本發(fā)明涉及水稻種植領(lǐng)域，特別是涉及一種耐冷水稻的分子育種方法。

背景技術(shù)：

水稻低溫冷害在很多國家都普遍存在，全球有20多個國家存在嚴(yán)重的水稻低溫冷害問題，受到低溫冷害威脅的水稻面積超過1500萬hm²。中國的東北稻區(qū)低溫冷害較為嚴(yán)重，在中國南方，水稻前期受低溫影響，易造成爛種、爛秧、死苗，后期遇低溫影響正常抽穗結(jié)實(shí)，在中國，每年因低溫冷害使稻谷減產(chǎn)30-50億kg。因水稻低溫冷害分布廣危害大，危害水稻各生育時期，成為了水稻育種研究熱點(diǎn)，引起了世界各國水稻育種專家和研究單位的重視。

選育和推廣耐低溫品種是減少低溫冷害損失最經(jīng)濟(jì)有效的方法。但目前生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的雜交稻品種耐低溫能力普遍偏較差，嚴(yán)重影響了雜交稻增產(chǎn)潛力的發(fā)揮。究其原因，主要是水稻耐冷資源缺乏，難以育成耐冷性強(qiáng)的水稻新品種。資源材料是育種之母，多年的育種實(shí)踐已經(jīng)證明，狹窄的遺傳基礎(chǔ)已成為水稻耐冷育種難以取得突破的“瓶頸”，加速水稻耐冷材料的創(chuàng)制是解決“瓶頸”的關(guān)鍵。生命科學(xué)的發(fā)展日新月異，一些發(fā)達(dá)國家利用其擁有的技術(shù)和資金優(yōu)勢，將優(yōu)異耐冷水稻種質(zhì)的發(fā)掘和利用作為種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)，以便為水稻耐冷育種提供材料保障?？v觀我國水稻育種歷史和現(xiàn)狀，矮化育種和三系、兩系雜交水稻的突破，無一不是源于新種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。換句話說，一批新耐冷材料的育成，必將有一批耐冷優(yōu)良新品種誕生，水稻生產(chǎn)也隨之躍上一個新臺階。因此，加快稻種耐冷資源的引進(jìn)和評價，加強(qiáng)有利基因的導(dǎo)入，發(fā)掘和創(chuàng)造新的優(yōu)異耐冷種質(zhì)和育種中間材料，強(qiáng)化新的耐冷基因的挖掘及應(yīng)用，創(chuàng)制耐冷新材料，才能提高育成新品種的耐低溫能力。

創(chuàng)制水稻新材料的方法很多，利用耐冷水稻資源，采用傳統(tǒng)的雜交技術(shù)，通過雜交后代的選擇，可獲得耐冷材料，因不能克服生殖隔離，運(yùn)用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)創(chuàng)制優(yōu)異耐冷新材料難度較大，物理誘變育種技術(shù)，化學(xué)藥品處理創(chuàng)造新的突變體也可獲得耐冷水稻新材料，近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)等已成為創(chuàng)制耐冷水稻新材料的新方法，并在水稻耐冷材料創(chuàng)制和耐冷品種選擇取得了成功，不管采用什么方法，創(chuàng)制新材料，豐富耐冷資源，克服自然耐冷水稻資源匱乏難點(diǎn)，選育耐冷新品種，才是減少低溫冷害的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種耐冷水稻的分子育種方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中水稻的耐冷性差等問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種耐冷水稻的分子育種方法，包括如下步驟：

