專利名稱：轉(zhuǎn)入c的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生理育種領(lǐng)域，尤其是一種使C4植物PEPC基因轉(zhuǎn)入水稻后達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)的育種技術(shù)。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)六十年代，由于半矮桿基因的利用，水稻由高桿變?yōu)榘珬U，由于增加了收獲指數(shù)、抗倒伏能力和群體光合能力，使水稻產(chǎn)量增加20％。據(jù)預(yù)測，到2030年，我國人口將達(dá)到16億，這要求水稻的單產(chǎn)在2000年基礎(chǔ)上增加30％才能滿足社會的需要。但經(jīng)過矮化育種和雜種優(yōu)勢利用兩次大的突破后，目前水稻產(chǎn)量已達(dá)較高水平，通過常規(guī)育種方法提高產(chǎn)量難度極大。
光合作用是指綠色植物利用日光能將二氧化碳(CO2)和水(H2O)制造成有機(jī)物的過程，這是作物高產(chǎn)的生理基礎(chǔ)。據(jù)估計(jì)，作物干物質(zhì)的90％來源于光合作用。因而長期以來，世界各國科學(xué)家就企圖通過改良作物的光合作用，以達(dá)到提高農(nóng)作物產(chǎn)量水平的目的，這一直是國際光合和育種專家關(guān)注的前沿科學(xué)問題。
水稻是世界主要糧食作物之一，全世界有120個國家種植水稻。在我國，水稻的栽培面積占糧食作物的30％，而產(chǎn)量卻占糧食總產(chǎn)的40％，約有50％的人口以水稻為主食。因而改善水稻光合作用，提高水稻的產(chǎn)量水平，在理論上和實(shí)踐上均具有非常重要的意義。
依據(jù)光合作用途徑，可以把植物分為C3植物和C4植物兩種主要類型，其中玉米、高粱、甘蔗等為C4植物，而水稻、小麥、大豆等為C3植物。在連續(xù)強(qiáng)光、低CO2、干旱等條件下，C3植物光合機(jī)構(gòu)就會受到傷害，短時間引起光合能力下降，這稱為“光抑制”。長時間則會進(jìn)一步造成光合色素破壞，即發(fā)生“光氧化”，這種生理病害，會影響作物的光合能力和光合效率，從而降低產(chǎn)量。而C4植物由于有C4光合途徑，具CO2濃縮機(jī)制，在高光、高溫，低CO2和干旱的條件下，比C3植物具有較高的光合效率和抗逆性。因此，自從二十世紀(jì)六十年代發(fā)現(xiàn)C4植物內(nèi)的C4光合途徑以來，人們就嘗試將C4植物優(yōu)良的光合特性轉(zhuǎn)移到C3植物中，以提高C3植物的光合效率，并最終達(dá)到提高產(chǎn)量的目的。但因C4植物和C3植物雜交屬遠(yuǎn)源雜交，存在交配不親和性和雜種不育等難題，雖經(jīng)多年研究但收效甚微?？梢?，通過常規(guī)雜交方法向C3植物中導(dǎo)入C4植物高光合效率遺傳物質(zhì)可能性很小。
近二十年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，對植物光合作用有了較深入的了解，并對C4植物和C3植物光合作用的關(guān)鍵酶基因在分子水平上進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)它們光合作用關(guān)鍵酶，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因具有較高的同源性，從而啟迪科學(xué)家通過基因工程方法將C4植物高光合效率基因?qū)胨?。最近，世界著名光合專家美國華盛頓州立大學(xué)古森本教授將玉米PEPC基因轉(zhuǎn)入水稻中，并獲得高效表達(dá)，個別轉(zhuǎn)基因水稻的PEPC酶活性是對照的20-40倍。這說明通過基因工程方法導(dǎo)入C4植物光合作用關(guān)鍵酶基因，可以獲得高效表達(dá)植株。
