本發(fā)明涉及環(huán)境工程微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種利用復(fù)合pahs降解菌同時(shí)去除植物體內(nèi)usepapahs的方法。

背景技術(shù)：

pahs是一種持久性、高風(fēng)險(xiǎn)有機(jī)污染物。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)已知的pahs多達(dá)幾百種，其中16種pahs由于存具有致畸和致突變性的“三致”效應(yīng)，被美國(guó)環(huán)保署列為優(yōu)先控制pahs。土壤是人類(lèi)賴(lài)以生存的重要自然資源之一。污水灌溉、大氣干濕沉降、等造成我國(guó)及全球土壤污染日趨嚴(yán)重。2014環(huán)境保護(hù)部、國(guó)土資源部發(fā)布的全國(guó)土壤污染調(diào)查公報(bào)顯示，全國(guó)土壤pahs點(diǎn)位超標(biāo)率1.4％。土壤受到污染后，pahs可在土壤-植物系統(tǒng)中遷移，進(jìn)而危及農(nóng)產(chǎn)品安全和人群健康。

目前常見(jiàn)的植物體內(nèi)有機(jī)污染物去除方法，主要通過(guò)物理或化學(xué)方法將土壤中pahs固定或降解，進(jìn)而阻控土壤中pahs向植物體內(nèi)的遷移。但物理或化學(xué)方法往往會(huì)對(duì)土壤造成次生污染，修復(fù)過(guò)程不易控制，大規(guī)模的應(yīng)用還需解決大量的問(wèn)題。生物降解pahs是一種高效環(huán)保的方式，但目前的研究主要集中于土壤中pahs去除和降解，植物體內(nèi)pahs去除和降解技術(shù)鮮有涉及。因此，通過(guò)將多株pahs降解菌復(fù)合，再重新定殖到污染植物體以降低植物pahs污染風(fēng)險(xiǎn)的一種可行的手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在填補(bǔ)利用復(fù)合功能菌同時(shí)去除和降解植物體內(nèi)usepapahs技術(shù)應(yīng)用的空白，提供一種利用復(fù)合pahs降解菌同時(shí)去除植物體內(nèi)usepapahs的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種利用復(fù)合pahs降解菌同時(shí)去除植物體內(nèi)美國(guó)環(huán)保署優(yōu)先控制多環(huán)芳烴(usepapolycyclicaromatichydrocarbons,usepapahs)的方法，所述方法是將復(fù)合功能菌制成微生物復(fù)合功能菌劑，并加入植物吸收促進(jìn)劑、細(xì)胞分裂素6-ba或kt、生長(zhǎng)素2,4-d、半胱氨酸，制成降解劑，然后接種于植物體內(nèi)，即可降低植物體內(nèi)pahs含量；

所述的復(fù)合功能菌是由8株降解譜不同的pahs降解菌組成，分別是：鞘脂菌屬(sphingobiumsp.rs1、rs2)、分枝桿菌屬(mycobacteriumsp.pyr9、033)、(diaphorobactersp.phe15)、馬賽菌屬(massiliasp.pn2)、類(lèi)芽孢桿菌屬(paenibacillussp.phe3)、假單胞菌屬(pseudomonassp.ph6)。

8株pahs降解菌皆能夠以pahs為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，菌株之間無(wú)拮抗現(xiàn)象，其拮抗試驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示。

8株pahs降解菌具有不同的降解譜，rs1、rs2可在不同程度上降解苊稀、菲、芘；pyr9、phe15為菲、芘降解菌；033可降解菲、蒽、熒蒽、苯并苝；pn2可降解萘、苊稀、菲、芘、苯并芘；phe3可降解萘、菲、芴、熒蒽、苯并芘；ph6可降解苊稀、菲；

所述微生物復(fù)合功能菌劑與所述植物吸收促進(jìn)劑、細(xì)胞分裂素6-ba或kt、生長(zhǎng)素2,4-d、半胱氨酸之間的配比為：(1×10⁶cfu-1×10⁷cfu):(0.2-0.5mg):(0.01-0.1mg):(0.03-0.2mg):(0.5-2mg)；將植物吸收促進(jìn)劑、細(xì)胞分裂素6-ba或kt、生長(zhǎng)素2,4-d、半胱氨酸依次加入到所述微生物復(fù)合功能菌劑中，攪拌速度為100-200r/min，攪拌時(shí)間為13-20min，即得到所述降解劑；