(1)以水稻恢復(fù)系為母本，以耐冷性水稻品系為父本，雜交，獲得雜交f1種子；

(2)以所述水稻恢復(fù)系為輪回親本與雜交f1回交，獲得回交一代群體bc1種子；

(3)培育bc1種子；

(4)從bc1株系中篩選出含有耐冷基因的株系，將所述株系與水稻恢復(fù)系回交，再自交，獲得含有耐冷基因的水稻品系。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述雜交f1種子與水稻恢復(fù)系回交4-6代后，再進(jìn)行自交。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述雜交f1種子與水稻恢復(fù)系回交4代后，再進(jìn)行自交。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟(4)中，將回交得到的水稻品系自交2-4代，獲得含有耐冷基因的水稻品系。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟(4)中，將回交得到的水稻品系自交2代，獲得含有耐冷基因的水稻品系。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述水稻恢復(fù)系選自蜀恢527。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述耐冷性水稻品系選自糯稻89-1。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟(4)中，在bc1的稻苗分蘗期，以所述耐冷性水稻品系為對照，利用耐冷基因連鎖標(biāo)記對回交一代群體表型與水稻恢復(fù)系相似的單株進(jìn)行分子標(biāo)記比對檢測，篩選出含有耐冷基因連鎖標(biāo)記的株系，將所述株系與水稻恢復(fù)系回交，再自交，對每個世代的株系逐級比對篩選，獲得含有耐冷基因的水稻品系。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟(4)中，分別提取所述耐冷性水稻品系和回交株系的基因組總dna，分別以與耐冷基因pog-2、qpog-3和qpog-7緊密連鎖的分子標(biāo)記rm250、rm5958、rm218、rm232、rm418和rm7110為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以所述耐冷性水稻品系為對照，對每個世代的株系逐級比對篩選，篩選出與對照分子標(biāo)記一致的株系。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm418序列如seqidno.1所示，反向引物rm418序列如seqidno.2所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm7110序列如seqidno.3所示，反向引物rm7110序列如seqidno.4所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm218序列如seqidno.5所示，反向引物rm218序列如seqidno.6所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm232序列如seqidno.7所示，反向引物rm232序列如seqidno.8所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm5958序列如seqidno.9所示，反向引物rm5958序列如seqidno.10所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm250序列如seqidno.11所示，反向引物rm250序列如seqidno.12所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，pcr反應(yīng)體系為25μl，包括10×pcrbuffer2.5μl、10mmdntp0.5μl、5u/μltaq酶0.25μl、引物2.0μl、dna模板2.0μl、ddh2o17.75μl。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，pcr的反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃5min，共35個循環(huán)，然后25℃10min。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟(4)中，通過芽期耐冷性鑒定和幼苗期耐冷性鑒定，篩選獲得耐冷水稻品系。

本發(fā)明第二方面提供由上述方法制得的耐冷水稻。

本發(fā)明第三方面提供一種雜交水稻，由上述耐冷水稻品系與水稻不育系雜交獲得。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述水稻不育系宜香a、中9a、金23a、ⅱ-32a、岡46a、珍汕97a中的至少一種。

本發(fā)明第四方面提供上述方法制得的耐冷水稻品系或雜交水稻品系。

本發(fā)明第五方面提供一種耐冷水稻的分子標(biāo)記檢測方法，包括如下步驟：

a)分別提取耐冷性水稻和待測水稻的基因組總dna；

b)分別以與耐冷基因pog-2、qpog-3和qpog-7緊密連鎖的分子標(biāo)記rm250、rm5958、rm218、rm232、rm418和rm7110為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以所述耐冷性水稻為對照，若待測水稻與對照分子標(biāo)記一致，表明耐冷基因的存在。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm418序列如seqidno.1所示，反向引物rm418序列如seqidno.2所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm7110序列如seqidno.3所示，反向引物rm7110序列如seqidno.4所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm218序列如seqidno.5所示，反向引物rm218序列如seqidno.6所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm232序列如seqidno.7所示，反向引物rm232序列如seqidno.8所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm5958序列如seqidno.9所示，反向引物rm5958序列如seqidno.10所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，正向引物rm250序列如seqidno.11所示，反向引物rm250序列如seqidno.12所示。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，pcr反應(yīng)體系為25μl，包括10×pcrbuffer2.5μl、10mmdntp0.5μl、5u/μltaq酶0.25μl、引物2.0μl、dna模板2.0μl、ddh2o17.75μl。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，pcr的反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃5min，共35個循環(huán)，然后25℃10min。

