過種莖攜帶木薯細(xì)菌性萎蔫病菌，降低病害發(fā)病率和田間病情指數(shù)，是防治木薯細(xì)菌性萎蔫病理想的木薯種莖浸泡液及種莖浸泡處理方法。
附圖說明
圖1為各藥劑處理對木薯種莖發(fā)芽的影響，a，0.4％甲醛溶液浸泡40分鐘；b，0.4％甲醛溶液浸泡50分鐘；c，0.4％甲醛溶液浸泡60分鐘；d，0.4％甲醛溶液浸泡70分鐘；e，0.4％甲醛溶液浸泡80分鐘；f，0.4％甲醛溶液浸泡90分鐘；g，自來水浸泡40分鐘；h，自來水浸泡90分鐘。
具體實施方式
實施例1、紙片法評價不同藥劑對木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的抑制效果
1、供試藥劑：共甲醛、過氧化氫、鹽酸、高錳酸鉀、乙蒜素、王銅等6種藥劑。供試藥劑使用濃度設(shè)置見表1，每種藥劑設(shè)5個濃度。采用系列濃度稀釋法，用水將40％甲醛溶液、50％雙氧水、36％的濃鹽酸、高錳酸鉀(化學(xué)純)、乙蒜素(80％乙蒜素ec，河南科邦化工有限公司生產(chǎn))，和王銅(30％氫氧化銅wp，廣東大豐植?？萍加邢薰?稀釋成所需濃度的藥液，備用。將濃度約為108cfu/ml的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌(地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種，xanthomonasaxonopodispv.manihotis(bondar)vauterin)(盧昕，李超萍，時濤，等.國內(nèi)木薯主產(chǎn)區(qū)細(xì)菌性枯萎病病原鑒定[j].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40(21)：84-87)懸浮液與溫度降至45℃左右的ypg固體培養(yǎng)基(配方：葡萄糖5g/l、蛋白胨5g/l、酵母提取物1g/l、牛肉浸膏3g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂15g/l，調(diào)整ph至7.0，121℃滅菌20min)混合均勻，每500mlypg固體培養(yǎng)基加入2ml細(xì)菌懸浮液，倒平板。將直徑6mm的滅菌濾紙置于直徑為9cm的含菌平板培養(yǎng)基表面，每皿放置3個紙片，分別取上述不同濃度的藥液10μl滴于紙片上，每個處理3次重復(fù)，以無菌水為對照。28℃下培養(yǎng)3天后十字交叉法測量抑菌圈直徑大小。
2、供試藥劑對木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的抑制效果
結(jié)果表明，甲醛溶液、雙氧水、鹽酸、乙蒜素等藥劑對細(xì)菌性萎蔫病菌具有一定的抑制效果，說明低濃度的甲醛溶液可作為木薯細(xì)菌性萎蔫病羅病種莖的候選消毒藥劑，可應(yīng)用于木薯細(xì)菌性萎蔫病的防治。
表16種藥劑對細(xì)菌性萎蔫病菌的抑制效果
實施例2、木薯罹病種莖消毒的消毒液配制及其消毒效果檢測
1、木薯種莖消毒的消毒液及其配制方法
試驗用的木薯羅病種莖(品種為桂熱4號)來自上一茬細(xì)菌性萎蔫病(地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種，xanthomonasaxonopodispv.manihotis(bondar)vauterin)重病地塊，田間發(fā)病率為100％。用自來水將40％甲醛溶液稀釋成終濃度為4％、1％和0.4％的甲醛溶液浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3，使木薯種莖在上述的3種濃度的浸泡液中分別浸泡20分鐘和30分鐘。將經(jīng)過浸泡處理的種莖取出，晾干后進(jìn)行砍種，使得每個種莖段長約15-20cm、含有2至3個有效芽眼，以進(jìn)行水培培養(yǎng)。7天后觀察浸泡液處理種莖的效果，包括種莖組織的活菌檢測和病菌pcr檢測、種莖段的發(fā)芽率及其長勢。每個處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)20個種莖段。
調(diào)查每個種莖段的發(fā)芽情況，計算發(fā)芽率；測量每個種莖段上最長嫩莖的長度，根據(jù)計算各處理平均值以衡量木薯長勢的差異。用sas9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析(阮敬.sas統(tǒng)計分析從入門到精通[m].北京：人民郵電出版社，2009.)。