但是，美國學(xué)者獲得的轉(zhuǎn)玉米PEPC基因水稻是以日本水稻品種Kittake為受體的，生育期短(在南京種值全生育期僅90天)，在我國的應(yīng)用受到限制，而且低世代遺傳特性尚不穩(wěn)定。另外用轉(zhuǎn)基因技術(shù)由于分子檢測耗資甚巨，在目前用于育種尚有困難。因而，發(fā)明一種能夠快速轉(zhuǎn)移玉米PEPC基因及其生理性狀的技術(shù)方法，并利用這一技術(shù)創(chuàng)制高光合效率抗逆的水稻，是目前水稻育種迫切需要解決的一個難題。
花藥培養(yǎng)技術(shù)是上世紀(jì)60年代發(fā)展起來的育種技術(shù)，目前已成為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。該技術(shù)的要點(diǎn)是將雜種的F1代的花藥離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織，并分化為單倍體植株，經(jīng)染色體人工加倍或自然加倍后形成二倍體植株。這種二倍體植株是純合的、且可以穩(wěn)定傳遞其遺傳信息。其優(yōu)點(diǎn)是育種速度快，節(jié)約了時間，提高了育種效率，因而花藥培養(yǎng)技術(shù)在水稻育種中得到廣泛應(yīng)用，但目前國內(nèi)外還沒有人將該技術(shù)應(yīng)用于高光合效率、抗逆水稻的育種研究中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于將二十世紀(jì)六十年代發(fā)展起來的花藥培養(yǎng)這一育種技術(shù)應(yīng)用于高光合效率、抗逆水稻的育種中，提供一種將美國學(xué)者獲得的轉(zhuǎn)玉米PEPC基因日本品種Kittake為受體品種的轉(zhuǎn)基因水稻與我國水稻品種9516雜交后采用花藥培養(yǎng)技術(shù)，獲得高光合效率、抗逆、高產(chǎn)水稻新品種的育種技術(shù)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)入C4植物PEPC基因的水稻能穩(wěn)定表達(dá)的育種技術(shù)，其特征在于對轉(zhuǎn)入PEPC基因的水稻連續(xù)繁殖四代；對第四代種子全部進(jìn)行定向篩選；將篩選后的PEPC活性高的種子加代繁殖到第七代，選擇出穩(wěn)定高光合效率的水稻種質(zhì)；以穩(wěn)定高光合效率的水稻種質(zhì)為父本，以高產(chǎn)、株型好的水稻為母本進(jìn)行雜交；將雜交后的F1代進(jìn)行花藥培養(yǎng)，獲得具有C4植物PEPC基因穩(wěn)定表達(dá)的水稻種質(zhì)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于克服雜交育種的不足，發(fā)揮花藥培養(yǎng)的特長，形成一種高效快速的育種新技術(shù)。例如若將具有C4植物高光合效率等優(yōu)良生理性狀的水稻與高產(chǎn)株型好的水稻采用雜交方式育種，其后代遺傳不穩(wěn)定，會出現(xiàn)性狀分離，要想獲得優(yōu)良品種，往往需要6～8代，甚至更長時間，同時，在每代培育之間，都要對大量分離群體各單株進(jìn)行測定，工作量大，此外，植物的生物狀態(tài)往往受內(nèi)因和外因的影響，且生理測定往往采用抽樣測定，這樣在各代繁殖的過程中，個別優(yōu)良生物性狀丟失。而花藥培養(yǎng)采用的是花藥離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織，分化成單倍體植株，經(jīng)人工加倍或自然加倍形成二倍體植株，這種二倍體植株是純合的，且可以穩(wěn)定其遺傳信息，其優(yōu)點(diǎn)是育種速度快(兩年內(nèi)可形成穩(wěn)定材料)，同時，花藥培養(yǎng)后代是以株系為單位，減少了生理測定工作量，提高了選擇的準(zhǔn)確性和育種效率。
具體實(shí)施例方式
1、高光合效率、抗逆穩(wěn)定株系的篩選鑒定1996年我們引入將玉米PEPC基因轉(zhuǎn)入日本Kittake水稻的H1代種子，光合生理指標(biāo)與原種相比，表現(xiàn)光合作用的氧抑制少，且種子形態(tài)與原種差別不大。