如上所述，本發(fā)明的一種耐冷水稻的分子育種方法，具有以下有益效果：本發(fā)明采用恢復(fù)系水稻與耐冷性水稻雜交，實(shí)現(xiàn)對農(nóng)藝性狀優(yōu)良而耐冷性差的親本材料的改良，將耐冷基因高效地轉(zhuǎn)移至回交后代中，從而創(chuàng)制出耐冷水稻新材料。

附圖說明

圖1顯示為rm418在bc1的分子檢測結(jié)果

圖2顯示為rm7110在bc2的分子檢測結(jié)果。

圖3顯示為rm218在bc3的分子檢測結(jié)果。

圖4顯示為rm5958在bc4的分子檢測結(jié)果。

圖5顯示為rm232在bc4f1的分子檢測結(jié)果。

圖6顯示為rm250在bc4f2的分子檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

須知，下列實(shí)施例中未具體注明的工藝設(shè)備或裝置均采用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)設(shè)備或裝置；所有壓力值和范圍都是指絕對壓力。

此外應(yīng)理解，本發(fā)明中提到的一個或多個方法步驟并不排斥在所述組合步驟前后還可以存在其他方法步驟或在這些明確提到的步驟之間還可以插入其他方法步驟，除非另有說明；還應(yīng)理解，本發(fā)明中提到的一個或多個設(shè)備/裝置之間的組合連接關(guān)系并不排斥在所述組合設(shè)備/裝置前后還可以存在其他設(shè)備/裝置或在這些明確提到的兩個設(shè)備/裝置之間還可以插入其他設(shè)備/裝置，除非另有說明。而且，除非另有說明，各方法步驟的編號僅為鑒別各方法步驟的便利工具，而非為限制各方法步驟的排列次序或限定本發(fā)明可實(shí)施的范圍，其相對關(guān)系的改變或調(diào)整，在無實(shí)質(zhì)變更技術(shù)內(nèi)容的情況下，當(dāng)亦視為本發(fā)明可實(shí)施的范疇。

下述實(shí)施例設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值，實(shí)驗(yàn)方法，無特殊說明，均為常規(guī)方法，如分子標(biāo)記篩選所用的pcr反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，分子試驗(yàn)所用的試驗(yàn)材料，均為常規(guī)生化試劑，可到生化試劑代理商或試劑店購買。所用親本材料蜀恢527和糯稻89-1可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所品種資源庫購買。配組雜交組所用的宜香a、中9a、金23a、ⅱ-32a、岡46a、珍汕97a6個不育系均為廣泛應(yīng)用的普通材料，可從農(nóng)業(yè)科研單位、高等院校及種子企業(yè)購買，在中國國家水稻數(shù)據(jù)中心也可查找。

需要說明的是，親本不限于蜀恢527和糯稻89-1，也可采用其他親本恢復(fù)系與耐冷系雜交，雜交f1種子與水稻恢復(fù)系回交的代數(shù)可以為4-6代，具體根據(jù)水稻恢復(fù)系的性狀轉(zhuǎn)移至耐冷水稻品系的程度而定，本實(shí)施例以回交4代為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)，回交4代后，水稻恢復(fù)系的性狀被充分轉(zhuǎn)移至耐冷水稻品系?；亟缓螅屠渌酒废档淖越淮鷶?shù)可以為2-4代，具體自交代數(shù)根據(jù)品系性狀的穩(wěn)定程度而定，自交至品系性狀穩(wěn)定即可，本實(shí)施例以自交2代為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