所述接種方式為浸種或噴葉，采用浸種方式接種后，對(duì)植物種子進(jìn)行連續(xù)紅光光照處理2-6天，采用噴葉方式接種后，對(duì)植物葉片進(jìn)行間隔紅光光照處理5-7天，每天的光照時(shí)長(zhǎng)為4-10h。

進(jìn)一步地，在上述方案中，所述微生物復(fù)合功能菌劑的制備方法為：將各菌種分別培養(yǎng)，然后調(diào)整各菌種od600nm混合制成微生物復(fù)合功能菌劑，具體包括以下步驟：

(1)菌懸液的制備：將8株pahs降解菌在lb固體平板進(jìn)行活化，用接種環(huán)從活化平板挑取各單菌落分別接種于無(wú)菌lb液體培養(yǎng)基中，置于30℃、150r/min擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)完成后，8000r/min4℃離心5min，棄去上清液，加入無(wú)菌msm使菌體混合均勻，再次離心，該操作重復(fù)兩次，以充分洗去菌體中殘留的lb培養(yǎng)基；最后用無(wú)菌msm調(diào)整菌懸液濃度od600nm分別為0.2、0.5、1.0、1.5；

(2)將獲得的菌懸液按等體積比混合，制得不同濃度od600nm復(fù)合降解菌儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆?；通過(guò)lb固體培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，每天觀察菌落變化及劃線(xiàn)交叉點(diǎn)處各細(xì)菌生長(zhǎng)情況，判斷不同菌株之間是否有拮抗，若交叉點(diǎn)處兩菌株均可生長(zhǎng)，則說(shuō)明二者之間無(wú)拮抗作用；反之則二者之間存在拮抗。

進(jìn)一步地，在上述方案中，所述復(fù)合功能菌濃度od600nm為0.2、0.5、1.0、1.5。

優(yōu)選地，所述復(fù)合功能菌懸液濃度od600nm為0.5。

進(jìn)一步地，在上述方案中，所述植物吸收促進(jìn)劑是由硫酸錳、天冬氨酸、琥珀酸三種成分按照3:4:1的重量比組成的混合物。

進(jìn)一步地，在上述方案中，所述浸種方式是指，播種前將植物種子在降解劑中浸泡6h；所述噴葉方式是指，待植物長(zhǎng)至一定大小時(shí)，在成熟前分三次將降解劑噴灑于植物葉片表面。噴灑時(shí)要在葉片的兩面都進(jìn)行噴灑，噴灑的距離≦5-8cm，噴灑時(shí)要避開(kāi)雨天和晴天，盡量選擇無(wú)風(fēng)的陰天。

所述的一種利用復(fù)合pahs降解菌同時(shí)去除植物體內(nèi)usepapahs的方法，所述的降解劑在降解水體、土壤或者植物體內(nèi)多環(huán)芳烴的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用，是指同時(shí)去除或降解9種及以上usepapahs。

本發(fā)明所述方法中：pahs為萘，苊烯，苊，芴，菲，蒽，熒蒽，芘，苯并[a]蒽，苯并[b]熒蒽，苯并[k]熒蒽，苯并[a]芘，二苯并[a,h]蒽，苯并[ghi]苝和茚并[1,2,3-cd]芘。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能夠有效的去除和降解污染區(qū)植物體內(nèi)萘，苊烯，苊，芴，菲，蒽，熒蒽，芘，苯并[a]蒽，苯并[b]熒蒽，苯并[k]熒蒽，苯并[a]芘，二苯并[a,h]蒽，苯并[ghi]苝和茚并[1,2,3-cd]芘，且pahs去除率高，本發(fā)明的方法具有高效、環(huán)保、易操作的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是菌株透射電鏡圖。