1997年將H2代轉(zhuǎn)基因水稻種子在江蘇南京種植，為了加快繁殖速度，將收獲的H3代種子在海南島進(jìn)行種植，全部收獲H4種子。1998年5月于水稻生長正季播種轉(zhuǎn)玉米PEPC基因H4代種子，并定向篩選。按穗選粒種種植，其基因的表達(dá)出現(xiàn)分離，我們用以下方法逐一進(jìn)行鑒定，以PEPC活性為基因表達(dá)酶量的鑒定方法，并結(jié)合酶表達(dá)量的鑒定方法-Westerblot印跡法，選擇出比原種水稻PEPC酶活性Kittake高20倍株系。并且進(jìn)一步在抽穗期在高光(1400μmolms)和高溫(35℃)下測定劍葉的光合生理指標(biāo)，如飽和光合速率，羧化效率及CO2補(bǔ)償點(diǎn)，選擇飽和光合速率提高55％，羧化效率提高50％及CO2補(bǔ)償點(diǎn)降低23％，PEPC活性在1400μmol/mg-1h-1左右的高光效高表達(dá)的材料，進(jìn)一步田間生產(chǎn)觀察，選擇分蘗性好，大穗大粒的植株。通過大量鑒定表明，PEPC活性和飽和光合速度率成正相關(guān)，R＝0.666，因此確定PEPC酶活性并結(jié)合飽和光合速度率測定作為下一代高光合效率的生理指標(biāo)。
從H5代選擇的高光合效率的水稻株系，1998年冬進(jìn)一步在海南加代繁殖，1999年4月在江蘇南京正季種植H7代轉(zhuǎn)基因種子，經(jīng)隨機(jī)抽樣，選擇20株H6代材料，鑒定其基因表達(dá)和光合能力，結(jié)果表明我們定向選擇的H7代轉(zhuǎn)PEPC基因種質(zhì)，在高光高溫條件下，PEPC活性比原種提高20倍，且飽和光合速率提高55％，羧化效率提高50％及CO2補(bǔ)償點(diǎn)降低23％，證明這一高光效基因在水稻穩(wěn)定表達(dá)，且表現(xiàn)高光合效率(見表1)。
表1、轉(zhuǎn)達(dá)PEPC水稻及原種的PEPC活性和光合生理指標(biāo)a)

a)光飽和光合效率在光強(qiáng)1200μmol/m-2s下測定適溫下光合速率在35℃下測定，PEPC活性飲和光合速率為平均值SE，n＝30，適溫下光合速率、羧化效率、CO2補(bǔ)償點(diǎn)2、高光合效率抗逆性狀向我國優(yōu)良水稻9516的轉(zhuǎn)移1999年，我們利用選擇出的穩(wěn)定高光合效率水稻種質(zhì)(以下簡稱HPTER)作為父本，以9516為母本，用常規(guī)雜交方法，在抽穗期，對9516稻穗進(jìn)行溫湯去雄(45℃，處理5分鐘)，再授予高合光效率水稻的花粉，獲得其283粒雜種F1代種子。
2000年在水稻生長正季種植，發(fā)現(xiàn)在F1代中PEPC酶活性(反映高光合效率基因表達(dá)能力)呈正態(tài)分布。證明可以用常規(guī)雜交的技術(shù)將高光合性狀傳遞到F1代中，選擇出PEPC活性在1000μmol/m2s，且光合速率提高50％的F1雜種。
3、高光合效率水稻的F1代的花藥培養(yǎng)為了快速穩(wěn)定高光合效率的性狀，對9516/HPTER的F1進(jìn)行花藥培養(yǎng)。選用處于單核期的水稻穗(此期具有較高的得苗率)，接種在M8基礎(chǔ)的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。待愈傷組織長到3mm左右時，轉(zhuǎn)到MS為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基上分化成苗。獲得189叢綠苗(見表2)。
表2水稻花藥培養(yǎng)情況

在進(jìn)行花藥培養(yǎng)的過程中，我們使用的誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基配方為M8+2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1mg/L6-BA+50g/L蔗糖+7g/L瓊脂。