詳細(xì)技術(shù)說明如下：

一、親本材料。水稻耐冷材料糯稻89-1：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物種質(zhì)資源庫，統(tǒng)一編號zd06709。糯稻89-1能通過腋芽抗御低溫休眠越冬，多年萌發(fā)再生，越冬稻苗生長整齊，產(chǎn)量與正季相當(dāng)，可達(dá)6.29t/hm²，芽期和幼苗期的耐冷性均達(dá)到1級耐冷標(biāo)準(zhǔn)，攜有qpog-2,qpog-3和qpog-7三個耐冷基因。水稻恢復(fù)系蜀恢527：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物種質(zhì)資源庫，統(tǒng)一編號32-00115。蜀恢527用1318與88-r3360雜交育成，1318系四川農(nóng)業(yè)大學(xué)用強(qiáng)恢復(fù)系材料圭630、古154和抗稻瘟病的ir1544-28-2-3聚合雜交育成的抗稻瘟病的重穗型恢復(fù)材料；88-r3360系米質(zhì)較優(yōu)的輻36-2與ir24雜交育成的優(yōu)質(zhì)強(qiáng)恢復(fù)力材料。

二、逐級分子篩選技術(shù)。提取糯稻89-1及蜀恢527與糯稻89-1雜交后的回交世代(bc1、bc2、bc3、bc4、bc4f1、bc4f2)株系的基因組總dna，分別以與越冬耐冷基因pog-2,qpog-3和qpog-7緊密連鎖的分子標(biāo)記rm250、rm5958、rm218、rm232、rm418和rm7110為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以糯稻89-1為對照，每個回交世代的株系逐級比對篩選，選擇出與對照分子標(biāo)記一致的株系。擴(kuò)增反應(yīng)混合液體積為25μl，其中10×pcrbuffer2.5μl，10mmdntp0.5μl，5u/μltaq酶0.25μl，引物2.0μl，dna模板2.0μl，ddh2o17.75μl。pcr的反應(yīng)參數(shù)為：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃5min，共35個循環(huán)，然后25℃10min。pcr擴(kuò)增完畢后，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行3％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄電泳結(jié)果。關(guān)于耐冷基因pog-2,qpog-3和qpog-7的報道，詳見：identificationofquantitativetraitlocusforoverwinteringgerminabilityinrice(oryzasatival.),zhaozheng-wu,luoan-cai1,letaoandlishi-gui.journalofintegrativeagriculture.2012,11(11):1767-1774.

具體的篩選方法如下：

1、回交群體耐冷材料逐級分子篩選

(1)以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的恢復(fù)系蜀恢527為母本，以耐冷性強(qiáng)的糯稻89-1為父本雜交，獲得雜交f1種子200粒。

(2)以恢復(fù)系蜀恢527為輪回親本與雜交f1回交，獲得回交一代群體(bc1)種子12000粒。

(3)將bc1按20×30cm規(guī)格種植，每行種植12窩，每窩種植1粒谷秧，共種植10000窩，走道50cm。

(4)在稻苗分蘗期，以耐冷親本糯稻89-1為對照，利用耐冷基因連鎖標(biāo)記6個(見表1)對回交一代群體表型與蜀恢527相似的單株進(jìn)行分子標(biāo)記比對檢測，篩選出含有耐冷基因連鎖標(biāo)記的單株100株，與蜀恢527回交獲得回交二代群體(bc2)種子6000粒。

表1本發(fā)明耐冷基因連鎖標(biāo)記引物序列組成如下表所示：

(5)按步驟(3)種植bc25000窩，按步驟(4)篩選出含有耐冷基因連鎖標(biāo)記的單株50株，與蜀恢527回交獲得回交三代群體(bc3)種子3000粒。

(6)按步驟(3)種植bc32000窩，按步驟(4)篩選出含有耐冷基因連鎖標(biāo)記的單株50株，與蜀恢527回交獲得回交四代群體(bc4)種子2000粒。