圖2是各菌株間競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此：實(shí)施例1：

將上海青種子接種復(fù)合功能菌，以降低其體內(nèi)的pahs含量。

制備微生物復(fù)合功能菌劑：

該復(fù)合功能菌是由8株降解譜不同的pahs降解菌組成，分別是：鞘脂菌屬(sphingobiumsp.rs1、rs2)、分枝桿菌屬(mycobacteriumsp.pyr9、033)、(diaphorobactersp.phe15)、馬賽菌屬(massiliasp.pn2)、類(lèi)芽孢桿菌屬(paenibacillussp.phe3)、假單胞菌屬(pseudomonassp.ph6)；

將各菌種分別培養(yǎng)，然后調(diào)整各菌種od600nm混合制成微生物復(fù)合功能菌劑，具體包括以下步驟：

(1)菌懸液的制備：將8株pahs降解菌在lb固體平板進(jìn)行活化，用接種環(huán)從活化平板挑取各單菌落分別接種于無(wú)菌lb液體培養(yǎng)基中，置于30℃、150r/min擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)完成后，8000r/min4℃離心5min，棄去上清液，加入無(wú)菌msm使菌體混合均勻，再次離心，該操作重復(fù)兩次，以充分洗去菌體中殘留的lb培養(yǎng)基；最后用無(wú)菌msm調(diào)整菌懸液濃度od600nm為0.2；

(2)將獲得的菌懸液按等體積比混合，制得濃度od600nm為0.2的復(fù)合降解菌儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆茫煌ㄟ^(guò)lb固體培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，每天觀察菌落變化及劃線(xiàn)交叉點(diǎn)處各細(xì)菌生長(zhǎng)情況，判斷不同菌株之間是否有拮抗，若交叉點(diǎn)處兩菌株均可生長(zhǎng)，則說(shuō)明二者之間無(wú)拮抗作用；反之則二者之間存在拮抗。

制備降解劑：將植物吸收促進(jìn)劑、細(xì)胞分裂素6-ba、生長(zhǎng)素2,4-d、半胱氨酸依次加入到微生物復(fù)合功能菌劑中，植物吸收促進(jìn)劑是由硫酸錳、天冬氨酸、琥珀酸三種成分按照3:4:1的重量比組成的混合物；微生物復(fù)合功能菌劑與植物吸收促進(jìn)劑、細(xì)胞分裂素6-ba、生長(zhǎng)素2,4-d、半胱氨酸之間的配比為：1×10⁶cfu:0.2mg:0.01mg:0.03mg:0.5mg；攪拌速度為100r/min，攪拌時(shí)間為13min，即得到降解劑。

然后通過(guò)浸種的方式將上海青種子接種復(fù)合功能菌，在播種前將上海青種子在降解劑中浸泡6h，接種后，對(duì)上海青種子進(jìn)行連續(xù)紅光光照處理2天，即可降低植物體內(nèi)pahs含量。

實(shí)施例2：

將上海青葉片接種復(fù)合功能菌，以降低其體內(nèi)的pahs含量。

制備微生物復(fù)合功能菌劑：

該復(fù)合功能菌是由8株降解譜不同的pahs降解菌組成，分別是：鞘脂菌屬(sphingobiumsp.rs1、rs2)、分枝桿菌屬(mycobacteriumsp.pyr9、033)、(diaphorobactersp.phe15)、馬賽菌屬(massiliasp.pn2)、類(lèi)芽孢桿菌屬(paenibacillussp.phe3)、假單胞菌屬(pseudomonassp.ph6)；

將各菌種分別培養(yǎng)，然后調(diào)整各菌種od600nm混合制成微生物復(fù)合功能菌劑，具體包括以下步驟：

(1)菌懸液的制備：將8株pahs降解菌在lb固體平板進(jìn)行活化，用接種環(huán)從活化平板挑取各單菌落分別接種于無(wú)菌lb液體培養(yǎng)基中，置于30℃、150r/min擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)完成后，8000r/min4℃離心5min，棄去上清液，加入無(wú)菌msm使菌體混合均勻，再次離心，該操作重復(fù)兩次，以充分洗去菌體中殘留的lb培養(yǎng)基；最后用無(wú)菌msm調(diào)整菌懸液濃度od600nm為0.2；