采用的愈傷組織分化培養(yǎng)基配方為MS+2mg/L6-BA+1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/瓊脂。
將所獲得的花培苗于2000年底送去海南種植，2001年4月?lián)仓甑耐獠啃螒B(tài)確定單倍體(植株小、穎殼小、不結(jié)實(shí))、二倍體(結(jié)實(shí)正常)和多倍體(植株較大、穎殼大、有芒、不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)極低)。在189株花培苗中，有124株二倍體，并從124株二倍體中收獲得到具有C4植物PEPC基因穩(wěn)定表達(dá)的水稻種質(zhì)。
4優(yōu)良高光合效率穩(wěn)定株系的鑒定2001年正季將124個二倍體株系種于南京江蘇農(nóng)科院試驗(yàn)田，于8月份測定各株系的PEPC活性，并進(jìn)行農(nóng)藝性觀察，收獲后考察各株系的性狀。我們共計(jì)測定了71株系，鑒定出11個高PEPC活性的株系。經(jīng)田間觀察和收獲后農(nóng)藝性狀考察選出1個農(nóng)藝性狀優(yōu)良，并具有高PEPC活性，高光合能力的穩(wěn)定株系，我們自定義為H015，經(jīng)小面積田間考察，比對照9516增產(chǎn)30.0％(見表3)。
表3、9516和花培株系H015農(nóng)藝性狀考察

權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)入C4植物PEPC基因的水稻能穩(wěn)定表達(dá)的育種技術(shù)，其特征在于a、對轉(zhuǎn)入C4植物PEPC基因的水稻連續(xù)繁殖四代；b、對第四代全部種子進(jìn)行定向篩選；c、對定向篩選后的PEPC活性高的種子加代繁殖到第七代，選擇出穩(wěn)定高光合效率的水稻種質(zhì)；d、以穩(wěn)定高光合效率的水稻種質(zhì)為父本，以產(chǎn)量高、株型好的水稻品種為母本，進(jìn)行雜交；e、將雜交F1代進(jìn)行花藥培養(yǎng)，獲得具有C4植物PEPC基因穩(wěn)定表達(dá)的水稻種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種技術(shù)，其特征在于所述的C4植物可以是玉米，所述的產(chǎn)量高、株型好的母本水稻可以是我國優(yōu)良水稻品種9516。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種技術(shù)，其特征在于所述的對第四代全部種子進(jìn)行定向篩選可以采用以PEPC活性為基因表達(dá)酶量的鑒定方法，并結(jié)合酶表達(dá)量的鑒定方法-Westerblot印跡法，選擇出比原種水稻PEPC酶活性高20倍株系，選擇分蘗性好，大穗大粒的植株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種技術(shù)，其特征在于所述的花藥培養(yǎng)，是將雜交后的水稻種質(zhì)，選擇穩(wěn)定高光合效率水稻種質(zhì)中處于單核期的水稻穗，接種在M8為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，待愈傷組織長到3mm左右時，轉(zhuǎn)到MS為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基上分化成苗，將獲得花培苗種植后，去掉單倍體和多倍體，保留二倍體，收獲后獲得具有C4植物PEPC基因穩(wěn)定表達(dá)的水稻種質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)入C
文檔編號A01H1/02GK1353925SQ0113801
公開日2002年6月19日 申請日期2001年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者焦德茂, 高東迎, 李霞 申請人:焦德茂, 高東迎, 李霞