(7)按步驟(3)種植bc41500窩自交，按步驟(4)篩選出含有耐冷基因連鎖標(biāo)記的單株50株，獲得回交四代自交一代(bc4f1)種子1000粒。

(8)按步驟(3)種植bc4f1500窩自交，按步驟(4)篩選出含有耐冷基因連鎖標(biāo)記的單株10株，收取回交四代自交二代(bc4f2)種子1000粒。

2、耐冷材料的表型篩選鑒定

通過分子篩選技術(shù)逐級選擇至回交四代自交二代(bc4f2)的耐冷材料，進(jìn)行芽期和苗期耐冷性鑒定，通過分子標(biāo)記和表型鑒定雙重篩選，創(chuàng)制耐冷材料。

具體步驟如下：

(1)芽期耐冷性鑒定。試驗(yàn)前將步驟1(8)所得的回交四代自交二代(bc4f2)種子置入烘箱45℃烘48小時，使其充分干燥，將100粒飽滿種子放入盛水的100ml燒杯，浸種1天，用自來水洗滌3-4次，傾去水，將種子均勻置入培養(yǎng)皿中，用軟紙覆蓋，在30℃催芽2-3天，催芽后再用自來水洗滌1-2次，加水少許，將培養(yǎng)皿置于5℃的冰箱內(nèi)處理10天，從冰箱取出置于室外，溫度低于30℃，恢復(fù)生長10天后進(jìn)行耐寒性評級，評級標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2水稻芽期和苗期耐冷性分級標(biāo)準(zhǔn)

(2)幼苗期耐冷性鑒定。取步驟1(8)所得的回交四代自交二代(bc4f2)種子，在常溫下生長至3-4葉齡，取50個單株秧苗放置在5-12℃低溫下處理7天。根據(jù)幼苗的赤枯程度進(jìn)行評級(0-9)，評級標(biāo)準(zhǔn)見表2。

3、雜交組合的耐冷性鑒定。利用步驟1和2篩選鑒定出的耐冷材料以及蜀恢527與多個不育系測配，配制雜交組合，按步驟2中的小步驟(1)和(2)的方法對雜交組合進(jìn)行耐冷性鑒定。

具體地，用bc4f2與宜香a、中9a、金23a、ⅱ-32a、岡46a、珍汕97a配組雜交組合，并進(jìn)行芽期和苗期耐冷性鑒定，bc4f2與6個不育系配制的雜交組合芽期和苗期的耐冷性均高于蜀恢527所配組合，耐冷性高1-2個等級，其中，中9a/bc4f2、金23a/bc4f2、岡46a/bc4f2、珍汕97a/bc4f2四個組合耐冷性最強(qiáng)，芽期和苗期均為三級。

本實(shí)施例選用農(nóng)藝性狀優(yōu)良的恢復(fù)系蜀恢527為母本，以攜有越冬耐冷基因的糯稻89-1為父本雜交獲得雜交f1種子，以恢復(fù)系蜀恢527為輪回親本與雜交f1回交，獲得回交一代群體(bc1)種子12000粒，種植bc1群體10000株，以耐冷親本糯稻89-1為對照，利用耐冷基因連鎖標(biāo)記rm418、rm7110、rm218、rm232、rm5958、rm250對回交一代群體表型與蜀恢527相似的單株進(jìn)行分子標(biāo)記比對檢測(以后每個回交和自交世代均進(jìn)行比對檢測)，篩選出含有耐冷基因連鎖標(biāo)記的單株100株，逐級回交至回交四代群體(bc4)，再自交二代，收取回交四代自交二代(bc4f2)種子1000粒，分別用300粒bc4f2種子及親本鑒定芽期和苗期耐冷性，每個處理100粒，三次重復(fù)，鑒定結(jié)果表明bc4f2芽期和苗期耐冷性分別為3級和1級，糯稻89-1芽期和苗期耐冷性均為1級，蜀恢527芽期和苗期耐冷性分別為9和7級。用bc4f2與宜香a、中9a、金23a、ⅱ-32a、岡46a、珍汕97a配組雜交組合，并進(jìn)行耐冷性鑒定，結(jié)果見表3。