(2)將獲得的菌懸液按等體積比混合，制得濃度od600nm為0.2的復(fù)合降解菌儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆茫煌ㄟ^(guò)lb固體培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，每天觀察菌落變化及劃線(xiàn)交叉點(diǎn)處各細(xì)菌生長(zhǎng)情況，判斷不同菌株之間是否有拮抗，若交叉點(diǎn)處兩菌株均可生長(zhǎng)，則說(shuō)明二者之間無(wú)拮抗作用；反之則二者之間存在拮抗。

制備降解劑：將植物吸收促進(jìn)劑、細(xì)胞分裂素kt、生長(zhǎng)素2,4-d、半胱氨酸依次加入到微生物復(fù)合功能菌劑中，植物吸收促進(jìn)劑是由硫酸錳、天冬氨酸、琥珀酸三種成分按照3:4:1的重量比組成的混合物；微生物復(fù)合功能菌劑與植物吸收促進(jìn)劑、細(xì)胞分裂素kt、生長(zhǎng)素2,4-d、半胱氨酸之間的配比為：1×10⁷cfu:0.35mg:0.05mg:11mg:1.25mg；攪拌速度為150r/min，攪拌時(shí)間為16min，即得到降解劑。

然后通過(guò)噴葉的方式，待上海青長(zhǎng)至一定大小時(shí)，在成熟前分三次將降解劑噴灑于上海青葉片表面。噴灑時(shí)要在葉片的兩面都進(jìn)行噴灑，噴灑的距離為5cm，噴灑時(shí)要避開(kāi)雨天和晴天，盡量選擇無(wú)風(fēng)的陰天。接種后，對(duì)上海青葉片進(jìn)行間隔紅光光照處理6天，每天的光照時(shí)長(zhǎng)為7h，即可降低植物體內(nèi)pahs含量。

實(shí)施例3：

將上海青種子接種復(fù)合功能菌，以降低其體內(nèi)的pahs含量。

制備微生物復(fù)合功能菌劑：

該復(fù)合功能菌是由8株降解譜不同的pahs降解菌組成，分別是：鞘脂菌屬(sphingobiumsp.rs1、rs2)、分枝桿菌屬(mycobacteriumsp.pyr9、033)、(diaphorobactersp.phe15)、馬賽菌屬(massiliasp.pn2)、類(lèi)芽孢桿菌屬(paenibacillussp.phe3)、假單胞菌屬(pseudomonassp.ph6)；

將各菌種分別培養(yǎng)，然后調(diào)整各菌種od600nm混合制成微生物復(fù)合功能菌劑，具體包括以下步驟：

(1)菌懸液的制備：將8株pahs降解菌在lb固體平板進(jìn)行活化，用接種環(huán)從活化平板挑取各單菌落分別接種于無(wú)菌lb液體培養(yǎng)基中，置于30℃、150r/min擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)完成后，8000r/min4℃離心5min，棄去上清液，加入無(wú)菌msm使菌體混合均勻，再次離心，該操作重復(fù)兩次，以充分洗去菌體中殘留的lb培養(yǎng)基；最后用無(wú)菌msm調(diào)整菌懸液濃度od600nm分別為:0.5；

(2)將獲得的菌懸液按等體積比混合，制得濃度od600nm為0.5的復(fù)合降解菌儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆?；通過(guò)lb固體培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，每天觀察菌落變化及劃線(xiàn)交叉點(diǎn)處各細(xì)菌生長(zhǎng)情況，判斷不同菌株之間是否有拮抗，若交叉點(diǎn)處兩菌株均可生長(zhǎng)，則說(shuō)明二者之間無(wú)拮抗作用；反之則二者之間存在拮抗。

制備降解劑：將植物吸收促進(jìn)劑、細(xì)胞分裂素6-ba、生長(zhǎng)素2,4-d、半胱氨酸依次加入到微生物復(fù)合功能菌劑中，植物吸收促進(jìn)劑是由硫酸錳、天冬氨酸、琥珀酸三種成分按照3:4:1的重量比組成的混合物；微生物復(fù)合功能菌劑與植物吸收促進(jìn)劑、細(xì)胞分裂素6-ba、生長(zhǎng)素2,4-d、半胱氨酸之間的配比為：1×10⁷cfu:0.5mg:0.1mg:0.2mg:2mg；攪拌速度為200r/min，攪拌時(shí)間為20min，即得到降解劑。