浸泡處理后種莖攜帶活菌檢測，每個重復(fù)選取20個木薯種莖段進(jìn)行檢測，取3-5g木薯種莖葉痕和側(cè)芽，采用組織分離法進(jìn)行病菌的分離，經(jīng)表面消毒后，磨碎、稀釋涂板培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)48小時，觀察和記錄每個被檢測樣品木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的有無，計算活菌檢出率(％)。并用sas9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析(阮敬.sas統(tǒng)計分析從入門到精通[m].北京：人民郵電出版社，2009.)。
病菌pcr檢測，每個重復(fù)取20個木薯種莖段的葉痕和側(cè)芽進(jìn)行總dna提取。以純化后的總dna為模板，利用引物primer15-ttcggcaacggcagtgaccacc-3′和primer25-tcaatcggagattacctgagcg-3′對其進(jìn)行pcr擴(kuò)增，帶菌的組織可擴(kuò)增出一條898bp的dna片段；pcr反應(yīng)體系(25μl)：10×pcrbuffer2.5μl，mgcl2(5mmol/l)2.5μl，dntps(2.5mmol/l)1μl，primer1和primer2(10pmol/μl)各1μl，taq酶0.25μl，植物組織模板5μl，ddh2o補(bǔ)足25μl；pcr反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，95℃30s，61℃30s，72℃1.5min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min(封立平等，木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的檢疫方法研究[j]，植物檢疫，2007，21(5)：261-264)。最后采用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測：pcr擴(kuò)增可得到長約0.9kp(準(zhǔn)確為898bp)的擴(kuò)增條帶。當(dāng)種莖段不帶菌時，得不到任何擴(kuò)增條帶。通過觀察該特異性擴(kuò)增條帶的有無可判斷出種莖段是否攜帶有病原菌，計算病菌檢出率(％)，并用sas9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析(阮敬.sas統(tǒng)計分析從入門到精通[m].北京：人民郵電出版社，2009.)。
2、罹病種莖消毒效果
結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明，利用濃度為0.4％-4％甲醛溶液浸泡木薯細(xì)菌性萎蔫病羅病種莖20-30分鐘，可較為有效地減少羅病種莖的帶菌數(shù)量；而利用1％-4％甲醛溶液浸泡處理時，可造成木薯生長受到不同程度的抑制。說明木薯羅病種莖經(jīng)過0.4％甲醛溶液浸泡30分鐘以上處理，可對木薯細(xì)菌性萎蔫病羅病種莖進(jìn)行有效消毒。
表2不同浸泡處理的消毒效果與對木薯種莖發(fā)芽的影響
說明：表中每行數(shù)字后的小寫英文字母是每列的差異顯著性標(biāo)記，α＝0.05。
實施例3、木薯罹病種莖消毒方法的優(yōu)化
1、木薯罹病種莖消毒的消毒液及消毒方法
試驗用的木薯羅病種莖(品種為桂熱4號)來自上一茬細(xì)菌性萎蔫病重病地塊，田間發(fā)病率為100％。用自來水將40％甲醛溶液稀釋成終濃度為0.4％的甲醛溶液浸泡液，使木薯種莖在上述的3種濃度的浸泡液中分別浸泡40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘和90分鐘。按照實施例2中的方法進(jìn)行木薯培育、帶菌率檢測及長勢評價。
2、罹病種莖消毒方法優(yōu)化結(jié)果效果
結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明，利用0.4％甲醛溶液浸泡木薯細(xì)菌性萎蔫病羅病種莖40-90分鐘，均可有效減少羅病種莖的帶菌數(shù)量；而0.4％甲醛溶液浸泡處理時間大于70分鐘后，可造成木薯生長受到不同程度的抑制，莖桿萌發(fā)的嫩芽變短，葉片變小(見圖1)。說明木薯羅病種莖經(jīng)過0.4％甲醛溶液浸泡50-70分鐘處理，可對木薯細(xì)菌性萎蔫病羅病種莖進(jìn)行有效消毒。
表3不同浸泡處理的消毒效果與對木薯種莖發(fā)芽的影響
說明：表中每行數(shù)字后的小寫英文字母是每列的差異顯著性標(biāo)記，α＝0.05。
實施例4、木薯罹病種莖消毒的消毒方法的田間應(yīng)用效果評價