表3bc4f2和蜀恢527雜交后代芽期和苗期耐冷性鑒定結(jié)果

從表3可以看出，bc4f2與不育系雜交后，獲得的水稻品系的耐冷級別明顯高于蜀恢527與不育系雜交后獲得的水稻品系的耐冷級別，而產(chǎn)量上并沒有明顯下降，說明本發(fā)明在顯著提高耐冷性的同時，還保證了水稻良好的產(chǎn)量。

本實(shí)施例對回交群體和自交群體耐冷材料逐級分子篩選，通過對耐冷材料及其雜交后代耐冷性的表型篩選鑒定，實(shí)現(xiàn)對農(nóng)藝性狀優(yōu)良而耐冷性差的親本材料的改良；通過分子標(biāo)記和表型鑒定雙重篩選，選擇效果準(zhǔn)確可靠。

圖1-圖6所示為rm標(biāo)記在回交及自交后代檢測結(jié)果中的代表性圖譜，如圖1所示為rm418在bc1的分子檢測結(jié)果(編號1為耐冷親本糯稻89-1的電泳條帶，其它編號為bc1株系的電泳條帶)，如圖2所示為rm7110在bc2的分子檢測結(jié)果，如圖3所示為rm218在bc3的分子檢測結(jié)果，如圖4所示為rm5958在bc4的分子檢測結(jié)果，如圖5所示為rm232在bc4f1的分子檢測結(jié)果，如圖6所示為rm250在bc4f2的分子檢測結(jié)果。各世代耐冷株系篩選時，涉及的條帶較多，圖1-圖6所示僅為其中一部分代表性條帶。

本實(shí)施例中，所述的逐級分子篩選是指以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的恢復(fù)系蜀恢527為母本，以耐冷性強(qiáng)的糯稻89-1為父本雜交，獲得雜交f1種子后，以恢復(fù)系蜀恢527為輪回親本與雜交f1回交，從回交一代群體(bc1)開始，回交至四代群體(bc4)，然后再自交兩代(bc4f2)，在逐級回交群體中，通過群體單株與耐冷性強(qiáng)的糯稻89-1分子標(biāo)記的比對，篩選出耐冷材料，同時，通過群體單株與蜀恢527在田間優(yōu)良農(nóng)藝性狀的比對選擇來取舍耐冷材料。利用優(yōu)異水稻耐冷資源，挖掘新基因，采用回交群體耐冷材料逐級分子篩選，并且，還可以對耐冷材料及其雜交后代耐冷性的表型進(jìn)行鑒定，實(shí)現(xiàn)耐冷基因高效轉(zhuǎn)移，從而創(chuàng)制出耐冷水稻新材料。

綜上所述，本實(shí)施例以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的恢復(fù)系蜀恢527為母本，以耐冷性強(qiáng)的糯稻89-1為父本雜交，獲得雜交f1種子后，以恢復(fù)系蜀恢527為輪回親本與雜交f1回交，從回交一代群體(bc1)開始，回交至四代群體(bc4)，然后再自交兩代(bc4f2)，在逐級回交群體中，通過群體單株與耐冷性強(qiáng)的糯稻89-1分子標(biāo)記的比對，篩選出耐冷材料；耐冷材料的表型篩選鑒定：對分子選擇鑒定結(jié)果較好的材料進(jìn)行芽期和苗期耐冷性鑒定，通過分子標(biāo)記和表型鑒定雙重篩選，創(chuàng)制耐冷材料；雜交組合的耐冷性鑒定；利用篩選鑒定出的耐冷材料以及蜀恢527與多個不育系測配，配制雜交組合，并鑒定其耐冷性，比對創(chuàng)制材料的耐冷效果。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明采用恢復(fù)系水稻與耐冷性水稻雜交，實(shí)現(xiàn)對農(nóng)藝性狀優(yōu)良而耐冷性差的親本材料的改良，將耐冷基因高效地轉(zhuǎn)移至回交后代中，從而創(chuàng)制出耐冷水稻新材料。

上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。

sequencelisting

<110>重慶師范大學(xué)

<120>一種耐冷水稻的分子育種方法

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