然后通過(guò)浸種的方式將上海青種子接種復(fù)合功能菌，在播種前將上海青種子在降解劑中浸泡6h，接種后，對(duì)上海青種子進(jìn)行連續(xù)紅光光照處理6天，即可降低植物體內(nèi)pahs含量。

另外實(shí)施例4-16分別按照下述植物及od600nm復(fù)合功能菌濃度來(lái)對(duì)植物體內(nèi)pahs進(jìn)行去除，其它參數(shù)同實(shí)施例1相同(如表1所示)，植物生長(zhǎng)周期為45天，之后收獲植物進(jìn)行pahs檢測(cè)。

表1不同od600nm復(fù)合功能菌及接種方式對(duì)植物體內(nèi)pahs去除率的影響

待測(cè)植物的采集及其pahs含量的測(cè)定：

植物種子或幼苗通過(guò)上述浸種或噴葉方式接種復(fù)合功能菌，植物收獲后，用無(wú)菌水充分清洗植物表面，并用吸水紙吸干植物表面水分，將新鮮的植物樣品置于-40℃冷凍干燥后充分研磨，-20℃保存待測(cè)。

取上述制備好的植物樣品于20ml玻璃離心管中，加入10ml二氯甲烷，蓋緊后于超聲水浴中超聲萃取30min，以4000r·min^-1離心10min，取3ml上清液過(guò)層析柱(上層2g無(wú)水硫酸鈉，下層2g硅膠)凈化并用11ml1:1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脫；過(guò)柱后萃取液和洗脫液收集至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，40℃恒溫下濃縮至干，用甲醇潤(rùn)洗定容到2ml，過(guò)0.22μm孔徑有機(jī)相濾膜后，hplc/uv-fld分析。hplc/uv-fld分析條件：色譜柱為ф4.6×250mminertsilods-pahs專(zhuān)用反相色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水，采用梯度淋洗和紫外、熒光檢測(cè)器串聯(lián)的方法分離pahs。紫外和熒光檢測(cè)均采用波長(zhǎng)切換，并且紫外檢測(cè)器開(kāi)啟雙波長(zhǎng)檢測(cè)模式。流動(dòng)相流速為1.0ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量為20μl。總pahs去除率：

苯并[a]芘等效毒性(tefs)：

ci：植物體內(nèi)pahi含量；tefi：pahi苯并芘等效毒性當(dāng)量因子(見(jiàn)表2)

表2：多環(huán)芳烴的苯并[a]芘等效毒性當(dāng)量因子

測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3：

表3經(jīng)實(shí)施例1～16處理后植物體內(nèi)usepapahs去除率及苯并[a]芘等效毒性

由表3可知，實(shí)施例3、實(shí)施例11對(duì)上海青、小白菜usaepapahs去除率較高，苯并[a]芘等效毒性較低；實(shí)施例8、實(shí)施例16對(duì)上海青、小白菜usaepapahs去除率低，但苯并[a]芘等效毒性較低。實(shí)施例5植物體內(nèi)pahs去除率可達(dá)70％，但其苯并[a]芘等效毒性較高，且復(fù)合功能菌濃度od600nm較高。由實(shí)施例3和11可得出，本發(fā)明中優(yōu)先接種方式為浸種，復(fù)合功能菌濃度od600nm為0.5。

可見(jiàn)，本發(fā)明公布的一種利用復(fù)合pahs降解菌同時(shí)去除植物體內(nèi)usepapahs的方法，能夠有效的去除和降解植物體內(nèi)usepapahs，降低植物體內(nèi)pahs對(duì)人體毒害，去除率高達(dá)50％以上，且對(duì)土壤理化性質(zhì)無(wú)不良影響，具有環(huán)保、高效的特點(diǎn)。

根據(jù)以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的必要特性，并且在不背離其精神和范圍的情況下，可以做出本發(fā)明的多種變化和修改以使其適應(yīng)多種用途和情況。因此，其他實(shí)施方案也在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。