1、木薯罹病種莖消毒的消毒液及其配制方法
試驗用的木薯羅病種莖(品種為桂熱4號)來自上一茬細(xì)菌性萎蔫病重病地塊，田間發(fā)病率為100％；健康種莖(品種為桂熱4號)來自細(xì)菌性萎蔫病無病區(qū)地塊，田間調(diào)查時未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性萎蔫病的發(fā)生。用自來水將40％甲醛溶液稀釋成終濃度為0.4％的甲醛溶液浸泡液，使木薯羅病種莖在上述濃度的浸泡液中分別浸泡50分鐘、55分鐘、60分鐘、65分鐘和70分鐘，用自來水浸泡木薯羅病種莖和健康種莖70分鐘，同時以未進(jìn)行任何浸泡處理的健康種莖作為對照；處理后將種莖晾干后進(jìn)行砍種，使得每個種莖段長15-20cm(如20cm)、含有2至3個有效芽眼。
對各個處理的木薯種莖進(jìn)行種植，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)種植100株(株行距1m×1m)，小區(qū)間設(shè)3行保護(hù)行；所有處理的木薯栽培與肥水管理均采用統(tǒng)一的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。種植時間為2016年3月20日，植后45天調(diào)查木薯的出苗率(％)，調(diào)查每個小區(qū)所有木薯種莖的出苗情況。植后60天調(diào)查每個小區(qū)的所有植株是否發(fā)病，計算各個處理木薯的細(xì)菌性萎蔫病發(fā)病率(％)。根據(jù)田間病害監(jiān)測結(jié)果，在木薯細(xì)菌性萎蔫病發(fā)生初期6月10日、盛發(fā)期7月30日和木薯收獲期12月15日分別調(diào)查木薯細(xì)菌性萎蔫病的發(fā)生情況，病情調(diào)查采用五點取樣法對各個處理小區(qū)進(jìn)行調(diào)查，每個小區(qū)調(diào)查5個點，每個點3株木薯，共15株；在每株木薯的上、中、下部不同部位各取5張復(fù)葉，共取復(fù)葉15張。按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級：0級：無任何病斑；1級：病斑總面積占葉片總面積1/16以下；3級：病斑總面積占葉片總面積1/16～1/8；5級：病斑總面積占葉片總面積1/8～1/4；7級：病斑總面積占葉片總面積1/4～1/2；9級：病斑總面積占葉片總面積1/2以上或葉片變黃凋萎；按照以下公式計算各小區(qū)的病情指數(shù)。木薯收獲時，測定每個小區(qū)木薯的產(chǎn)量。用sas9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析(阮敬.sas統(tǒng)計分析從入門到精通[m].北京：人民郵電出版社，2009.)。
病情指數(shù)＝(σ各病級葉片數(shù)×相應(yīng)病級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高病害級數(shù))×100
2、種莖消毒效果
結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明，所有處理的木薯出苗率均為100；羅病種莖經(jīng)過0.4％甲醛溶液浸泡處理后，各個處理的木薯苗期發(fā)病率均顯著低于自來水浸泡處理的，其中，浸泡55、60、65和70分鐘處理的發(fā)病率均低于浸泡50分鐘處理的，與健康種莖的兩個處理相當(dāng)；隨后的3次田間病情調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各個甲醛浸泡處理的平均病情指數(shù)均顯著低于自來水浸泡處理的，其中，發(fā)病高峰期病情調(diào)查結(jié)果表明浸泡55、60、65和70分鐘處理的病情指數(shù)最低，與種植的健康種莖發(fā)病嚴(yán)重程度相當(dāng)；收獲期木薯產(chǎn)量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅病種莖經(jīng)甲醛浸泡處理后，產(chǎn)量均高于自來水浸泡處理的產(chǎn)量，其中經(jīng)過0.4％甲醛溶液浸泡55分鐘和60分鐘的產(chǎn)量最高，與種植健康種莖的產(chǎn)量差異不顯著。試驗結(jié)果表明，木薯羅病種莖經(jīng)過0.4％甲醛溶液浸泡55-60分鐘處理，可有效減輕田間細(xì)菌性萎蔫病的發(fā)生危害。
表4不同浸泡處理的消毒效果與對木薯生長的影響
以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。